Name: Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a modificação genética estável de células-tronco neurais do rato adulto usando partículas lentivirais. Este método permite analisar efeitos autônomos e não autônomos no nicho neurogênico ventricular-subventricular.

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Nós reconhecemos a ajuda de MJ Palop eo apoio técnico do SCSIE da Universidad de Valencia. Agradecemos também a Antonia Follenzi pelos comentários e discussão do manuscrito. IF é apoiado pela Fundação Botín, pelo Banco Santander através da sua Divisão Global Santander Universidades, e por doações da Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP e ISIC) e Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED e RETIC Tercel) . Este trabalho também foi apoiada por BFU2010-21823 e RETIC Tercel doações de MINECO e pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) para AC BM-P. é o destinatário de uma bolsa FPI espanhola do MINECO.

<ol><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li>
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<li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li>
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<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
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<li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+go+with+the+flow%21%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
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<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
<li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li>
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<li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li>
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<li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
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<li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier%3A+pathogenic+trickery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li>
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<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
</ol>

Todas as manipulações foram feitas em um quarto de nível de biossegurança 2. protocolos animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Valência e estavam todos em conformidade com a directiva europeia 2010/63 / UE.

LVs oferecer vantagens importantes sobre outros sistemas virais para a modificação genética de adultos NSCs 16,18. entrega estereotáxica de lentivírus para o nicho V-SVZ representa um método eficiente para identificar e rastrear raramente dividindo B1-NSC superar as limitações de outros métodos vulgarmente utilizados tais como BrdU, que se dilui depois de múltiplas divisões celulares, ou retrovírus, que apenas células alvo que estão a proliferar no momento da aplicação. LVS juntamente com adenovírus, pode inf...

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso 1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 2. GFAP-expressando células B1 gerar células (TAP) (células C), que expressam fatores de transcrição Dlx2 trânsito ampliando progenitor (distal-less homeobox 2) e Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) e se dividem rapidamente algumas vezes antes de dar lugar a neuroblastos que migram (células a) ou oligodendroblasts 3. Recém-gerado prolifneuroblasts operatória migrar anteriormente, formando o fluxo migratório rostral (RMS) para o OB, onde eles integrar o granular e camadas glomerular como interneurônios inibitórios diferenciados. A migração de jovens oligodendroblasts passar para o CC, onde eles se tornam células imaturas NG2-positiva que continuam a dividir localmente ou se diferenciar em oligodendrócitos myelinating maduros 1,4. células B1, que derivam de células gliais radiais fetais, retêm a morfologia alongada e polarizada de seus antecessores e exibem uma relação altamente especializada, com o seu nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. O pequeno processo apical das células intercala B1 entre ependimócitos multiciliated e termina em um único cílio primária não-móveis, ao passo que o seu processo basal estende longas distâncias para abordar o plexo vascular planar que irriga este nicho final no blamina asal dos capilares do plexo 2,5-8. A maneira mais confiável para distinguir B1-NSCs a partir de astrócitos não-neurogênicas, que também são GFAP +, no nicho V-SVZ intacto é baseado em preparações com parede lateral do ventrículo e sua análise por microscopia confocal 3-D de toda a montar depois imunocoloração para GFAP para rotular o processo apical fina B1-NSC, β-catenina para delinear as membranas celulares, e ambos os γ-tubulina como um marcador de corpos basais cilial ou acetilado α-tubulina para rotular a extensão de cada cílio 5,8. Observações destas montagens inteiras-a partir da superfície do ventrículo indicaram que as células ependimais e B1 estão dispostas em &quot;&quot; cata-ventos 5, em que os processos apicais uniciliated de um ou vários GFAP + B1 células são cercadas por uma roseta de células ependimais multiciliated. A morfologia característica de células B1 correlaciona-se com a evidência experimental indicating que os vasos sanguíneos / células endoteliais e ventriculares líquido cefalorraquidiano (LCR) constituem fontes reguladas de sinais solúveis que agem em NSCs 2,6,9-11. Na superfície ventricular, homotï¿½ica e interações APICO-lateral heterotípicos envolvendo células ependimárias e B1 incluem junções apertadas e junções aderentes 5,12. Além disso, as moléculas de adesão implicados nos complexos juncionais entre as células B1 e ependimais, tais como N-caderina e V-CAM, têm sido mostrados para regular não só o posicionamento altamente organizada de B1 no nicho V-SVZ, mas também a sua quiescência 12 , 13. A monocamada de células ependimária-B1 parece actuar como uma barreira de difusão, permitindo o fluxo regulado de água e pequenas moléculas a partir do CSF, mas restringindo a passagem de grandes proteínas intercelular 10,11. A evidência experimental indica que o cílio apical de células B1 singularmente posicionada poderia desempenhar um papel como um sensor de sinalização polipeptídeos presentes no CSF 2,5-7. Células ependimais são, por si só, também uma fonte de sinais solúveis e ligadas à membrana, com um papel na regulação do comportamento NSC 14,15. Rastreáveis ​​nucleósidos, tais como bromo-desoxiuridina (BrdU), ou retrovírus têm sido amplamente utilizados para marcar células progenitoras, incluindo as NSC, in vivo. No entanto, estes métodos não são ideais para o rastreio destino a longo prazo em virtude dos sinais de BrdU diluído através de divisões celulares utilizadas e retrovírus parecem ter como alvo, preferencialmente, de forma transiente células, devido à sua exigência de proliferação celular para a transdução 16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiologia in vivo, incluindo interações com componentes de nicho, é fundamental estabelecer um método para rotular e rastrear células raramente se dividem, como B1-NSCs são em grande parte de repouso e as suas células ependimárias vizinhos Nunca dividir em condições fisiológicas 3. Aqui, mostramos que vetores de lentivírus (VEs) permitir a marca de gene de alta eficiênciação e modificação de longo prazo de NSC adultas e células ependimais que não se dividem, devido razoavelmente mais a sua capacidade para transduzir e a integrar-se no genoma das células alvo de um modo independente do ciclo celular. Além disso, mostramos como a rota de entrega e viral título de ajuda para transduzir especificamente células ependimárias, mas não células B1 permitindo assim a análise dos efeitos, ependimárias dependente de nicho no NSC.

<table><tbody><tr><td>Parte 1: Geração de LV para entrega in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga&nbsp;</td>Tubos de Ultracentrífuga <td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td>25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td>Adaptadores de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 10 cm</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td> Tubos FACS <td>estilo 100 x 20</td></tr><tr><td></td><td>Afora</td><td>DE400800</td><td>12 mm x 75 mm, 5 ml</td></tr><tr><td>Filtro FACS estéril de copo</td><td>BD</td><td>340626</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>Filtro de nitrocelulose</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0,22 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Blue laser 488 nm</td></tr><tr><td>Filtro Steritop</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>Reagents:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plasmídeo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>Plasmídeo de embalagem principal</td></tr><tr><td>pRSV.REV plasmídeo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>Plasmídeo de embalagem principal</td></tr><tr><td>pMD2G plasmídeo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Envelope plasmídeo</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmídeo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>Vetor de transferência plasmídeo</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>Para cultura de células HeLa</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>12440-053</td><td>Para cultura de células 293T</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,&nbsp; Livre de DNAse/RNAse, 0,2 &micro; m filtrado estéril</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM de Na2HPO4 (Sigma, S7907) em dH2O (de preferência não MilliQ). Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH (Calbiochem, 567530).</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>Stock, solução a 100x, utilizada para preparar HeLa e meio de cultura 293T na concentração final de 10x.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>Solução-mãe a 200 mM, usada para preparar HeLa e meio de cultura 293T a uma concentração final de 6 mM.</td></tr><tr><td>Tecnologias de piruvato de sódio</td><td>Life technologies</td><td>11360-039</td><td>Solução de estoque a 100 mM, usada para preparar HeLa e meio de cultura 293T a uma concentração final de 1 mM.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Life technologies</td><td>35050-061</td><td>Usado para preparar meio de cultura 293T em uma concentração final de 1%.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td> A solução de estoque <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>contém 5.000 unidades/ml de penicilina e 5 mg/ml de estreptomicina. Usado para preparar HeLa e meio de cultura 293T em uma concentração final de 1%.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Com vermelho de fenol, contém 2,5 g de tripsina suína e 0,2 g de EDTA 4Na/L HBSS.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, 10x, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células. Solução de estoque usada para preparar 1x PBS em água de grau de cultura de células.</td></tr><tr><td>Polibreno (brometo de hexadimetrina)&nbsp;</td><td>Pó Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>. Prepare uma solução estoque de 1.000x a 8 mg / ml em dH<sub2O</td></tr><tr><td>Paraformaldeído EM grau 16%</td> <td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Parte 2: Injeção estereotáxica de LV na SEZ propriamente dita ou no ventrículo lateral.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier instrumento estereotáxico</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr> <tr><td>Cunningham mouse e adaptador de rato neonatal</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para seringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 33 gauge</td><td>Hamilton</td><td>P/N&nbsp; &nbsp; &nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>Furadeira elétrica</td><td>Fine Science Tool</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>Manta térmica</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V, 100-110 W, tipo C_AL01</td></tr><tr><td>Barbeador&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>Modelo: beleza, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.</td></tr><tr><td>Reagents:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>Solução comercial a 1 mg/ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Merial</td><td>Imalgene 500&nbsp;</td><td>Solução comercial a 50 mg/ml</td></tr><tr>Mistura <td></td><td></td> de <td>medetomidina / cetamina</td><td>Prepare uma mistura de trabalho de medetomidina a uma concentração final de 0,2 mg / ml de diluição e cetamina a uma concentração final de 15 mg / ml em solução salina. Use como anestesia injetando um volume para obter uma concentração final de 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal e 50-75 mg de cetamina por kg de peso corporal</td></tr><tr><td>Butorfanol</td><td>Pfizer</td><td>Torbugesic</td><td>Stock solution a 10 mg / ml. Usado como analgesia a 1 mg / ml em solução salina.</td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Esteve</td><td>Antisedan</td><td>Solução de estoque a 5 mg / ml, usada em uma concentração final de 0,5 mg / ml em solução salina para sair da anestesia.</td></tr><tr><td>Solução salina a 0,9%</td><td>Braun</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>Adesivo tópico para a pele</td></tr><tr><td>HydroGel</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>Bleach/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta marcadora cirúrgica</td><td>Staedler</td><td>313-9</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oftálmico permanente lumocolor &nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0,5 g / dose, carbômero 974P</td></tr><tr><td>Iodopovidona</td><td>Betadine</td><td>694109,6</td><td>10% iodopovidona</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Parte 3: Análise histológica.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica automática</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S acionamento econômico de velocidade variável, 1,6-100 rpm, cabeça da bomba de 230 V</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Cabeça de bomba Masterflex L/S Easy-Load para tubulação de precisão; Carcaça PSF, rotor CRS</td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-96410-16</td><td>Platinum L/S 16</td></tr><tr><td>Conjunto de veias do couro cabeludo</td><td>Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 G, comprimento do tubo de 30 cm</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato (PB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) e 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) em dH2O, ajuste o pH para 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>Prepare sempre fresco. Aqueça dH2O até 55&ndash; 60 &deg; C usando uma placa quente colocada em uma hotte e despeje o pó de PFA mexendo para obter uma solução a 8%. A solução é branca turva, pois o PFA não se dissolve facilmente. Adicione 1N NaOH gota a gota apenas até que a solução desapareça. Esfrie, filtre o papel Whatman e adicione um volume equivalente de 0,2 M PB.</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> salina <td>0,9% NaCl em dH2O</td></tr><tr><td>Supercola</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Millipore</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP para coelho</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>Use em uma diluição de 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-21206</td><td>Use em uma diluição de 1:750</td></tr><tr><td>Hidrato de dicloridrato de 6-Diamindino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Coloração nuclear fluorescente. Administrar a 2 mg/ml em ddH2O. Manter no escuro a 4 °C.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>Meio de montagem para preparações fluorescentes</td></tr></tbody></table>

estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto v-svz para a análise da neural stem cell autónoma e efeitos não autónomos

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relativamente células estaminais somáticas quiescentes apoiar a renovação celular ao longo da vida, na maioria dos tecidos adultos. As células estaminais neurais no cérebro de mamíferos adultos está restrita a dois nichos neurogénicos específicos: a zona subgranular do giro dentado no hipocampo e na zona ventricular-subventricular (V-SVZ; também denominada zona subependimal ou SEZ) nas paredes das laterais ventrículos. O desenvolvimento de estratégias de transferência in vivo de genes para as populações de células estaminais adultas (isto é, as do cérebro de mamíferos), resultando em expressão a longo termo de transgenes desejados nas células-tronco e a sua descendência resultante é uma ferramenta importante na investigação biomédica e biotecnológica corrente. Aqui, um método direto in vivo é apresentado para a modificação genética estável de células do rato adulto V-SVZ que se aproveita da infecção independente do ciclo celular por LVs ea citoarquitetura altamente especializada do nicho V-SVZ. Especificamente, o protocolo atual envolvems a injecção do LVS vazio (controlo) ou LVs que codificam as cassetes de expressão de transgenes específica para qualquer um do próprio V-SVZ, para o direccionamento in vivo de todos os tipos de células no nicho, ou para o lúmen do ventrículo lateral, para o direccionamento de ependimária células única. As cassetes de expressão são, em seguida, integrado no genoma das células transduzidas e proteínas fluorescentes, também codificados pelo LVS permitir a detecção das células transduzidas para a análise dos efeitos dependentes do nicho de células autónomos e não autónomos, em células marcadas e os seus progênie.

Sistema de entrega de genes mediada por LV pode ser utilizado para a longo prazo na transdução in vivo de células do ratinho adulto V-SVZ, permitindo que o seu controle e modificação genética durante a proliferação, a migração ea diferenciação. A infecção e a expressão são altamente eficazes e produzem numerosas células que podem ser facilmente distinguidos entre outras células não-infectadas por a expressão do repórter incluídos. Temos, assim, muito visualizado células transduzidas com GFP repórteres fluoresce...

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

O objetivo geral deste procedimento é entregar pequenos volumes de partículas lentivirais com alto título, carregando construtos de DNA específicos, para a zona ventricular-subventricular de camundongos adultos, a fim de infectar todos os seus tipos celulares, ou para os ventrículos laterais, para afetar apenas as células ependimárias. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre as interações que as células-tronco neurais da nicho ventricular-subventricular adulto têm com suas células ependimárias vizinhas. A principal vantagem desta técnica é que os vetores lentivirais se integram ao genoma das células-alvo de maneira independente do ciclo celular, permitindo a diferenciação a longo prazo de células raramente divididas. Ajudando-me a demonstrar o procedimento estará a estudante de pós-graduação Beatriz Mart

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Fonte: Porlan, E., et al. Modificação genética estável e eficiente de células no camundongo adulto V-SVZ para a análise de efeitos autônomos e não autônomos de células-tronco neurais. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a modificação genética estável de células-tronco neurais (NSCs) na zona ventricular-subventricular (V-SVZ) por meio da injeção estereotáxica de um gene terapêutico portador de vírus em um modelo de camundongo. O vírus entra nas NSCs, sofre transcrição reversa, integra-se ao...

Injeção estereotáxica de vírus para modificação genética estável em um modelo de camundongo

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Aprenda a modificação genética estável de células-tronco neurais do rato adulto usando partículas lentivirais. Este método permite analisar efeitos autônomos e não autônomos no nicho neurogênico ventricular-subventricular.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos (Vídeo) | JoVE Journal

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

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