Name: Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda um método minimamente invasivo de coleta de sangue em zebrafish adultos que permite amostragens repetidas do mesmo indivíduo. Esta técnica facilita análises bioquímicas, incluindo metabolismo da glicose, em pesquisas com Danio rerio.

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Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 e 25590073. Gostaríamos de agradecer à Sra. Yui Namie pela ilustração desenhada à mão, e ao Sr. Koshi Kataoka e à Sra. Sayuri Ichikawa pela assistência na manutenção do peixe-zebra.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Mie o, e foram realizados de acordo com a regulamentação bem-estar animal japonês &#39;Ato de Bem-Estar e Gestão de Animais&#39; (Ministério do Meio Ambiente do Japão) e tenha cumprido as normas internacionais. 1. Preparação da agulha NOTA: Todos os experimentos foram realizados sob anestesia, e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Para a eutanásia, os peixes foram imersos num banho de gelo-água (5 partes de gelo / 1 parte de água em ≤4 ° C) durante ≥20 min. <ol><li> Prepare as agulhas microcapilares vidro puxando um capilar de vidro de 1.0 mm de diâmetro exterior, com um puxador de agulha (Figura 1A). </li><li> Corte as pontas das agulhas obliquamente utilizando uma tesoura fina (Figura 1B). O diâmetro da ponta ideal deve ser de aproximadamente 100 - 200 um (Figura 1C). Se o diamete pontar é demasiado estreito, o sangue não vai entrar na agulha. </li><li> Dissolve-se heparina em solução salina a uma concentração de 5 mg / ml. </li><li> Coloque uma agulha pré-cortados no final nosepiece de um conjunto do tubo de aspirador e mantenha o bocal na boca, ou se conectar a agulha para um dispensador de lâmpada. Mergulhe a ponta da agulha para a solução de heparina, e heparinizar a agulha por sucção e soprando através da solução (Figura 1D e 1E). Nota: O conjunto do tubo de aspirador foi usado para a criopreservação de esperma de peixe-zebra 16. Tubo de borracha longa pode parar qualquer sangue voando na boca. A definição de um filtro no meio do caminho do tubo pode evitar os perigos. </li><li> Armazenar as agulhas heparinizados em um prato de Petri de 10 cm e seco ao ar durante pelo menos 1 h. Um grande número de agulhas pode ser preparado antecipadamente. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Preparar a solução de anestésico numa pequena caixa de plástico através da mistura de 200 ml de água de peixe com 100 ul de 2-fenoxietanol (2-PE). A concentração final dos anestésicos é de 500 ppm. CUIDADO! 2-PE tem um efeito rápido. </li><li> Remover número desejado de peixe (estirpe AB) a partir do sistema de circulação. </li><li> Use uma rede para transferir o peixe para os anestésicos para 1-2 min (Figura 1F). Observar os peixes nadar gradualmente, espalhar as barbatanas peitorais horizontalmente, suspiro, e tem movimentos rápidos opérculo dentro de 1 min. </li><li> À medida que o tempo passa, observar o peixe estava deitado no fundo do caso e finalmente parar de nadar. O plano cirúrgico de anestesia chegará quando o peixe pára para respirar e os movimentos são lentos opérculo. Neste ponto, o peixe está pronto para a coleta de sangue. </li><li> Usando uma escumadeira levantar o peixe anestesiados a partir do 2-PE e suavemente coloque-o sobre uma toalha de papel embebido com os anestésicos (Figura 1G). Cubra a cabeça do peixe com papel de tecido macio também embebido com solução de 2-PE para prevenir o ressecamento dos olhos e usar outro papel de tecido macio e seco para gentilmentesecar a superfície do corpo. </li></ol> 3. Recolha de Sangue <ol><li> Coloque uma agulha heparinizado no final nosepiece do conjunto do tubo de aspiração (ou o bulbo dispensador) e segure a extremidade do bocal do conjunto do tubo de aspiração na boca. </li><li> Segure a extremidade nosepiece ea agulha juntos, e retire cuidadosamente as escalas que interferem com a ponta da agulha. Inserir a agulha em um 30 - ângulo de 45 ° para o local de coleta de sangue. Evitar a perfuração do tracto gastrointestinal (Figura 1H). Em caso de utilização de bulbo dispenser, pressione a lâmpada com o polegar eo dedo médio, e bloquear o buraco na ponta do bulbo com primeiro dedo, em seguida, inserir a agulha conforme descrito acima. Nota: O local para a recolha de sangue é ao longo do eixo do corpo e do posterior para o ânus na região da aorta dorsal. A aorta dorsal (DA) e a veia cardinal posterior (PCV) são apenas ventral para a coluna vertebral (Figura 2). </li><li> Começar a sugar obocal extremidade do conjunto do tubo de aspiração, quando a agulha é sentida tocar na coluna vertebral. Se o sangue não subir, mova a ponta da agulha sutilmente com a mão para estimular o fluxo sanguíneo. Note que quando o sangue está a aumentar na agulha, pare imediatamente a tremer e sugar delicadamente (Figura 1I). Em caso de utilização de bulbo dispensador, libertar a pressão do bolbo para aspirar o sangue. </li><li> Observar o sangue irá subir lentamente para dentro da agulha de uma maneira pulsátil, sem aspiração, o qual é provável, porque a pressão do sangue arterial. Assim, não é necessário para sugar se a agulha penetra correctamente a artéria. </li><li> Pare sucção depois o volume adequado de sangue é recolhido. Retire a agulha do peixe e pressione o local da punção usando lenço de papel macio para evitar qualquer sangramento. Observe a parada do sangramento após cerca de 10-20 segundos de pressão do dedo (Figura 1J). </li><li> Após o sangramento é interrompido, transferir imediatamente o peixe de volta a um cleum em água quente (~ 28 ° C) do tanque. Ajude o peixe para recuperar suavemente por água de roda para as brânquias até que ele começa a nadar. Nota: Mantenha-se 5 postsampling peixe em um tanque de 2 L e conecte o tanque para o sistema de circulação para oxigenar o peixe. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Manter o peixe com caixa normal e alimentação. </li><li> Expulsar o sangue a partir da agulha para uma área limpa de uma folha de parafilme (Figura 1K). </li><li> Medir glicose no sangue usando qualquer glicosímetro portátil comercial (Figura 1D). Nota: O glucometer usa um eléctrodo de flavina-adenina-dinucleótido-desidrogenase de glucose e exige um volume de amostra de 0,6 ul. <ol><li> Insira uma tira de teste completamente no medidor e directamente tocar a gota de sangue. Observe a coleta de sangue na tira de teste automaticamente e obter a glicose no sangue resultado 5 segundos na área de exibição. Anote o resultado e descartar a tira de teste. Use umnova tira de teste para cada medição. </li></ol></li><li> (passo facultativo) Leve quantidades precisas de sangue por uma pipetagem e transferir o sangue para um tubo de microcentrífuga para análises posteriores (hemoglobina, triacilglicerol (TG), colesterol total, etc.). Se necessário, diluir o sangue total de um peixe com solução salina. Centrifugar as amostras de sangue durante 3 min a 680 xg à temperatura ambiente e recolher o plasma. Transfira o plasma para um novo tubo. Neste ponto, que está pronta para ser utilizada em análises bioquímicas. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado para a obtenção de sangue em série a partir de peixe-zebra adulto. Este método é simples de realizar e usá-lo no laboratório, numa base diária. Este método de coleta de sangue é baseada na inserção de uma agulha capilar de vidro em aorta dorsal do peixe-zebra. Durante este procedimento, é crítico para ter o cuidado de não fazer a ablação da coluna porque é o critério para a busca de aorta dorsal. Reduzir a lesão da coluna irá melhorar a taxa de sobrevivência. Embora esta técn...

Zebrafish estão ganhando cada vez mais popularidade como um valioso modelo de doenças humanas porque os seus órgãos e genética são semelhantes aos dos seres humanos 1,2. No campo da biologia do desenvolvimento, muitos estudos têm demonstrado que o peixe-zebra e mostrar humana marcada semelhança na hematopoiese 3, hemostasia 4,5, e 6 myelopoiesis. Peixe-zebra adulto também são usados ​​para o estudo imunológico 7, 8 e neurodegenerativa doenças relacionadas à obesidade 9 porque este ações organismo modelo vias comuns com aqueles interrompido em doenças humanas. Para obesidade e doenças relacionadas à obesidade (diabetes, esteatose hepática não alcoólica e e esteatohepatite aterosclerose), glicemia peixe-zebra e níveis de lipídeos, foram exaustivamente investigados em vários modelos de obesidade transgênicos e induzida por dieta 10-13. Coleta de sangue repetidas de animais individuais irá reduzir o uso de animais e dezembroRease diferenças interindividuais. No entanto, a recolha repetida de amostra é tecnicamente difícil em pequenos animais, tais como peixe-zebra por causa do seu volume de sangue relativamente pequena e a falta de vasos facilmente acessíveis. Vários métodos para a recolha de sangue de uma só vez a partir de peixes-zebra foram desenvolvidos, embora estes métodos têm os seus próprios inconvenientes, incluindo a letalidade, danos nos tecidos associados e volume de sangue limitado. Por exemplo, 1-5 mL de sangue pode ser colhido a partir de uma incisão lateral de aproximadamente 0,3 cm de comprimento na região da aorta dorsal 5. Decapitação com uma tesoura de cortar o cinto peitoral pode coletar 5-10 ul sangue 10. Outro método de amostragem de sangue conveniente é a ablação da cauda 14. Punção cardíaca é um potencial método alternativo para a coleta de sangue repetidas do mesmo peixe, mas a quantidade muito pequena obtida (aproximadamente 50 nl) com este procedimento limita o número de análises que podem ser performed 11. Por conseguinte, um novo protocolo é necessário para permitir a recolha de amostras de sangue não letal repetida, o que seria um avanço crítico necessário para este organismo ser um organismo modelo padrão para doenças humanas. Esta técnica permitiria testar resposta farmacológica, a descoberta de biomarcadores moleculares para o diagnóstico, determinação do prognóstico e do acompanhamento de várias doenças, tais como doenças metabólicas, doenças degenerativas e vários tipos de doenças malignas. Assim, desenvolvemos um método minimamente invasivo para a obtenção de sangue de peixe-zebra em série 15. Aqui demonstramos o procedimento visualmente e fornecer um protocolo detalhado para esta técnica. Usando este método, foram avaliados o valor normal com base em vários parâmetros, incluindo a hemoglobina, glicemia de jejum, e lipídios no sangue de peixe-zebra adultos saudáveis. Além disso, também avaliamos se esse método é apropriado para estudos que exigem amostras de série por mONITORIZAÇÃO as mudanças temporais nos níveis de glicose no sangue durante as experiências superalimentação.

<table><tbody><tr><td>Capilares de vidro com filamento</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td> de <td>1,0 mm de diâmetro externo.</td></tr><tr><td>Extrator de agulhas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Para produzir as agulhas</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>081-00136</td><td>Para heparinização</td></tr><tr><td>Conjunto de tubos aspiradores</td><td>Drummond</td><td>2-040-000</td><td>Para coleta de sangue</td></tr><tr><td>Dispensador de lâmpadas</td><td>Drummond</td><td>1-000-9000</td><td>Para coleta de sangue</td></tr><tr><td>2-fenoxietanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-12075</td><td>Para anestesiar os peixes</td></tr><tr><td>DRI-CHEM3500V</td><td>Fujifilm-Para</td><td></td> <td>medição de hemoglobina</td></tr><tr><td>DRI-CHEM Slides</td><td>Fujifilm</td><td>Hb-WII</td><td>Para medição de hemoglobina</td></tr><tr><td>Glutest Neo Super</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho-Para</td> medição <td>de</td> <td>glicose bood</td></tr><tr><td>Wako L-tipo TG kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>464-44201</td><td>Para TG medição</td></tr><tr><td>Wako L-tipo CHO kit Wako</td><td>Pure Chemical Industries</td><td>460-44301</td><td>Para medição do colesterol total</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan Packaging</td><td>PM996</td><td>Para expelir o sangue em</td></tr></tbody></table>

colheita de sangue para testes repetidos de sangue em zebrafish adulto

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Recolha de sangue é repetida uma das técnicas mais comuns realizados em animais de laboratório. No entanto, um protocolo não-letal para a recolha de sangue do peixe-zebra não foi estabelecida. Os métodos anteriores para a recolha de sangue a partir de peixe-zebra são letais, tais como incisão lateral, decapitação e ablação cauda. Assim, temos desenvolvido um novo método de recolha de sangue &quot;repetida&quot;, e aqui presente um protocolo detalhado descrevendo esse procedimento. Este método é minimamente invasivo e resulta em uma taxa de mortalidade muito baixo (2,3%) para peixe-zebra, permitindo, assim, a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. O volume máximo de recolha de amostras de sangue é dependente do peso do corpo do peixe. O volume de sangue para a amostragem repetida em intervalos deve ser ≤0.4% de peso corporal por semana ou ≤1% a cada 2 semanas, que foram avaliadas por medições de hemoglobina no sangue. Além disso, a hemoglobina, glicemia de jejum, triglicerídeos plasma (TG) e total cníveis holesterol em peixe-zebra adulto masculino e feminino foram medidos. Nós também aplicaram esse método para investigar a desregulação do metabolismo da glicose na obesidade induzida por dieta. Este método de coleta de sangue permitirá que muitas aplicações, incluindo glicose e metabolismo lipídico e estudos hematológicos, o que aumentará o uso de peixe-zebra como um modelo de doença organismo humano.

Este método de coleta de sangue causa lesão mínima de peixe-zebra (a &lt;1mm punção; Figura 1J) e produz uma taxa de mortalidade muito baixa de 2,3%. Foi examinado o volume máximo de sangue que pode ser recolhido a partir de um único peixe e avaliada a relação com o seu peso corporal (Figura 3). Descobrimos que o volume de sangue coletado máximo foi linearmente correlacionado com o peso corporal (R = 0,813). O maior volume de sangue coletado de um peixe indivíduo (peso corporal = 1.071 ...

A amostragem de sangue repetida é necessária e importante na pesquisa com animais. Desenvolvemos um método novo, não letal e confiável para coleta repetida de sangue de peixe-zebra adulto e aplicamos esse método ao estudo da bioquímica do sangue, incluindo o metabolismo da glicose.

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma coleta de amostra sanguínea minimamente invasiva em um peixe-zebra adulto, permitindo coletas repetidas do mesmo indivíduo. Isso é realizado primeiramente puxando e cortando as pontas de agulhas capilares de vidro. Na segunda etapa, as agulhas são heparinizadas e secas ao ar.Uma agulha é então inserida no local de coleta de sangue e o sangue é aspirado até a ponta da agulha. Na etapa final, o sangue é expelido da agulha para o recipiente apropriado para análise subsequente. Por fim, os níveis de glicose das amostras de sangue podem ser medidos usando um glicosímetro portátil.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ablação da cauda ou punção cardíaca, é que este método de coleta de sangue é minimamente invasivo e permite coletas repetidas do mesmo indivíduo de peixe-zebra. Este método facilita a obtenção de uma avaliação rápida e precisa de marcadores no sangue do peixe-zebra, fornecendo informações sobre distúrbios metabólicos e outros parâmetros sanguíneos, tais como farmacocinética e níveis sanguíneos de fármacos específicos. Para o tratamento de interesse, para preparar as agulhas de microcapilar

repeated-blood-collection-for-blood-tests-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Este artigo apresenta uma técnica de coleta de sangue da aorta dorsal do peixe zebra. Ele também fornece instruções para a obtenção de soro para uso em análises bioquímicas, tais como testes para determinação dos níveis de colesterol e triglicérides.

Coleta de sangue para análise bioquímica em Zebrafish Adulto

O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.

Gavaging Zebrafish Adulto

O uso de peixe-zebra para pesquisas cardiovasculares está se expandindo para pesquisas em corações adultos. Para essas aplicações, o isolamento rápido e simples dos tecidos cardíacos é fundamental para evitar alterações post-mortem e obter um número adequado de amostras. Aqui, descrevemos um método rápido e reprodutível para dissecar corações de peixe-zebra adultos.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Aqui, vamos discutir um protocolo do método que permite uma análise fácil da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida em configurações de longo prazo patologias vasculares relacionadas a neoangiogênese e mudanças estruturais.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Aqui, apresentamos um método confiável, minimamente invasivo e econômico para registrar e interpretar eletrocardiogramas em zebrafish adulto anestesiado ao vivo.

Eletrocardiografia de superfície vivo para zebrafish adulto

Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.

Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Aprenda um método minimamente invasivo de coleta de sangue em zebrafish adultos que permite amostragens repetidas do mesmo indivíduo. Esta técnica facilita análises bioquímicas, incluindo metabolismo da glicose, em pesquisas com Danio rerio.

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

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