Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

O objetivo geral desta técnica é utilizar células endoteliais como um novo tipo de modelo celular apresentador de antígeno planar para investigar processos fundamentais de sinalização antigênica. Este método pode nos ajudar a abordar questões-chave no campo da imunidade adaptativa, como como a dinâmica de remodelação subcelular e molecular é coordenada espacial e temporalmente dentro da sinapse imunológica. A principal vantagem desta técnica é que o endotélio se forma virtualmente planar uma superfície de PC.

Isso permite imagens com resolução espaço-temporal ideal no contexto de uma superfície celular fisiologicamente complexa e moldável. Embora este método se concentre na ativação de células de memória efetoras de TH positivo de quatro CDs, ele também pode ser aplicado para o estudo de uma variedade de antígenos de tipos de células T e processos de sinalização. Hoje, Chris e eu mostraremos a você como realizar o segundo Begin por transecção de células endoteliais pulmonares humanas primárias ou microvasculares dérmicas com membrana YFP e DS solúvel vermelho via afecção nuclear NU e colocar as células transfectadas em placas de cultura de imagem de células vivas.

No dia seguinte, substitua o meio de cultura celular por meio fresco suplementado com interferon gama para induzir a expressão de M MHC dois nas células endoteliais, seguido de estimulação das células com 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa 24 horas depois, no terceiro dia, 30 a 60 minutos. Antes de iniciar o experimento, incube o endotélio com um micrograma por mililitro, cada um dos superantígenos bacterianos estafilocócicos enterotoxina B e toxina da síndrome do choque tóxico um a 37 graus Celsius. Durante a incubação, contar o número de células viáveis da cultura de linfócitos de interesse e transferir duas vezes 10 elevado a sexto das células para um tubo cónico de 15 mililitros.

Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão A recém-preparado, de modo que não restem aglomerados de células. Em seguida, adicione dois AR micromolares dois à amostra de células T, tampe o tubo e inverta-o imediatamente para homogêneo. Distribua o corante por toda a suspensão celular.

Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, gire os linfócitos marcados e ressuspenda suavemente, mas completamente, as células em 20 a 40 microlitros de tampão A fresco para obter uma imagem ao vivo, as células ligam o sistema de microscópio e abrem o software de captura de imagem apropriado. Defina os parâmetros apropriados para imagens automatizadas de lapso de tempo multicanal, bem como o intervalo de aquisição de 10 a 30 segundos e uma duração total de aproximadamente 20 a 60 minutos. Em seguida, adicione óleo fresco à objetiva.

Monte uma antena microscópica contendo 0.5 mililitros de tampão A no aquecimento stage adaptador e ligue imediatamente o adaptador previamente ajustado para 37 graus Celsius. Após dois a três minutos de equilíbrio, use uma pipeta de 20 microlitros para adicionar os linfócitos carregados de RA dois em repouso na câmara do prato do microscópio montada e ligue a imagem de campo claro. Selecione o caminho da luz para as oculares e use o botão de foco do curso para colocar a objetiva em contato com a parte inferior da antena do microscópio.

Em seguida, use a ocular e o botão de foco fino para localizar as células T instaladas na parte inferior do prato e use os controles de estágio XY para selecionar um campo contendo pelo menos 10 células quando as células apropriadas tiverem sido localizadas. Mude de campo claro para a fonte de luz fluorescente e de imagem IP para a câmera CCD. Otimize os parâmetros de aquisição e, em seguida, adquira imagens Fira 2 3 40 e FIRA 2 3 80 em repouso.

Uma das principais etapas para gerar resultados bem-sucedidos é a otimização cuidadosa dos parâmetros de aquisição de fluorescência, garantindo que o sinal suficiente seja coletado e, no caso do fira dois, que a proporção de 3 43 80 da linha de base seja próxima de um. Quando os dois tempos de exposição da FIRA tiverem sido definidos, substitua a placa de células T por uma placa de microscópio de células endoteliais usando uma pipeta de transferência descartável, remova rapidamente o meio e enxágue as células uma vez com um mililitro de tampão pré-aquecido A e, em seguida, substitua a lavagem por 0,5 mililitros de tampão fresco A. Usando a objetiva, identifique os campos nos quais as células endoteliais brilhantemente fluorescentes parecem saudáveis. Em seguida, ajuste os parâmetros de aquisição para a membrana YFP e DS RED conforme demonstrado para o fira dois.

Tomando cuidado para que a intensidade média do sinal fluorescente em cada canal caia entre 25 e 75% da faixa dinâmica do detector. Antes de realizar o experimento de imagem de células vivas, capture vários intervalos de imagens das células endoteliais sozinhas para estabelecer uma linha de base com o software automatizado. Em seguida, inserindo a ponta de um pequeno volume na mídia perto do centro da objetiva.

Dispense lentamente cinco microlitros de fira concentrado, dois linfócitos carregados no centro do campo de imagem do prato de microscópio. À medida que os linfócitos se acomodam, faça ajustes finos no foco para garantir que as interfaces das células endoteliais das células T sejam mantidas no plano focal. Com as objetivas 40 e 63 x, 10 a 20 células por campo é o ideal.

Após o intervalo de observação desejado, continue a imagem e pipete imediatamente a NIC diretamente na placa do microscópio até uma concentração final de dois micromolares para induzir um fluxo máximo de cálcio esfera. Dois sinais. Ao aplicar tratamentos às células, tome cuidado para manter o foco nítido na superfície marcada com YFP da membrana apical do endotélio para garantir a resolução ideal da remodelação da sinapse imunológica.

Na ausência de superantígeno no superantígeno endotelial, CD específico, quatro linfócitos TH um positivos se espalham rapidamente, polarizam e migram lateralmente sobre as células endoteliais. Durante esse processo, os linfócitos estendem saliências de curta duração ou ILPs na superfície endotelial, que são evidentes como anéis de fluorescência YFP de membrana análogos a pegadas na presença de superantígeno, contatos próximos célula a célula impulsionados pelos ILPs estão associados ao início de um fluxo de cálcio levando a um acúmulo de ILPs estabilizados dentro da sinapse imunológica. Essas matrizes de ILP são acopladas à sinalização sustentada de cálcio.

Os anéis de fluorescência da membrana que se formam durante as interações das células endoteliais das células T correspondem às saliências das células T que conduzem pontos discretos de invaginação nas células endoteliais, conforme confirmado pela demonstração de que esses anéis se correlacionam espacial e cineticamente com as zonas de citoplasma deslocado e excluído. Poucos minutos após a co-incubação das células endoteliais e T na presença de moléculas de adesão e sinalização de superantígenos associadas à sinalização antigênica são enriquecidas com as impressões pota e ILPs da sinapse imunológica. De fato, a sinapse imunológica endotelial de células T exibe uma arquitetura tridimensional discreta pontuada por ILPs de células T que se estendem para a superfície celular apresentadora do antígeno dentro da qual a maquinaria molecular de reconhecimento do antígeno é enriquecida.

Com essa abordagem, os principais obstáculos dentro dos modelos de PC existentes podem ser superados, permitindo a observação da arquitetura subcelular 3D indetectável e a rápida remodelação das interfaces fisiológicas de células T a PC. Isso oferece potencial para novos níveis de compreensão dos processos de sinalização antigênica.