Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organot�icas Usando desvitalizado derme humana

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas de pele organotípicas geneticamente modificadas usando derme humana revitalizada para determinar o impacto da expressão gênica alterada no crescimento e diferenciação epidérmica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da dermatologia, como determinar quais genes são responsáveis pelo crescimento epi, diferenciação e progressão para a doença. A principal vantagem desta técnica é que a pele humana geneticamente alterada é gerada em poucos dias, o que permite o estudo de amostras humanas potencialmente clinicamente relevantes.

A demonstração do procedimento será feita em jingly do meu laboratório. Se receber pele humana congelada, coloque o tecido na capa de cultura de tecidos por três a cinco minutos para descongelar. Depois de descongelado, transfira o tecido para um tubo cônico estéril de 50 mililitros ou frasco de 125 mililitros, dependendo do tamanho.

Em seguida, adicione quatro x penicilina e estreptomicina em um XPBS até que o recipiente esteja 75% cheio. Tampe o recipiente e agite vigorosamente por cinco minutos. Remova a solução antibiótica e repita isso.

Passo mais três vezes após a última lavagem, transfira o tecido para um novo recipiente e adicione uma solução antibiótica fresca. Incubar esta mistura em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por duas semanas para permitir a separação da derme da epiderme. Quando duas semanas tiverem decorrido, use uma pinça para descascar a epiderme da derme.

Descartar a epiderme de acordo com o protocolo da instituição para lidar com tecido humano. Coloque a derme em um recipiente com solução antibiótica e lave com agitação vigorosa como antes. Após a última lavagem, transfira a derme para um novo recipiente de solução antibiótica e armazene a quatro graus Celsius até que esteja pronta para uso no dia anterior à transfecção Semeie células de fênix em meio completo em uma placa de seis poços a uma densidade de 800.000 células por poço.

No dia da transfecção, misture seis microlitros de reagente de transfecção com 100 microlitros de dmm. Para cada poço a ser transfectado e incubar à temperatura ambiente Por cinco minutos, adicione a mistura a um tubo contendo três microgramas de vetor retroviral para cada poço a ser transfectado e incube em temperatura ambiente por 30 minutos, adicione toda essa mistura gota a gota a cada poço das células fênix e incube as células durante a noite no dia seguinte à transfecção. Remova a mídia das células da fênix e adicione dois mililitros de mídia completa fresca no mesmo dia.

Ressuspenda os queratinócitos humanos primários em meio livre de soro de queratinócitos com antibióticos e semeie em seis placas de parede a uma densidade de 75.000 células por poço. No dia seguinte, colha o meio que agora contém partículas virais das células Phoenix transfectadas. Passe o meio por um filtro de 0,45 mícron usando uma seringa para remover quaisquer células contaminantes.

Adicione cinco microgramas por mililitro de brometo de hexadimetila ao meio filtrado contendo vírus para ajudar a mediar o processo de infecção. Em seguida, pipete dois mililitros do vírus nos queratinócitos plaqueados no dia anterior. Em seguida, gire as seis placas de parede em uma centrífuga a 200 Gs por uma hora em temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova e descarte a mídia que contém vírus. Lave as células uma vez com um XPBS e, em seguida, adicione K-C-S-F-M fresco no dia seguinte. Infecte o mesmo lote de queratinócitos com vírus usando o procedimento que acabamos de mostrar.

Para fazer organotípicas. Use um cautério para remover um quadrado de um centímetro por um centímetro do centro da tampa de uma placa de cultura de tecidos de 3,5 centímetros. Prenda pinos quadrados na parte inferior do usando esmalte transparente e aguarde cinco minutos para que o esmalte seque.

Por fim, vire o e coloque-o em um prato de seis centímetros com um apoiado nos pinos. Recupere a derme do armazenamento de quatro graus Celsius e transfira-a para um recipiente de crescimento de queratinócitos. Médio para lavar.

Depois de repetir a lavagem, coloque a derme em KGM fresco e incube a 37 graus Celsius por dois dias. Após a incubação, use um bisturi para cortar a derme em pedaços de 1,5 centímetro por 1,5 centímetro. Em seguida, coloque no orifício quadrado do organotípico com a parte superior da derme voltada para cima.

Use uma pinça para virar todo o organotípico que contém a derme. Adicione cinco gotas de matriz extracelular recém-removida na parte inferior da derme e agite levemente para garantir uma distribuição uniforme pela derme. Depois de permitir que a matriz extracelular solidifique por cinco minutos, use uma pinça para virar o de volta e, em seguida, adicione quatro mililitros de KGM ao prato de seis centímetros.

Em seguida, após a colheita e contagem dos queratinócitos geneticamente modificados, o Resus suspende de 0,5 a 1 milhão de células em 90 microlitros de KGM e dispensa as células na derme. Incube a co-cultura a 37 graus Celsius. Mude a mídia sobre as culturas a cada dois dias.

A estratificação e diferenciação completas da epiderme geralmente ocorrem após o quinto dia. O tecido pode ser colhido até 14 dias após o plaqueamento. Esta imagem mostra a coloração de hematina e eosina de organotípicos.

Culturas de pele A pele humana regenerada contém a epiderme e a derme. A epiderme é totalmente estratificada e diferenciada com quatro camadas distintas, incluindo a camada basal indiferenciada e as três camadas diferenciadas, incluindo o estrato, o espinoso, o rano e o córnio. Essas imagens de imunofluorescência demonstram que a superexpressão de SNA i dois, conforme mostrado à direita, inibe a diferenciação epidérmica em comparação com o tecido controle mostrado à esquerda para a diferenciação.

A proteína queratina um ou K um é mostrada em verde e os núcleos são marcados em azul. A análise RTQ PCR R para medir os níveis de mRNA de SNAI dois no controle LAC Z e S NNA I dois superexpressando tecido demonstra expressão superior a 50 vezes de SNAI dois em relação ao controle. Finalmente, esta análise RTQ PCR R demonstra que a superexpressão de SNA I dois resulta em perda de expressão de genes estruturais induzidos por diferenciação, como TGM um e SPRR um A.

Outros métodos como chipsy, imunofluorescência, RN, ae ou western blotting podem ser realizados para determinar os mecanismos de crescimento e diferenciação epidural. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da dermatologia explorarem como a função do gene altera a homeostase da pele. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar culturas de pele humana orgânica geneticamente modificada usando queratinócitos e derme humana desenvolvida.