Geomagnética Field (Gmf) and Plant Evolution: investigação dos efeitos dos Gmf Reversão sobre

O objetivo geral deste procedimento é produzir a inversão do campo magnético terrestre, ou CMT, com bobinas de Helmholtz controladas por uma fonte de alimentação. Em última análise, demonstra-se que a inversão do CMT afeta a morfologia e a expressão gênica de plantas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de evolução de plantas, como, por exemplo, se a inversão do campo magnético da Terra pode ter desempenhado um papel na evolução e adaptação das plantas.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para testar possíveis efeitos biológicos de campos magnéticos fracos em um organismo modelo simples que pode ser cultivado com muitas réplicas, todas sob condições rigorosamente controladas. A demonstração deste procedimento será feita por Alberto Bocco e um aluno orientado do meu laboratório, além de Kiara aa. Ela é estudante de doutorado no meu laboratório e CIA Bertea, que é professora associada no meu grupo.

Para começar, ligue as três fontes de alimentação CC conectadas aos três pares de pares de bobinas de Helm Holtz e ligue o magnetômetro de três eixos cuja sonda está inserida nas bobinas triaxiais. Ligue o computador e inicie o software do magnetômetro, que permite coletar dados do magnetômetro de três eixos. As fontes de alimentação também estão conectadas a um computador por meio de conexão A-G-P-I-B para controle.

Defina as tensões das fontes de alimentação para gerar o campo magnético desejado com um vetor de campos magnéticos invertido, conforme descrito no protocolo textual. Coloque as sementes de Arabidopsis Aliana ecótipo Columbia, zero, em um tubo de 1,5 mililitro, superficialmente esterilizadas por tratamento com uma solução de hipoclorito de cálcio por 10 a 12 minutos a 25 a 28 graus Celsius com agitação contínua. Em seguida, enxágue as sementes duas vezes com etanol a 80%, seguido por uma lavagem com etanol a cem por cento.

E, finalmente, uma lavagem com água destilada estéril. Prepare um litro do meio Murrah Shiga e SCOG modificado conforme descrito no protocolo textual antes da solidificação. Despeje 80 mililitros de meio em cada placa de Petri quadrada, colocando 30 sementes estéreis em cada placa.

Em seguida, feche as placas com uma película cerosa. Incube as placas horizontalmente no escuro a quatro graus Celsius por dois dias para potencializar e sincronizar a germinação. Prepare as lâmpadas de vapor de sódio cobrindo o foco com um filme de gelatina azul para reduzir a componente vermelha das lâmpadas após a vernalização.

Prepare-se para expor as placas de Petri ao GMF normal ou invertido. Exponha as sementes em um ambiente com controle climático a 22 graus Celsius, em posição vertical. Em experimentos paralelos, tanto fora quanto dentro das bobinas triaxiais.

Sob um regime fotoperiódico de oito horas de escuro e 16 horas de luz. Após a exposição, tire fotos das placas de Petri para calcular o comprimento das raízes e as áreas foliares. Primeiro, meça o lado da placa de Petri.

Em seguida, abra a imagem da placa de Petri no software ImageJ e use a opção de linha reta para desenhar uma linha que cruze exatamente o lado da placa. No menu analisar, selecione definir escala e insira a distância real na caixa de distância conhecida. Em seguida, insira a unidade de comprimento.

E, finalmente, clique na opção global para tornar as configurações disponíveis para todas as medições de comprimento de raiz. Siga cuidadosamente o formato da raiz utilizando a ferramenta de desenho livre. Meça o comprimento utilizando a opção de medição no menu analisar.

Continue a medir todas as raízes na imagem e salve o arquivo para análise estatística posterior. Para a área foliar, no menu de imagem, utilize a opção ajustar, seguida de limiar de cor, selecione a folha individual e, no menu analisar, selecione analisar partículas, salvando as medições individuais para análise estatística. Colete 30 brotos e 30 raízes separadamente e congele-os imediatamente em nitrogênio líquido.

Em seguida, moa em nitrogênio líquido com almofariz e pistilo antes de isolar o RNA total conforme descrito no protocolo textual, realize todos os experimentos em um sistema em tempo real usando cyber green um com ROX como padrão interno de carregamento, realize a reação com uma mistura de 25 microlitros. Utilizando os iniciadores listados no protocolo textual, inclua controles sem transcriptase reversa para monitorar contaminação por DNA genômico, bem como controles sem molde. Leia a fluorescência após cada fase de anelamento e extensão.

Os dois ícones de lupa representam os dados coletados, incluindo as curvas de ligação e dissociação. Navegue até a tela de análise e configuração e certifique-se de que o conjunto de dados coletado durante o segmento de dissociação do experimento esteja selecionado. Para análise de todos os ensaios, realize uma análise de curva de fusão de 55 a 95 graus Celsius incluindo o segmento de dissociação no perfil térmico.

Utilize a tela de curva de dissociação acessada pela guia de resultados. Para visualizar o perfil de dissociação. Analise todos os gráficos de amplificação com o software do instrumento de PCR em tempo real.

Para obter os valores de CT, calibre e normalize os níveis relativos de RNA com o nível dos melhores genes de referência. Acesse a tela de gráficos de amplificação através da guia resultados. Selecione a rampa ou a fase de platô para a qual os dados devem ser analisados usando a tela de análise, seleção e configuração.

Em seguida, selecione a fluorescência normalizada corrigida para a linha de base no menu de fluorescência no painel de comandos. Acesse a tela de valores das amostras da placa através da guia de resultados. Para exibir os valores de CT das poças amostradas.

Utilize quatro genes de referência diferentes para normalizar os resultados da PCR em tempo real. Selecione o gene com a classificação mais alta usando o software de análise e utilize o gene mais estável para normalização. Organize brevemente os dados de entrada em uma planilha do Excel, com a primeira coluna contendo os nomes dos genes e a primeira linha contendo os nomes das amostras.

Em seguida, selecione o software de análise na barra de menus. Utilize a caixa de diálogo para selecionar os dados de entrada. Depois, verifique os nomes das amostras, os nomes dos genes e marque somente saída simples.

Clique no botão ir para realizar a análise, selecione o gene com a classificação mais alta como o gene candidato com expressão mais estável. Após 10 dias de exposição, as plantas controle apresentam um comprimento de raiz significativamente maior e folíolos mais desenvolvidos em comparação com as plantas expostas a condições de GMF invertido após 10 dias de exposição. O efeito da inversão do GMF foi uma alteração drástica na expressão gênica de todos os genes testados, incluindo crucífera na proteína transportadora de cobre um e no fator de transcrição um, responsivo à redox. As barras indicam o erro padrão; asteriscos indicam diferenças significativas entre plantas expostas a condições de GMF invertido e normal.

O efeito da inversão do GMF não induziu mudanças significativas na expressão gênica da parte aérea. No entanto, observou-se uma drástica subregulação na expressão gênica da raiz de plantas cultivadas. Em condições de GMF invertido, esses genes incluem thal, peroxidase aate, peroxidase aate, uma superóxido dismutase de ferro, uma N-A-D-P-H, oxidase de explosão respiratória, proteína e catalisador três.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em minutos até hoje, dependendo do experimento necessário, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como inverter ou alterar o campo geomagnético e realizar estudos morfológicos e genéticos em plantas expostas. Ao tentar este procedimento, é importante remover todas as fontes de campo magnético da região cercada pelas bobinas em forma de capacete.

É importante que as bobinas do capacete e seus geradores não gerem calor nem vibrações. O pesquisador deve permanecer cego quanto à condição de exposição ao campo magnético até que os dados finais tenham sido registrados. Esta técnica permitiu que pesquisadores na área de magnetopercepção explorassem o efeito de campos magnéticos na evolução de plantas, no comportamento e na navegação animal, e em linhagens celulares humanas.

No futuro, esperamos realizar estudos semelhantes em microgravidade, a fim de avaliar como a alteração do campo magnético impactará, em condições espaciais, o crescimento de plantas. Trabalhar com sistemas que geram campos magnéticos fracos não é considerado perigoso. No entanto, você deve tomar as precauções normais e deve procurar o aconselhamento de um eletricista qualificado antes de trabalhar com equipamentos como as fontes de alimentação para os pares de bobinas de Helm.