Name: Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a utilizar células endoteliais como modelo planar de células apresentadoras de antígeno para investigar processos de sinalização antigênica. Este método permite imagem de alta resolução da sinapse imunológica e ativação de células T.

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Agradecemos ao Dr. Peter T. Sage por sua ajuda na geração de algumas das imagens representativas. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para C.V.C. (HL104006).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

No geral, este protocolo descreve métodos para a investigação de células endoteliais como i) APCs fisiológicos pouco estudado e ii) como um novo tipo de &quot;modelo APC celular planar&quot;. Com relação ao primeiro, tornou-se cada vez mais apreciado que APCs não hematopoiéticas periférica (ou &#39;estromais&#39;) desempenham papéis, não redundantes críticos (ou seja, em comparação com hematopoiéticas APCs) na formulação de respostas imunes adaptativas 16-18. Entre tais &quot;semi-profissional&quot; ...

Os linfócitos T são um ramo do sistema imunitário adaptativo, caracterizado por a capacidade de reconhecer eficientemente antigénio peptídico (Ag) ligado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) através dos seus receptores de células T (TCRs) 1. Linfócitos naive constitutivamente migrar e digitalizar &#39;Ag células apresentadoras de profissionais &quot;(APCs; por exemplo, células dendríticas) dentro de gânglios linfáticos, enquanto as células de memória / T efetoras precisa fazer um levantamento efetivamente uma gama extremamente ampla de APCs e células alvo em potencial dentro tecidos periféricos. Na min após o reconhecimento inicial de cognato Ag em um APC, linfócitos prender sua migração e começam a formar uma interface célula-célula íntimo especializado denominado &quot;sinapse imunológica&quot; (IS). Sustentada (ie, 30-60 min) É contatos são necessários para ampliar e sustentar a sinalização 2-7. Estudos emergentes identificar que no seja, é a formação contínua e rápida remodeling de micro-aglomerados discretos sinalização sub-celular (ou seja, contendo MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização) que determinam a força e qualidade dos resultando respostas imunes 2-7. No entanto, detalhes dinâmicos e mecanismo de regulação deste processo são completamente compreendidas 8,9. Isso decorre, em grande parte dos desafios técnicos associados com topologias de superfícies irregulares APC e orientação mal controlada dos planos de interação célula-célula, as questões que limitam profundamente a imagem espaço-temporal requisito aproxima 8-10 (Figura 1A). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Figura 1. Um Fisiológica Planar Modelo APC celular for Imaging imunológica Synapse Dynamics. O esquema ilustra imagem tradicional da sinapse imunológica entre uma célula T e um professio<html> nal APC (A) e de células T e um lipídicas planas modelo tradicional bicamada APC (B) em comparação com este modelo planar APC endotelial novel (C). APCs profissionais fornecer sinapses imunológicos fisiológicos, mas oferecem interface de mal orientadas célula-célula (isto é, em relação ao plano de imagem XY óptima; resolução ~ 0,2 ^ M), o que compromete dramaticamente espacial (plano de imagem z resolução ~ 1 mm) e temporal (isto é, devido à necessidade de digitalizar repetidamente através de todos os planos de imagem z) resolução de imagem. Modelos de duas camadas tem uma topologia plana que fornece melhor resolução de imagem espaço-temporal, mas também são altamente simplificado, não-fisiológica e rígida. Este modelo combina células endoteliais a topologia planar de camadas duplas lipídicas com o substrato fisiológico de um APC clássico para oferecer resolução de imagem espacial e temporal ideal em um ambiente fisiológico.m / files / ftp_upload / 53288 / &quot;target =&quot; _ blank 53288fig1large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Trabalhos anteriores contornada parcialmente estes obstáculos através do desenvolvimento de modelos de substrato planar (isto é, as bicamadas lipídicas e das superfícies revestidas com anticorpo) que fornecem resolução espaço-temporal óptimo (ou seja, através de fixação superfície a activação das células T num único plano que é paralelo ao imagiologia XY óptima avião) 11-15 (Figura 1B). Estes modelos têm facilitado importantes insights sobre a dinâmica subcelulares / molecular que controlam a sinalização antigênico nas células T, incluindo a descoberta de actina dinâmica / TCR sinalização micro-aglomerados 7,11-14. No entanto, tais modelos são inerentemente muito simplificado, assim como rígida (impedindo o desenvolvimento / estudo de características topológicas 3-dimensional) (Figura 1B). Portanto, permanece incerto como relacionar esses achados para phycélula-célula siologic vigilância imunológica. Embora ainda pouco estudadas, vascular e células endoteliais linfáticas estão emergindo como uma grande (ou seja, maior em número do que todos os APCs profissionais, por ~ 1.000 vezes) compartimento periférico de &quot;semi-profissional&quot; APCs 16-18. Estas células expressam MHC-I, MHC-II e uma multiplicidade de moléculas co-estimuladoras (por exemplo, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, mas não CD80 e CD86) e são estrategicamente posicionada na interface de sangue-tecido onde servem funções especializadas sentinela 16-18. Estudos anteriores demonstraram que as células endoteliais podem efetivamente re-estimular efector / memória, mas não naïve, células T 19-25. Assim, as células endoteliais são susceptíveis de desempenhar papéis exclusivos da APC na fase efectora da resposta imune adaptativa no interior dos tecidos periféricos, tais como a influência local sobre a activação de células T, a diferenciação, a memória e a tolerância 16,17,26. Criticalmente, quando cultivadas in vitro, as células endoteliais formam superfícies celulares praticamente planares e estão facilmente transfectáveis ​​(por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Estas características são ideais para imagens de alta resolução espacial e temporal da dinâmica topológica durante as interações célula-célula 19,27. Assim, as células endoteliais pode servir como um fisiológico &quot;planar celular da APC modelo extremamente adequado para o estudo dos mecanismos de remodelação subcelulares / moleculares que conduzem o reconhecimento do antigénio e regulam as respostas (Figura 1C) 19,20. Previamente estabelecida técnicas de imagem complementares (incluindo a transfecção de células endoteliais com fabricantes de proteína fluorescente da membrana de plasma e citossol) para estudar os detalhes da interacção de leucócitos-endotélio durante a adesão e a migração transendotelial de 27, mostraram que os leucócitos sondar activamente a superfície do endotélio por dinâmico inserção de umd retração de sub-mícron-escala, saliências cilíndricas ricas em actina (~ 200-1.000 nm de diâmetro e profundidade) denominado saliências invadosome-like (ou seja, &#39;ILPS&#39;) 27,28. Estas abordagens de imagem têm sido expandida, juntamente com a criação de protocolos para tirar proveito da função endotelial APC para desenvolver os primeiros métodos para imagens de alta resolução espacial e temporal da célula endotelial sinapse imunológica T como relatado 19,20 e ainda descrever aqui. Uma constatação fundamental derivado dessa modelo APC celular romance planar é que procedimentos ILP células T funcionar tanto na promoção da detecção Ag inicial e na manutenção de sinalização subsequente. Na verdade, matrizes de múltiplos procedimentos ILP (que foram estabilizados e acumulados em resposta a rubricar o fluxo de cálcio) mostram enriquecimento em TCR e moléculas de sinalização sugestivos activa, tais PKC-Q, ZAP-70, fosfotirosina e HS1. Portanto, procedimentos ILP parecem representar um equivalente fisiológico tridimensional para o micro-TCR sinalizaçãoaglomerados observados nos modelos de duas camadas planas. Esta abordagem, assim, com sensibilidade revela / relatórios dinâmica molecular e arquitetônicos (e implícitas biomecânico) de outra forma não detectável. O método descrito aqui deve ser útil para fazer a ponte entre APC profissional e modelos artificiais de substrato APC a fim de aumentar a nossa capacidade de interrogar mecanismos básicos da resposta imune adaptativa. Embora aqui o foco é sobre a activação das células T CD4 + do tipo Th1 efector / célula de memória, esta abordagem básica pode ser facilmente modificado para estudar uma ampla gama de tipos de células T e Ags, como discutido abaixo.

<table><tbody><tr><td>Torniquete sem látex elástico BD</td><td>Biosciences BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes com álcool BD</td><td>Biosciences</td><td>BD Biosciences 326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2</td></tr><tr><td>EDTA BD Vacutainer Conjunto de coleta de sangue com botão de pressão</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Traga para RT antes</td></tr><tr><td>de usar FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td> inativada por calor <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>enterotoxina estafilocócica</td><td>B Toxina Tecnologia</td><td>BT202RED</td><td>Solução de estoque 1mg / ml em PBS</td></tr><tr><td>toxina da síndrome do choque tóxico 1</td><td>Tecnologia de toxinas</td><td>TT606RED</td><td>Solução de estoque 1mg / ml em</td></tr><tr><td>PBS IL-15 humano</td><td>R & D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Solução de estoque 50ug / ml em PBS</td></tr><tr><td></td><td>PBS Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Solução de estoque 1mg / ml em H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Outros ECs microvasculares humanos podem ser usados, ou seja, HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV kit de bala</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Solução de estoque 10x, diluída em PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Kit de nucleofector</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Kit necessário para a etapa 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Solução de estoque 1mg/ml em H20</td></tr><tr><td>TNF-alfa 10ug, Human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Solução de estoque 1mg/ml em fenol H20</td></tr><tr><td>HBSS sem vermelho</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de Cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Solução de estoque 1M em H20</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Solução de estoque 1M em H20</td></tr><tr><td>Albumina de soro humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F óleo de imersão livre de fluorescência</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Solução de estoque 1mM em DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (DsRed citoplasmático solúvel)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsMembrana de monômero vermelho (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Tóxico, use capela</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>12 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>&nbsp; Placas de Cultura de Tecidos Falcon 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas Delta-T</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur Descartáveis Wheaton</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 camundongo anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>camundongo HS1 camundongo anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purificado</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Classe II anticorpo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta anticorpo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>fosfotirosina (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Eletroporador necessário para o passo 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Série 60) Armário de Segurança Biológica</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, 5% CO2 Incubadora de Cultura</td><td>de Células Centrífuga Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Hemocitômetro Bright-Line</td></tr><tr><td>Isotemp Banho-maria modelo 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de celular endotelial planar for imaging imunológica synapse dynamics

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

A imunidade adaptativa é regulada por interações dinâmicas entre as células T e células apresentadoras de antígenos (&#39;APCs&#39;) conhecido como &#39;sinapses imunológicas. Dentro destas interfaces de célula-célula íntimos agrupamentos sub-celular discretas de MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização formar e remodelar rapidamente. Essas dinâmicas são pensados ​​para ser determinantes críticos tanto da eficiência e qualidade das respostas imunes que se desenvolvem e, portanto, de proteção contra a imunidade patológica. Compreensão atual das sinapses imunológicas com fisiológico APCs é limitado pela inadequação da resolução de imagem obtidos. Embora modelos substrato artificial (por exemplo, bicamadas lipídicas planas) oferecem excelente resolução e têm sido ferramentas extremamente valiosas, eles são inerentemente não-fisiológica e simplista. As células endoteliais vasculares e linfáticas surgiram como um tecido periférico importante (ou estroma) compartimento de &quot;semi-profissãoai APCs &#39;. Estas APCs que expressam (a maioria da maquinaria molecular de APCs profissionais) têm a característica única de formação da superfície celular praticamente plana e são facilmente transfectáveis ​​(por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Aqui uma abordagem básica para implementar as células endoteliais como uma nova e fisiológico &quot;planar modelo celular da APC &#39;para melhorar a imagiologia de interrogação e de processos fundamentais de sinalização antigénicos irá ser descrito.

Uma nova abordagem de imagem usando células endoteliais e que combina as vantagens de resolução do cartão planar bicamadas lipídicas modelo com a complexidade fisiológica e deformabilidade da APC profissional foi desenvolvido (Figura 1). A Figura 2 proporciona exemplos de migração típica, fluxo de cálcio e dinâmica topológica observada com este abordagem. Na ausência de retracção no endotélio, os linfócitos T CD4 + Th1 SAg específicos espalhar...

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

O objetivo geral desta técnica é utilizar células endoteliais como um novo tipo de modelo de célula apresentadora de antígeno planar para investigar processos fundamentais de sinalização antigênica. Este método pode nos ajudar a responder perguntas essenciais na área da imunidade adaptativa, como a coordenação espacial e temporal da dinâmica de remodelamento subcelular e molecular dentro da sinapse imunológica. A principal vantagem desta técnica é que o endotélio forma uma superfície de célula apresentadora praticamente planar.Isso permite a obtenção de imagens com resolução espaço-temporal ótima no contexto de uma superfície celular fisiologicamente complexa e moldável. Embora este método se concentre na ativação de células T CD4 positivas de memória efetora, ele também pode ser aplicado para o estudo de diversos tipos de linfócitos T, antígenos e processos de sinalização. Hoje, Chris e eu mostraremos como realizar o segundo passo: transfectar células endoteliais microvasculares primárias de pulmão humano ou dérmicas com YFP de membrana e DSRed solúvel por meio de NU nuclear e semear as células transfectadas em placas de cultura para imagem em tempo real de células vivas.No dia seguinte, substitua o meio de cultura celular por meio fresco suplementado com interferon gama para induzir a expressão de MHC classe II nas células endoteliais, seguido pelo estímulo das células com 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa 24 horas depois, no terceiro dia, durante 30 a 60 minutos. Antes de iniciar o experimento, incube o endotélio com um micrograma por mililitro de cada uma das superantígenos bacterianos, toxina estafilocócica B e toxina da síndrome do choque tóxico tipo um, a 37 graus Celsius. Durante a incubação, conte o número de células viáveis da cultura de linfócitos de interesse e transfira duas vezes 10 à sexta potência dessas células para um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue as células e ressuspender o pellet em dois mililitros de tampão A recém-preparado, de modo que não permaneçam aglomerados celulares. Então, adicione dois micromolares de RA dois à amostra de linfócitos T, tampe o tubo e inverta-o imediatamente para homogeneizar. Distribua o corante uniformemente pela suspensão celular.Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue os linfócitos marcados e resuspenda suave mas completamente as células em 20 a 40 microlitros de tampão A fresco para a aquisição de imagens em tempo real. Ligue o sistema do microscópio e abra o software apropriado de captura de imagens. Defina os parâmetros adequados para a aquisição automatizada de imagens com múltiplos canais e em intervalos de tempo, com intervalos de aquisição de 10 a 30 segundos e uma duração total de aproximadamente 20 a 60 minutos. Em seguida, adicione óleo fresco à objetiva.Monte um recipiente de microscopia contendo 0,5 mililitros do tampão A no adaptador do estágio aquecido e ligue imediatamente o adaptador previamente ajustado a 37 graus Celsius. Após dois a três minutos de equilíbrio, utilize uma pipeta de 20 microlitros para adicionar os linfócitos em repouso carregados com RA2 à câmara do recipiente de microscopia montado e ligue a imagem em campo claro. Selecione o trajeto da luz para as oculares e use o botão de foco grosso para aproximar a objetiva até o contato com a parte inferior do recipiente de microscopia.Em seguida, utilize a ocular e o botão de foco fino para localizar os linfócitos T assentados no fundo da placa e use os controles do estágio XY para selecionar um campo contendo pelo menos 10 células, quando as células apropriadas forem localizadas. Alterne da iluminação de campo claro para a fonte de luz fluorescente e da imagem IP para a câmera CCD. Otimize os parâmetros de aquisição e então adquira as imagens de repouso de Fira 2 3 40 e FIRA 2 3 80.Uma das etapas fundamentais para gerar resultados bem-sucedidos é a otimização cuidadosa dos parâmetros de aquisição de fluorescência, garantindo que um sinal suficiente seja coletado e, no caso do FIRA dois, que a razão basal 3 43 80 esteja próxima de um. Após os tempos de exposição do FIRA dois terem sido definidos, substitua o recipiente de células T por um recipiente de microscopia contendo células endoteliais; usando uma pipeta descartável, remova rapidamente o meio e lave as células uma vez com um mililitro de tampão A pré-aquecido, em seguida substitua a lavagem por 0,5 mililitros de tampão A fresco. Usando a objetiva, identifique campos nos quais as células endoteliais fluorescentes brilhantes pareçam saudáveis. Ajuste então os parâmetros de aquisição para YFP de membrana e DS RED conforme demonstrado anteriormente para o FIRA dois.Certifique-se de que a intensidade média do sinal fluorescente em cada canal esteja entre 25 e 75% da faixa dinâmica do detector. Antes de realizar o experimento de imagem em células vivas, capture vários intervalos de imagens das células endoteliais isoladas para estabelecer uma linha de base com o software automatizado. Em seguida, insira a ponta de um pequeno volume no meio próximo ao centro do objetivo.Dispense lentamente cinco microlitros de fira concentrada, com dois linfócitos carregados, no centro do campo de imagem do prato do microscópio. À medida que os linfócitos se acomodam, faça ajustes finos no foco para garantir que as interfaces entre células T e células endoteliais permaneçam no plano focal. Com objetivas de 40x e 63x, de 10 a 20 células por campo são ideais.Após o intervalo de observação desejado, continue a aquisição de imagens e pipete imediatamente CIN diretamente no recipiente do microscópio até uma concentração final de dois micromolares para induzir um fluxo máximo de cálcio na esfera. Dois sinais. Ao aplicar tratamentos às células, tenha cuidado para manter o foco nítido na superfície apical marcada com YFP do endotélio, a fim de garantir uma resolução ideal da remodelação da sinapse imunológica.Na ausência de superantígeno nas células endoteliais, os linfócitos TH1 CD4 positivos específicos para superantígeno se espalham rapidamente, polarizam-se e migram lateralmente sobre as células endoteliais. Durante esse processo, os linfócitos estendem protrusões de curta duração ou ILPs na superfície endotelial, que são evidentes como anéis de fluorescência de YFP na membrana, análogos a pegadas. Na presença de superantígeno, os estreitos contatos célula a célula mediados pelos ILPs estão associados ao início de um fluxo de cálcio, levando à acumulação de ILPs estabilizados dentro da sinapse imunológica. Essas formações de ILPs estão acopladas a uma sinalização contínua de cálcio.Os anéis de fluorescência da membrana que se formam durante as interações entre células T e células endoteliais correspondem às protrusões das células T que induzem pontos discretos de invaginação nas células endoteliais, conforme confirmado pela demonstração de que esses anéis se correlacionam espacial e cineticamente com as zonas de deslocamento e exclusão do citoplasma. Minutos após a co-incubação das células endoteliais e das células T na presença de superantígeno, moléculas de adesão e sinalização associadas ao sinal antigênico são coenriquecidas dentro das impressões e ILPs da sinapse imunológica. De fato, a sinapse imunológica entre célula T e célula endotelial exibe uma arquitetura tridimensional distinta, pontuada por ILPs das células T que se estendem até a superfície da célula apresentadora de antígeno, dentro das quais a maquinaria molecular de reconhecimento de antígeno está enriquecida.Com esta abordagem, é possível superar obstáculos fundamentais presentes em modelos atuais de PC, permitindo a observação de arquiteturas subcelulares tridimensionais normalmente indetectáveis e a remodelação rápida das interfaces fisiológicas entre linfócitos T e PC. Isso oferece potencial para novos níveis de compreensão dos processos de sinalização antigênica.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da topologia de sinapses imunológicas, investigando as interações entre linfócitos T e células epiteliais que carregam antígenos fluorescentes. A microscopia de fluorescência revela deslocamento do citoplasma vermelho e anéis de membrana amarela nas células endoteliais, indicando a formação de sinapses imunológicas.

Avaliação da topologia imunológica de sinapses por meio de imagens de células vivas

Fonte: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o uso da microscopia confocal para visualizar a dinâmica dendrítica em explantes retinianos de camundongos vivos. Ele descreve as etapas para estabilizar a retina sob um microscópio confocal, realizando imagens de epifluorescência para visualizar interneurônios amácrinos...

Imagem confocal com lapso de tempo da dinâmica dendrítica neuronal em explantes retinianos de camundongos

Aqui, ilustramos o protocolo para a imagiologia por duas cores STED Nanoscopia citotóxica sinapse imune das células NK retomados em vidro. Usando este método, obtemos resolução nm sub-100 de proteínas de sinapses e do citoesqueleto.

Visualização do imunológica Synapse por Dual Color Time-fechado Emissão Estimulada Exaustão (STED) Nanoscopia

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Descrevemos aqui uma combinação da técnica de bicamada lipídica suportada em vidro de formação de sinapses imunológicas com a técnica de imagem de super-resolução de microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários as instruções necessárias para realizar com sucesso essas duas técnicas.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Aprenda a utilizar células endoteliais como modelo planar de células apresentadoras de antígeno para investigar processos de sinalização antigênica. Este método permite imagem de alta resolução da sinapse imunológica e ativação de células T.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

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