Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

O objetivo geral deste procedimento é repovoar andaimes de matriz extracelular renal de roedores tridimensionais acelulares com células epiteliais renais humanas. Isso é feito primeiro descelularizando, um rim de rato haw com uma série de soluções detergentes perfundidas através da artéria renal durante um período de 26 horas. O rim é então esterilizado e os andaimes de matriz extracelular renal acelular são injetados com 40 milhões de células epiteliais tubulares corticais renais humanas ou RCTE sob perfusão arterial anterógrada contínua dentro de um sistema de reator Biore projetado sob medida.

Em última análise, a capacidade das células RCTE de repovoar o andaime renal pode ser avaliada por ER e ensaio de perfusão e análise imuno-histoquímica. Esta técnica de cultura de células 3D permite que os investigadores repovoem a matriz extracelular de órgãos inteiros. As células de andaime são depositadas no espaço peritubular dentro da matriz extracelular para permitir a investigação e os fatores de ligação que influenciam o crescimento, a diferenciação e a maturação celular.

A principal vantagem dessa técnica sobre métodos alternativos, como a fabricação de andaimes de polímeros sintéticos, é que a matriz extracelular renal facilita a adesão, proliferação e maturação das células perfundidas dentro de uma intrincada rede de proteínas estruturais naturais, fatores de crescimento e outros componentes biológicos. Inicie o procedimento de descelularização conectando o cateter da artéria renal de cada rim descongelado à extremidade do tubo do circuito de perfusão a jusante da bomba, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa no cateter. Se houver bolhas de ar no cateter, use uma micropipeta de 200 microlitros para retirar as bolhas e encher o cateter com fluido.

Suspenda o rim ao longo da parede interna de um copo vazio de cinco litros para que a artéria renal não dobre ou enrole e ajuste o acionamento da bomba para cinco mililitros por minuto. Em seguida, pressione start após confirmar que cada rim está perfundindo, observando o gotejamento de soluções do fundo do órgão mais cada rim com as soluções apropriadas, conforme designado no fluxograma no final da perfusão, armazene os rins descelularizados em PBS em um tubo cônico de 50 mililitros a quatro graus Celsius ou no máximo dois. Depois de montar o circuito de perfusão, removemos a tampa de rosca vermelha na cabeça do biorreator e pipetamos 50 mililitros de uma solução de etanol a 0,1% por ácido acético e 4% no reservatório médio através da abertura.

Usando um cartucho de bomba grande, conecte o segmento da tubulação da bomba peristáltica ao cabeçote da bomba. Em seguida, ajuste a vazão para cinco mililitros por minuto. Pressione start e deixe o circuito escorvar quando o líquido preencher a linha de profusão e atingir a porta aberta restante da torneira de parada de três vias.

Use um plugue de isca macho para conectar a porta. Deixe o circuito escorvar totalmente até que nenhum ar seja observado na tubulação do circuito de perfusão ou no interior da entrada. O aceptor de isca expulsa as bolhas do circuito de perfusão aumentando temporariamente a vazão da bomba.

Quando o sistema estiver totalmente preparado, pare o acionamento da bomba e esterilize uma pinça de seis polegadas. Para conectar cuidadosamente a extremidade de isca fêmea do cateter de artéria renal na entrada macho, atraia o aceptor na superfície interna da cabeça do biorreator, certificando-se de que a conexão esteja firme e que nenhum ar seja deixado no cateter. Deixe o rim pendurar suavemente no cateter da artéria renal para que a artéria renal não torça ou dobre.

Em seguida, aperte o grampo metálico que prende a cabeça e o corpo do biorreator juntos para que o reservatório do biorreator fique bem vedado e feche a tampa de rosca. Agora esterilize os rins com uma perfusão em temperatura ambiente da solução de etanol de ácido acético a cinco mililitros por minuto. Após uma hora, pare a bomba e abra a tampa de rosca vermelha.

Usando uma praga estéril, sua pipeta aspira cuidadosamente toda a solução do reservatório do biorreator. Em seguida, pipete 50 mililitros de PBS fresco no reservatório do biorreator. Feche a tampa de rosca e ligue a bomba por três perfusões sequenciais de uma hora à temperatura ambiente a cinco mililitros por minuto.

Após o enxágue final do PBS, aspire a solução salina do reservatório e adicione 50 mililitros de meio ao reservatório com uma tampa de rosca fechada. Transfira o biorreator com o circuito de perfusão conectado para uma incubadora de grande capacidade a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, conecte o circuito de perfusão do biorreator à bomba e perfunda os rins a quatro mililitros por minuto por pelo menos uma hora antes da semeadura.

Para celularizar, os rins coletam um número suficiente de frascos de cultura para a concentração de assento desejada. Em seguida, depois de aspirar o meio de cultura de cada frasco, usar 10 mililitros da enzima dissociante celular apropriada para levantar as células epiteliais tubulares corticais renais do frasco a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, comece a verificar os frascos em um microscópio de contraste facial a cada dois minutos até que o descolamento da dobra seja observado.

Em seguida, depois de tomar uma pequena alíquota de células para contagem, dilua a suspensão celular associada em um volume igual de meio pré-médico e centrifugue as células resus. Suspender o sedimento com um volume adequado de meio de cultura para obter uma concentração final de duas vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro. Transfira dois mililitros da suspensão do assento, uma placa de cultura de 35 milímetros e, em seguida, coloque o volume de dois mililitros em uma seringa estéril de cinco mililitros.

Transfira o biorreator de perfusão para um gabinete de segurança biológica e gire a válvula da torneira de parada para fechar o fluxo para a porta de assento. Remova o deslizamento de isca macho, plugue da torneira de parada e conecte a seringa. Em seguida, transfira rapidamente o circuito de perfusão de volta para a incubadora e use o cartucho de bomba grande para prender o segmento da tubulação da bomba peristáltica à cabeça da bomba para assentar as células.

Feche a porta da válvula da torneira de parada apontando para a bomba e injete lentamente as células no andaime renal. Em seguida, gire a válvula de vedação para fechar o fluxo da seringa e ligue a bomba a 25 mililitros por minuto. Após 15 minutos, abaixe a vazão da bomba para quatro mililitros por minuto, substituindo o meio no dia seguinte e a cada dois dias a partir de então.

Para avaliar a viabilidade e proliferação das células, troque assepticamente o meio de cultura com 10 mililitros de solução de trabalho de zarin por uma perfusão de quatro mililitros por minuto dos andaimes renais após exatamente uma hora, colete a solução de zarin condicionada e parcialmente reduzida e realize mais quatro mililitros por minuto de perfusão. Com 100 mililitros de cultura fresca, os rins médios sequencialmente profundidos com água e soluções detergentes diluídas tornaram-se progressivamente mais transparentes ao longo de um período de 26 horas pela perfusão detergente final, a rede vascular dos rins e, em particular, os vasos interlober são exibidos com destaque no andaime descelularizado. Todo o órgão é limpo de células nativas, deixando para trás a rede de membrana basal intacta dos túbulos glomérulos e ductos coletores e a matriz extracelular dos vasos sanguíneos descelularizados.

Além dos vasos maiores, as membranas basais microvasculares dentro dos glomérulos também mantêm sua integridade estrutural. As células RCTE semeadas no andaime renal, como acabamos de demonstrar, abrigam principalmente as regiões corticais do andaime renal, onde repovoam preferencialmente os túbulos glomerulares pereg. Poucas células se incorporam aos glomérulos no primeiro dia após a semeadura e, no sétimo dia, os glomérulos são virtualmente desprovidos de células, enquanto a maioria dessas células ocupa as regiões corticais da matriz extracelular renal.

Após sete dias de cultura de perfusão anterógrada, muitos túbulos da linha RCTE estão presentes nos túbulos medulares e papilares externos e patos coletores após o repovoamento de células RCTE e uma semana de cultura de perfusão. No entanto, a transparência observada após a descelularização é perdida e o rim ized parece opaco e mais próximo em aparência de seu estado nativo. Após este procedimento, outros métodos como análise imunoquímica de meios de cultura condicionados podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: como os estados metabólicos ou fenotípicos dessas células mudam dentro da matriz extracelular renal?

A capacidade de desenvolver andaimes extracelulares e adicionar de volta as vendas de doadores à matriz permite que os pesquisadores delineiem o crescimento e a maturação em três dimensões dentro dos andaimes da matriz exo renal natural. O objetivo final é usar essa tecnologia como uma ferramenta para entender melhor os mecanismos de reparo e regeneração renal.