Name: Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a gerar culturas organotípicas de pele geneticamente modificadas usando derme humana desvitalizada e queratinócitos epidérmicos. Este método permite estudar o impacto da expressão gênica alterada no crescimento e diferenciação da pele humana.

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Este trabalho foi supportedby Sociedade Americana de Câncer Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) eo Prêmio Biologia CIRM Básico (RB4-05779).

O protocolo de pele humana foi realizada em conformidade com as diretrizes da Universidade da Califórnia, o Comitê de Ética em Pesquisa do San Diego. A pele humana pode ser obtido a partir de amostras cirúrgicas descartados ou comprados a partir de bancos de pele (pele banco está listado na Tabela de Materiais / Equipamentos). A localização, onde a pele é derivado a partir de ou a idade do dador não é crítica para a experiência, enquanto as proteínas da membrana basal (zona de colagénio / laminina) na derme não são degradados. 1. Preparação de desvitalizados derme humana <ol><li> Ao receber a pele humana, colocar o tecido no capuz de cultura de tecidos de descongelar (~ 3-5 min). Dependendo do tamanho da pele, colocar o tecido descongelado num descartável tubo de 50 ml estéril ou frasco de 125 ml. O tamanho típico da pele a partir do banco de pele é de 0,75 pés quadrados. </li><li> Encha o depósito de 75% completo com penicilina e estreptomicina 4x (pen / strep) em 1x PBS. Agite vigorosamente durante5 min e descarte do líquido. Repita este passo mais 3 vezes. </li><li> Após a última lavagem, transferir o tecido para um novo tubo / frasco e adicionar 4x fresco Pen / Strep / PBS para encher 75% do recipiente. Incubar esta mistura numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante 2 semanas para permitir a separação da derme da epiderme. </li><li> Sob condições estéreis, utilizar uma pinça para descascar a epiderme da derme. A derme é completamente branco enquanto a epiderme terá coloração, dependendo da raça do doador (Figura 1A). Descarte a epiderme acordo com o protocolo da instituição para lidar com o tecido humano. </li><li> Coloque a derme em um tubo ou garrafa e lavá-lo em 4x pen / strep diluído em 1x PBS com agitação forte (5 mínimo de lavagens por 4 vezes). Após a última lavagem, transferir a derme para um novo tubo / frasco em 4x pen / strep diluído em 1x PBS e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso. Derme pode ser armazenado a 4 ° C durante até um ano. </li></ol&gt; 2. modificar geneticamente Primária queratinócitos humanos NOTA: Use pilhas phoenix anfotrï¿½icas cultivadas em meio DMEM completo [DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS) + pen / strep] para produzir o vírus para infectar queratinócitos humanos primários. Genes de empacotamento virais que codificam proteínas tais como gag-pol e do envelope são integrados de forma estável no genoma da célula Phoenix que permite a produção de vírus quando transfectada com um vector retroviral. Phoenix células podem ser transfectadas com alta eficiência, permitindo a produção em alta título viral. Vírus produzido a partir desta linha de embalagem também pode infectar uma grande variedade de células de mamíferos incluindo o ser humano. <ol><li> Dia 1: No dia antes da transfecção, as células Phoenix semente em uma placa de 6 poços a uma densidade de 800.000 células por poço em meio DMEM completo. </li><li> Dia 2: O dia da transfecção, 3 ug de utilizar vectores retrovirais por poço. Aliquota de 3 ug de vector retroviral para um tubo de 1,5 ml. Use uma mistura de 100 μ; l DMEM mais 6 ul de reagente de transfecção para cada 3 ug de vector. Misturar 6 ul de reagente de transfecção com 100 ul de DMEM em um tubo de 1,5 ml. (Os vectores retrovirais que são usados ​​estão indicados na tabela do equipamento / materiais). <ol><li> Incubar durante 5 min e adicionar 106 uL da mistura para dentro do tubo de pré-alíquota contendo a 3 ug de vector retroviral. Misturar e incubar à TA durante 30 min. Adicionar gota a gota toda esta mistura a cada poço das células Phoenix. </li></ol></li><li> Dia 3: O dia após a transfecção, remova a mídia a partir das células phoenix e adicionar 2 ml de meio DMEM completo fresco. No mesmo dia, semear queratinócitos humanos primários em placas de 6 poços a uma densidade de 75.000 células por poço. Manter os queratinócitos em um meio de soro livre de queratinócitos (KCSFM) com antibióticos (pen / strep). NOTA: queratinócitos humanos primários foram comprados. As células podem ser adquiridos a partir de uma variedade de fornecedores (listada na tabela de material / Equipamento). </li><li> Dia 4: Harcolete a mídia a partir das células transfectadas phoenix, que agora contém partículas virais. Passe a mídia através de um filtro de 0,45 um, utilizando uma seringa (para remover quaisquer células phoenix contaminantes) e coloque 2 ml para os queratinócitos (banhados em 75.000 células / poço no dia anterior: ver passo 2.3). Adiciona-se brometo de hexadimetrina (5 ug / ml) para os meios para ajudar a mediar o processo de infecção. Títulos virais são de 1 x 10 ~ 7 TU / mL. <ol><li> Rodar as placas de 6 poços numa centrífuga a 200 xg durante 1 h à TA. Após a rotação, remova a mídia que contém vírus e lavar as células uma vez com 1x PBS antes de adicionar KCSFM. </li></ol></li><li> Dia 5: infectar o mesmo lote de queratinócitos de novo como no passo 2.4. NOTA: Escolha os queratinócitos usando um fármaco se houver um marcador seleccionável no vector retroviral e expandir para uso em análise ou aplicações, tais como as culturas organotípicas de jusante. </li></ol> 3. Configurando culturas de pele organotï¿½icas <ol><li> Construir ocassete organotípico a partir de materiais comuns encontrados no laboratório ou as cassetes podem ser feitos através de uma oficina de fabricação de metal (Figura 2A - F). Para fazer com que essas cassetes de 3,5 cm de uma placa de cultura de tecido, utilizar um cautério para remover um 1,0 cm x 1,0 cm quadrados do centro da tampa de uma 3,5 cm de prato (Figura 2A-B). Faça isso em condições estéreis. <ol><li> Anexar pinos quadrados para a parte inferior da cassete (tampa de 3,5 cm de placa) utilizando claro unha polonês (Figura 2C). Permitir 5 min para a unha polonês para secar e virar a cassete de forma que ele está descansando sobre os pinos quadrados (Figura 2D). Coloque a cassete em um disco de 6 cm. NOTA: Praça estacas podem ser comprados a partir de uma variedade de lojas de artesanato. </li></ol></li><li> Preparar o meio de crescimento de queratinócitos (KGM) composta de 66% de DMEM, 22% de F12 de Ham, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 10% de FBS, 2,67 ug / ml de adenina, 40 Ng / ml de hidrocortisona, 10 ng de toxina da cólera ml /, 4,94 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 1,36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml de EGF, e 10 ug / ml de cloridrato de ciprofloxacina. Filtra-se a meios de comunicação através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C até estar pronto para usar. </li><li> Aqui a derme para fora da 4x Pen / Strep + solução de PBS e lavar 2 vezes em KGM e em seguida incuba-se a 37 KGM ° C durante dois dias antes da utilização. </li><li> Corte a derme utilizando um bisturi para 1,5 cm x 1,5 cm pedaços de tamanho e, em seguida, coloque-a cassete organotípico. Coloque a derme com a parte superior da derme virados para cima. A parte superior da derme será o lado que entra em contacto com os queratinócitos (Figura 1B). </li><li> Coloque a derme pré-cortadas para o furo quadrado da cassete organotípicas com o lado superior da derme voltadas para cima (Figura 3A). </li><li> Virar toda a cassete organotípico contendo a derme mais usando uma pinça (Figura 3B). Descongelar a solução de matriz extracelular em gelo. Use uma agulha e seringa para tirar 100 ml de solução de matriz extracelular por cassete. Adicione 5 gotas para o fundo da derme (lado brilhante) e agitar ligeiramente para assegurar uma distribuição uniforme da derme (Figura 3B). </li><li> Permitir 5 min para a solução comercial de matriz extra-celular para solidificar completamente (Figura 3C). Após a solidificação, utilize uma pinça para rodar a fita para trás sobre. Adicionar 4 ml de KGM com o disco de 6 cm. </li><li> Coloque 0,5-1 milhões de queratinócitos geneticamente modificados para as cassetes organotï¿½icas contendo a derme (Figura 3D). <ol><li> Tripsinizar queratinócitos por colocar 4 ml de tripsina a 0,05% em placas de 10 cm durante 5 minutos e diluiu-se com 4 ml de meio DMEM completo. </li><li> Contagem dos queratinócitos utilizando um hemocitómetro e, em seguida girar a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células 0,5-1 milhões (dependendo do número de células disponíveis) em 90 μl de KGM e colocar todas as células para a derme. NOTA: É importante colocar o mesmo número de células na derme dentro da mesma experiência para assegurar que quaisquer diferenças observadas na espessura da epiderme regenerada não é devido a diferenças no número de células de partida. Colocando menos de 0,5 milhões de células em derme pode levar a uma má estratificação e diferenciação. </li></ol></li><li> Mudar meios KGM sobre as culturas organotípicas de todos os outros dias. Tecido colheita 1-14 dias após a colocação dos queratinócitos na derme. Estratificação completa e diferenciação da epiderme geralmente ocorre após o dia 5. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

A manipulação genética na pele humana culturas organotípicas oferecem muitas vantagens para comumente estudada 2D células cultivadas, bem como modelos de mouse. Culturas 2D faltam os três célula-célula e célula-matriz extracelular interacções dimensionais encontradas em tecidos e órgãos intactos. Estudos recentes também têm encontrado enormes diferenças entre as células de câncer de pele cultivadas em 2D e 3D com as células cultivadas em 3D que mostram muito mais semelhanças de expressão do gene para a pele humana tumor...

A epiderme humana é um epitélio estratificado que se conecta à derme subjacente através de uma matriz extracelular conhecida como a epiderme zone.The membrana basal não somente serve como uma barreira impermeável para impedir a perda de humidade, mas também como uma primeira linha de defesa para proteger o corpo de substâncias estranhas e tóxicas 1. A camada basal, que é a camada mais profunda da epiderme, contém as células estaminais e progenitoras da epiderme que dão origem a progenia diferenciada para que formam o resto da epiderme 2. Como as células progenitoras diferenciam epidérmicas que migram para cima para formar a primeira camada de células diferenciadas conhecidos como a camada espinhosa 3. Na camada espinhosa, as células ligar a expressão de queratinas 1 e 10, que, em seguida, fornecer a força necessária para suportar o esforço físico para as camadas diferenciadas da epiderme. À medida que as células da camada espinhosa diferenciar ainda mais, que se movem para cima na epiderme para am a camada granular, que é caracterizada pela formação de querato-hialina e grânulos lamelares, bem como proteínas estruturais que são montados por baixo da membrana de plasma. Como as células em prosseguir o processo de diferenciação, as proteínas abaixo da membrana plasmática estão transversal ligados uns aos outros, enquanto os grânulos lamelares são extrudadas a partir das células de modo a formar uma barreira de lípidos ricos chamada estrato córneo 4. As doenças que envolvem alterações no crescimento epidérmico e impacto diferenciação ~ 20% da população 5. Assim, o entendimento dos mecanismos deste processo é de grande importância. Desde manifestação de muitas destas doenças é contingente após a célula-célula ou célula-matriz de contacto, as culturas organotípicas de onde a epiderme humana é reconstituída num ambiente 3D foram criadas 6-10. Estes métodos envolvem tipicamente a utilização de queratinócitos primários ou transformadas semeadas em matriz extracelular, tais como humano desvitalizadoderme, Matrigel, ou colagénio. Para compreender os mecanismos regulatórios dos genes que são importantes no crescimento e na diferenciação da epiderme, os queratinócitos podem ser geneticamente manipulados através de vectores retrovirais para knockdown ou sobre-expressar genes em cultura e em seguida reconstituída 2D em 3D. Estes métodos têm sido amplamente utilizados para caracterizar genes envolvidos na haste epidérmica de células progenitoras e de auto-renovação e diferenciação, bem como a progressão para neoplasia 11-21. Aqui, um protocolo em profundidade sobre como alterar a expressão genética em culturas organotípicas epidérmicas através da utilização de retrovírus é fornecido.

<table><tbody><tr><td>Pele humana</td><td>Banco de pele de bombeiros de Nova York</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>linhas celulares anfotrópicas fênix</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfecção reagente</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Meios de queratinócitos (KCSFM)</td> <td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Presunto F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cólera</td><td>Toxina Sigma</td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td>Sigma I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Ciprofloxacina</td><td>Sorológicos</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautério</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Queratina 1 anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>pinos quadrados Lojas de</td><td>artes e ofícios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humano queratinócitos neonatais</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>queratinócitos neonatais humanos</td><td>Aplicações celulares</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV vetor retroviral</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS vetor retroviral</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Vetor retroviral</td><td>Oligomotor</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>brometo de hexadimerina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de culturas geneticamente modificados pele organotï¿½icas usando desvitalizado derme humana

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Culturas organotípicas permitir a reconstituição de um ambiente 3D crítica para interacções de contacto célula-célula e célula-matriz que imita a fisiologia e função dos seus homólogos de tecido in vivo. Isto é exemplificado por culturas de pele organotï¿½icas que recapitula fielmente a diferenciação epidérmica e programa de estratificação. Queratinócitos epidérmicos humanos primários são geneticamente manipuláveis ​​através de retrovírus onde os genes podem ser facilmente sobre-expressos ou derrubado. Estes queratinócitos geneticamente modificados podem então ser usadas para regenerar epiderme humana em culturas organotípicas de pele proporcionando um poderoso modelo para estudar vias genéticas crescimento epidérmico de impacto, a diferenciação e a progressão da doença. Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para preparar derme humana desvitalizados, bem como manipular geneticamente queratinócitos humanos primários, a fim de gerar culturas organotípicas de pele. Pele humana regenerado pode ser usado em downstream aplicações, tais como perfil de expressão gênica, immunostaining, e imunoprecipitações cromatina seguido de seqüenciamento de alta taxa de transferência. Assim, a geração destas culturas organotípicas de pele geneticamente modificados permite a determinação dos genes que são essenciais para a manutenção da homeostase da pele.

O primeiro passo na geração de pele humana organotípica é remover a epiderme da derme. A incubação de duas semana da pele a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS deve permitir a separação da derme da epiderme (Figura 1A). Se a separação da epiderme e da derme, em seguida, é difícil colocar o tecido a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS durante uma semana e, em seguida, tente novamente casca utilizando fórceps. Uma das chaves para a regeneração da epiderme humana na derme desvitalizados ...

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas de pele organotípicas geneticamente modificadas utilizando derme humana revitalizada para determinar o impacto da expressão gênica alterada sobre o crescimento e a diferenciação epidérmicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de dermatologia, como identificar quais genes são responsáveis pelo crescimento, diferenciação e progressão para doenças epidérmicas. A principal vantagem desta técnica é que a pele humana geneticamente alterada é gerada em poucos dias, o que permite o estudo de amostras humanas com potencial relevância clínica.Quem demonstrará o procedimento será Jingly do meu laboratório. Se receber pele humana congelada, coloque o tecido na cabine de cultura celular por três a cinco minutos para descongelar. Após o descongelamento, transfira o tecido para um tubo cônico estéril de 50 mililitros ou uma garrafa de 125 mililitros, conforme o tamanho.Em seguida, adicione quatro x penicilina e estreptomicina em um XPBS até que o recipiente esteja 75% cheio. Tampe o recipiente e agite vigorosamente por cinco minutos. Remova a solução antibiótica e repita este procedimento.Repita o passo mais três vezes após a última lavagem, transfira o tecido para um novo recipiente e adicione solução antibiótica fresca. Incube esta mistura em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por duas semanas para permitir a separação da derme da epiderme. Após decorridas duas semanas, use pinça para remover a epiderme da derme.Descarte a epiderme de acordo com o protocolo da instituição para o manuseio de tecido humano. Coloque a derme em um recipiente com solução antibiótica e lave com agitação vigorosa, como antes. Após a última lavagem, transfira a derme para um novo recipiente com solução antibiótica e armazene a quatro graus Celsius até o momento de utilização. No dia anterior à transfeção, semeie células phoenix em meio completo em uma placa de seis poços com densidade de 800.000 células por poço.No dia da transfeção, misture seis microlitros do reagente de transfeção com 100 microlitros de dmm. Para cada poço a ser transfectado, incubar à temperatura ambiente por cinco minutos, adicione a mistura a um tubo contendo três microgramas do vetor retroviral para cada poço a ser transfectado e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione toda esta mistura gota a gota a cada poço das células phoenix e incubar as células durante a noite. No dia seguinte à transfeção, remova o meio das células phoenix e adicione dois mililitros de meio completo fresco no mesmo dia.Resuspenda queratinócitos humanos primários em meio livre de soro para queratinócitos com antibióticos e plaque em placas de seis poços com uma densidade de 75.000 células por poço. No dia seguinte, colete o meio, que agora contém partículas virais provenientes das células Phoenix transfectadas. Passe o meio através de um filtro de 0,45 mícron utilizando uma seringa para remover quaisquer células contaminantes.Adicione cinco microgramas por mililitro de brometo de hexadimetil ao meio contendo o vírus filtrado para ajudar a mediar o processo de infecção. Em seguida, pipete dois mililitros do vírus sobre os queratinócitos semeados no dia anterior. A seguir, centrifugue as placas de seis poços a 200 Gs durante uma hora à temperatura ambiente.Após a centrifugação, remova e descarte o meio contendo o vírus. Lave as células uma vez com PBS 1× e, no dia seguinte, adicione o meio K-C-S-F-M fresco. Infete o mesmo lote de queratinócitos com o vírus utilizando o procedimento recém-apresentado.Para preparar cassetes organotípicos. Utilize uma pinça de cauterização para remover um quadrado de um centímetro por um centímetro do centro da tampa de uma placa de cultura celular de 3,5 centímetros. Fixe pinos quadrados na parte inferior do cassete usando esmalte incolor e aguarde cinco minutos para que o esmalte seque.Por fim, vire o cassete e coloque-o em uma placa de seis centímetros com o cassete apoiado nos pinos. Retire a derme do armazenamento a quatro graus Celsius e transfira-a para um recipiente com meio de crescimento de queratinócitos para lavagem.Após repetir a lavagem, coloque a derme em KGM fresco e incube a 37 graus Celsius por dois dias. Após a incubação, use um bisturi para cortar a derme em pedaços de 1,5 centímetro por 1,5 centímetro. Em seguida, posicione sobre o orifício quadrado do sistema organotípico, com a face superior da derme voltada para cima.Use uma pin&ccedil;a para virar todo o cassetete organot&iacute;pico contendo a derme. Adicione cinco gotas de matriz extracelular rec&eacute;m-preparada na parte inferior da derme e agite levemente para garantir uma distribui&ccedil;&atilde;o uniforme pela derme. Ap&oacute;s deixar a matriz extracelular solidificar por cinco minutos, use uma pin&ccedil;a para virar novamente o cassetete, e ent&atilde;o adicione quatro mililitros de KGM ao recipiente de seis cent&iacute;metros.Em seguida, após colher e contar os queratinócitos geneticamente modificados, ressuspenda de 0,5 a 1 milhão de células em 90 microlitros de KGM e distribua as células sobre a derme. Incube a co-cultura a 37 graus Celsius. Troque o meio de cultura a cada dois dias.A estratificação e diferenciação completas da epiderme geralmente ocorrem após o quinto dia. O tecido pode ser colhido até 14 dias após o plaqueamento. Esta imagem mostra a coloração com hematoxilina e eosina de um organotípico.Culturas de pele regenerada contêm tanto a epiderme quanto a derme. A epiderme é totalmente estratificada e diferenciada, com quatro camadas distintas, incluindo a camada basal indiferenciada e as três camadas diferenciadas: estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato córneo. Essas imagens de imunofluorescência demonstram que a superexpressão de SNA i dois, conforme mostrado à direita, inibe a diferenciação epidérmica em comparação com o tecido controle mostrado à esquerda, que foi corado para a diferenciação.A queratina proteica um ou K um é mostrada em verde e os núcleos são marcados em azul. A análise de RTQ PCR R para medir os níveis de mRNA de SNAI dois em controle LAC Z e tecido com superexpressão de S NNA I dois demonstra uma expressão superior a 50 vezes maior de SNAI dois em relação ao controle. Finalmente, esta análise de RTQ PCR R demonstra que a superexpressão de SNA I dois resulta na perda de expressão de genes estruturais induzidos pela diferenciação, tais como TGM um e SPRR um A. Após este procedimento.Outros métodos como chipsy, imunofluorescência, RN, ae ou western blot podem ser realizados para determinar os mecanismos de crescimento e diferenciação epidérmicos. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de dermatologia explorarem como a alteração da função gênica afeta a homeostase da pele. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar culturas orgânicas de pele humana geneticamente modificadas utilizando queratinócitos e derme humana desepidermizada.

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar reconstruções organotípicas da pele in vitro em 3D para estudar a progressão do melanoma. Este modelo de pele imita a arquitetura e a complexidade multicelular dos órgãos in vivo.

Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para a produção de retrovírus recombinante de queratinócitos humanos primários geneticamente modificados. Este método pode ser usado para manipular a expressão gênica em queratinócitos.

Modificação Genética de Queratinócitos Humanos Primários: Um Método para Manipular Geneticamente Queratinócitos Usando Retrovírus Recombinantes

Este protocolo de vídeo descreve uma técnica de cultura in vitro baseada em para gerar pele organotípica humana usando queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada. Eles imitam a função e a fisiologia de suas contrapartes de tecido in vivo.

Cultura de pele 3D organotípica: uma técnica de cultura in vitro baseada em para regenerar a epiderme humana na derme acelular

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organotï¿½ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

O objetivo deste protocolo é descrever a geração e a análise volumosa de equivalentes vascularizados da pele humana utilizando técnicas acessíveis e simples para a cultura de longo prazo. Na medida do possível, a lógica das etapas é descrita para permitir aos pesquisadores a capacidade de personalizar com base em suas necessidades de pesquisa.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.

Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

Este protocolo descreve um método para produzir organoides da pele contendo folículos pilosos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido planar e fisiologicamente relevante para replicar a arquitetura e a função da pele.

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

Aprenda a gerar culturas organotípicas de pele geneticamente modificadas usando derme humana desvitalizada e queratinócitos epidérmicos. Este método permite estudar o impacto da expressão gênica alterada no crescimento e diferenciação da pele humana.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

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