Name: High Throughput Danio rerio Energia Despesas Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a medir taxas metabólicas em larvas de Danio rerio com ensaio fluorométrico de alta vazão usando resazurina. Este método permite detectar pequenas diferenças no metabolismo para pesquisa de obesidade e triagem de fármacos.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Roger Cone e Chao Zhang por suas contribuições para validar a aplicação deste ensaio conforme publicado anteriormente. Este trabalho foi apoiado pelo NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Este protocolo segue as diretrizes da Universidade do Arizona Gabinete de Conduta Responsável em Pesquisa e foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional 1. Criação de peixe-zebra e Embryo Manutenção <ol><li> Prepare meio embrião E3 8. Fazer 60x solução estoque, dissolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 ● 2H 2 O, e 9,78 g de MgCl2 ● 6H 2 O em 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH e HCl Ajustar o volume para 2 L, utilizando ddiH 2 O. </li><li> Para preparar o meio embrião E3 1x, diluir 16,5 ml 60x estoque em 1 L ddiH20. Adicionar 100 mL de 1% de azul de metileno. </li><li> Reprodução <ol><li> Casa Masculino e Feminino reprodutores (7 - 18 meses de idade) separadamente para maximizar a fecundidade. </li><li> Desligue as luzes 1 - 2 horas antes, no dia anterior ovos são desejados. Configure o acasalamento (1 macho e 1 - 2 fêmeas) em cgaiolas Rossing 9 como previamente descrito. Cruzando gaiolas para permitir que os ovos a predação escapar à medida que passam através da base perfurada da peça inserta na qual o tanque de peixes adultos são realizadas. </li><li> Opcional:. Para reprodução programada, (como seria necessário para estudos envolvendo morfolino injeção), separe a peixes machos e fêmeas por um divisor de plástico transparente, Remover esta manhã para resultar na colocação cronometrado dos ovos e fertilização. Para morfolino estudos, realizar cálculos de energia para avaliar o número de peixes embrionário exigido por tratamento. Sem uma estimativa da magnitude do efeito, ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado com uma N = 8. </li></ol></li><li> Despeje os ovos a partir do cruzamento de gaiola em uma placa de Petri (100 - 150 embriões / 10 centímetros placa de Petri). Permita que os ovos se depositam no fundo do prato e despeje a água. Retire toda a água restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta. Adicionar costas meio E3 embrião feita na etapa 1.1. </li><li> Faça afpipeta descartável polido lame para o ovo futuro e transferência de peixes. Com uma tesoura, corte uma pipeta de transferência descartável formado pela graduação de 0,25 ml. Para remover arestas, polonês chama a ponta corte sobre um bico de Bunsen. </li><li> Manter peixes embrionárias para 4 dias após a fertilização (DPF) em 10 cm placas de Petri em meio E3 embrião de peixe-zebra a 28,5 ○ C. Duas vezes por dia, use uma chama polido formou pipeta de transferência descartável para remover quaisquer ovos não fertilizados ou embriões mortos (aparência branca opaca). Uma vez por dia, substitua meio embrião E3. Deitar fora meio embrião E3, remover o líquido restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta, e adicionar novamente pré-aquecido (28,5 ○ C) meio embrião E3. </li></ol> 2. Preparar a Solução de Ensaio <ol><li> Preparar a solução de ensaio de acordo com a Tabela 1. Solução de ensaio de filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um. Antes do ensaio de iniciação, aquecer a solução de ensaio estéril numa 28,5 ○ Cbanho d&#39;água. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % Do Total </td><td> Volume (mL / 10 mL) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embryo Médio </td><td> 1.667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Duplo deionizada (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM de NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0,1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Ensaio Médio 3. Execute Assay <ol><li> Enxágüe embriões de peixe-zebra 3 vezes com meio embrião E3 filtrada estéril. Misture todos os embriões de peixe-zebra viáveis ​​do embreagem para um copo. Filtro estéril 75 ml meio embrião E3. Usando uma ponta fina transferência descartável pipeta, remover-se tanto a forma de embrião E3 a partir dos embriões de peixe-zebra quanto possível. Adicionar 20 ml de volta médio embrião estéril filtrada E3. Remover e substituir meio embrião E3 3 vezes. </li><li> Placa 1 peixe para cada um dos 93 poços de uma de 96 poços preto sided placa clara de fundo. Transferir o peixe embrionária para a placa de captura individualmente por um embrião dentro de uma chama de plástico graduado lustrado pipeta descartável (passo 1.5) e ejectar suavemente para dentro do poço. Transferir meio embrião E3 retirado da proveta contendo os peixes enxaguado em 3 poços em branco. Isto assegura que os poços em branco foram expostas a água da mesma exacta como os poços que contêm peixes. Ambos os poços que contêm peixes e poços de branco deve ser de, pelo menos, ½ completo (200 ul) à conclusão deste passo. </li><li> Substituir meio embrião E3 com solução de ensaio em todos os 96 poços, incluindo poços em branco. Esta etapa deve ser realizada uma coluna de cada vez para cada uma das 12 colunas de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta fina descartável transfer pipeta, remover o meio embrião E3 de cada poço numa coluna de a placa (8 poços). Tome cuidado para não tocar o embrião de peixe-zebra. Adicionar 300 ul de solução de ensaio a cada poço a partir do qual a água foi removida. Repetir a remoção do meio de embrião E3 e substituição com a solução de ensaio para todas as 12 colunas da placa. </li><li> Opcional: Para testar a alteração da taxa metabólica em resposta a um composto, fazer uma solução que é 100 vezes (100X) a concentração de tratamento desejado. De nota, assegurar que a solução 100x não exceda 10% DMSO para limitar a concentração de DMSO final a não mais do que 0,1%. Adicionar 3 mL da solução de 100x a cada um dos poços de tratamento. NOTA: Executar cálculos de potência para avaliar o número de poços de tratamento. No entanto, sem uma estimativa da grandeza da resposta ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado em 8 tratado com composto e 8 tratados com veículo poços de controlo que contêm peixes. <ol><li> Adicionar 3 mL de controlo do veículo para o controlo (sem Drutratamento g) poços que contêm peixes. Para assegurar que a resposta ao composto fluorescente é um resultado das acções dentro do peixe, aplicam-se tratamentos com drogas e 3 do veículo para poços em branco em placa de 96 poços. </li></ol></li><li> Leia peixes cheio placa fluorescente leitor de placas com comprimento de onda de excitação a 530 nm e comprimento de onda de emissão a 590 nm. </li><li> Colocar a placa na incubadora umidificado definida para 28,5 ○ C (placa de manter na escuridão durante todo ensaio para evitar a fotodegradação de solução de ensaio). O ensaio pode ser executado por períodos de tempo que variam desde 1 h a 24 h. A duração do ensaio depende do objectivo do estudo. Para testar a resposta de um composto não-estável de curta duração de curta duração pode ser mais adequado. No entanto, para os testes composto estável ou testes de efeitos genéticos, maximizando a duração do ensaio é preferível explorar as vantagens associadas com o sinal cumulativo. </li><li> Em um ponto de tempo pré-determinado (veja o passo 3.6 para ajudar a determinar sincronismo)leia fluorescência de placa cheio de peixe novamente com as mesmas configurações do passo 3.5. </li></ol> 4. Avaliar a mudança relativa na fluorescência associada ao tratamento <ol><li> Calcular alteração na fluorescência de cada cavidade subtraindo a fluorescência no tempo 0 da fluorescência após a conclusão do estudo. Wells sem peixe (espaços em branco) deverá ter valores próximos de 0, muito abaixo dos valores dos poços que contêm peixe. Alteração na fluorescência = Fluorescência na conclusão - fluorescência no tempo 0 </li><li> Para determinar a alteração relativa da fluorescência, calcular a variação média da fluorescência para os poços de controlo, em seguida, dividir a alteração na fluorescência de cada poço pela variação média da fluorescência dos poços de controlo. De nota, controles poderia ser ou comandos do veículo ou controles genéticos. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
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<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

A contaminação com bactérias ou fungos limita grandemente a aplicação deste ensaio. O azul de metileno no meio embrião E3 limita a possibilidade de contaminação por fungos. Ao longo embrião criação é fundamental que o cuidado é tomado para remover embriões mortos duas vezes por dia. Além disso, é essencial para lavar cuidadosamente os embriões com meio embrião E3 estéril no dia do início do ensaio. Estes passos 2 limitar o potencial para a contaminação bacteriana dos embriões. A inclusão de poços em branco descritos no ...

O mouse é atualmente o modelo predominante para a investigação de obesidade. O curto intervalo de geração e ferramentas genéticas disponíveis no rato têm sido inigualável até à data. No entanto, o peixe-zebra também tem um intervalo de geração curto (3 - 4 meses) e supera até mesmo o mouse na facilidade de manipulação genética 1,2. O peixe-zebra mantém quase 90% de genes de mamíferos, enquanto ultrapassando o mouse no número de descendentes e potencial para uso em telas genéticos e medicamentos 3. Para explorar o potencial do modelo peixe-zebra para estudos em obesidade, os ensaios devem ser desenvolvidos para investigar os fatores que influenciam a regulação do peso corporal, incluindo as despesas de energia. Como metabolitos são processados ​​através β-oxidação e o ácido tricarboxílico ciclo oxigénio é consumido NADH e 2 é produzido. Assim, NADH 2 é um indicador directo do fluxo de metabolitos através de vias metabólicas (oxidação metabolito). Em poikilotherms, H + vazar através da membrana mitocondrial interna, que desacopla o NADH 2 de oxidação a partir da síntese de ATP, é de 4 - 5 vezes menor do que em homeotérmicos 4. Assim, em NADH 2 peixe-zebra é muito bem ligados à produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Aqui, descrevemos um ensaio que mede a produção de NADH 2 em zebrafish larval como um proxy para o gasto energético 5. O consumo de oxigênio é o padrão ouro para medir o gasto de energia. No entanto, para melhor aproveitar o potencial de alto rendimento do peixe-zebra, ensaios de gasto de energia devem ser passíveis de high-throughput. Sistemas de consumo de oxigênio que dependem de uma câmara fechada, sistema de circulação são limitados em taxa de transferência pelo número de câmaras disponíveis 6. Open air consumo de O 2 / CO 2 ensaios de produção também foram aplicadas no peixe-zebra 5,7. Estes ar livre de 96 poços placa de baseD Systems são passíveis de alto rendimento. Infelizmente, as trocas gasosas com o ambiente de limites de sensibilidade destes ensaios. Nós publicada recentemente a aplicação de um ensaio que monitora NADH 2, utilizando o indicador redox alamarBlue 5. Este ensaio supera as limitações na taxa de transferência e sensibilidade comum às análises de consumo de oxigênio no peixe-zebra. O peixe-zebra está se tornando um modelo cada vez mais importante para estudos da homeostase energética do corpo inteiro. Em parte, por causa do peixe-zebra são passíveis de uso em telas genéticos para a frente e telas de drogas. Além disso, orientada manipulação genética, incluindo knockdown e knock-in, pode ser aplicada rapidamente. Nós mostramos anteriormente que este ensaio pode ser combinado com a aplicação de drogas e banho de knockdown ou nocaute genético para identificar compostos e genes que alteram a taxa metabólica 5. Além disso, este ensaio foi concebido para explorar as vantagens de elevada capacidade inerentes ao peixe-zebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Fabricado pela Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Fabricado pela Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipeta de Transferência Descartável Graduada</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Fabricado pela Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços de fundo transparente com lados pretos</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Fabricado por E& K Produtos Científicos Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput<em&gt; danio rerio</em&gt; energia despesas assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Peixe-zebra são um modelo importante organismo com vantagens inerentes que têm o potencial para fazer zebrafish um modelo amplamente aplicado para o estudo da homeostase da energia e da obesidade. O pequeno tamanho do peixe-zebra permite ensaios sobre os embriões para ser conduzido num formato de placa de 96 ou 384 poços, morfolino e tecnologias baseadas CRISPR promover a facilidade de manipulação genética, e no tratamento de droga por aplicação de banho é viável. Além disso, peixe-zebra são ideais para telas genéticos para a frente, permitindo a descoberta do gene para a novela. Dada a relativa novidade do peixe-zebra como um modelo para a obesidade, é necessário desenvolver ferramentas que exploram plenamente esses benefícios. Aqui, nós descrevemos um método para medir o gasto de energia em milhares de peixes-zebra embrionária simultaneamente. Nós desenvolvemos uma plataforma de microplacas animal completo no qual usamos placas de 96 poços para isolar cada peixe e avaliar cumulativa de produção de NADH usando a 2 disponível comercialmente cultura celular viabilidade reagente alamarBlue. Em poiquilotérmicos a relação entre NADH 2 produção e gasto de energia está intimamente ligado. Este ensaio gasto energético cria o potencial para a tela rapidamente manipulações farmacológicas ou genéticas que alteram diretamente o gasto de energia ou alteram a resposta a um fármaco aplicada (por exemplo, sensibilizadores de insulina).

Solução de ensaio não aumenta de fluorescência na ausência de peixe embrionário (Figura 1). No entanto, o ensaio é altamente sensível a pequenas alterações na taxa metabólica dentro do poço. Um peixe dentro de um único poço cria um sinal significativamente diferente de poços em branco dentro de 1 h (P &lt;0,0001). A Figura 2 proporciona uma representação visual de sinais gerados pelo peixe embrionário após 24 h de incubação. Para a finalidade da imagem foram usadas poços claras lados. N...

O peixe-zebra é um importante organismo modelo para o estudo da homeostase energética. Ao utilizar um indicador redox sensível ao NADH2, alamar Blue, desenvolvemos um ensaio que mede a taxa metabólica de larvas de peixe-zebra em um formato de placa de 96 poços e pode ser aplicado à descoberta de medicamentos ou genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

O objetivo geral deste ensaio fluorométrico de alto rendimento baseado em resazurina é monitorar o efeito de manipulações genéticas ou farmacológicas na produção de NADH2, que é uma medida da taxa metabólica. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais na área da obesidade, como o efeito de uma determinada droga ou gene sobre a taxa metabólica. Além disso, este ensaio pode ser aplicado para triagem de possíveis interações droga-droga ou droga-gene em um sistema de animal inteiro.A principal vantagem deste ensaio, em relação aos ensaios de consumo de oxigênio, é o alto rendimento e o acúmulo do sinal ao longo do tempo, o que permite ao usuário detectar pequenas diferenças na taxa metabólica. Demonstrará este procedimento Caroline Foy, aluna de pós-graduação no meu laboratório. Após preparar uma solução estoque de meio E3 a 60X de acordo com o protocolo descrito, prepare o meio E3 a 1X diluindo 16,5 mililitros da solução estoque em um litro de água duplamente destilada.Em seguida, adicione 100 microlitros de azul de metileno a 1%. Para preparar uma pipeta descartável com ponta polida à chama para transferência de ovos e peixes, use uma tesoura para cortar uma pipeta graduada descartável no traço de 0,25 mililitro. Depois, para remover as bordas irregulares, use um bico de Bunsen para polir à chama a ponta cortada.Após montar cruzamentos de peixe-zebra e coletar os ovos, deixe os ovos sedimentarem no fundo da placa e descarte a água. Utilize uma pipeta descartável de ponta fina para remover qualquer água remanescente. Em seguida, adicione novamente o meio E3.Incube os peixes embrionários a 28,5 graus Celsius até quatro dias após a fertilização, ou DPF. Duas vezes ao dia, utilize uma pipeta transferidora descartável graduada e polida com chama para remover ovos não fertilizados ou embriões mortos. Em seguida, uma vez ao dia, descarte o meio E3.Use uma pipeta de transferência de ponta fina para remover todo o meio remanescente e substitua por E3 fresco pré-aquecido a 28,5 graus Celsius. Para realizar o ensaio de gasto energético, prepare a solução de ensaio, seguindo esta tabela. Use um filtro de 0,22 micrômetro para esterilizar a solução por filtração e aqueça a 28,5 graus Celsius em banho-maria para o ensaio.Em uma placa de Petri, combine todos os embriões viáveis de peixe-zebra do lote. Após esterilizar por filtração 75 mililitros de meio E3, use uma pipeta descartável de ponta fina para remover o máximo possível do meio E3 da placa de Petri. Adicione novamente 20 mililitros de meio E3 estéril. Em seguida, remova e substitua o meio E3 estéril mais duas vezes.Em seguida, utilizando uma pipeta plástica descartável graduada e polida pela chama, transfira peixes embrionários individuais para os poços de uma placa de 96 poços. Trabalhando com uma coluna da placa por vez, remova o meio E3 dos oito poços da primeira coluna, tomando cuidado para não tocar os embriões com a pipeta de transferência. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução do ensaio a cada poço.Repita com todas as 12 colunas da placa. Para incluir um tratamento com fármaco, após preparar uma solução 100X do composto desejado, adicione três microlitros a cada poço de tratamento. Em seguida, adicione três microlitros do controle do veículo aos poços controle de peixes.Para garantir que a resposta de fluorescência ao composto seja resultado de atividade dentro do peixe, prepare tratamentos com o fármaco e com o veículo em três poços vazios cada, em uma placa de 96 poços. Agora, utilizando um leitor de placas com fluorescência, com comprimentos de onda de excitação e emissão de 530 nanômetros e 590 nanômetros, respectivamente, leia os poços da placa com os peixes. Coloque a placa em um incubador umidificado a 28,5 graus Celsius.Dependendo do ensaio e da estabilidade do composto testado, leia novamente a fluorescência em um ponto de tempo predeterminado. Para avaliar a alteração relativa na fluorescência, calcule a alteração média na fluorescência dos poços controle. Em seguida, divida a alteração na fluorescência de cada poço pela alteração média na fluorescência dos poços controle.Aqui está um exemplo de uso de duas colunas de uma placa de 96 poços. Os poços da coluna A incluem peixes-zebra controle tratados com veículo, enquanto os poços da coluna B incluem peixes-zebra tratados com insulina. Na tabela A, é mostrada a fluorescência medida no tempo zero.A Tabela B contém a fluorescência medida 24 horas depois. Na Tabela C, a fluorescência no tempo zero foi subtraída da fluorescência em 24 horas para avaliar a variação da fluorescência. Em seguida, calcule a variação média da fluorescência nos poços controle.A Tabela D mostra a variação da fluorescência de cada poço individual, dividida pela variação média dos poços controle. Pode-se observar aqui que o tratamento com insulina a 10 micromolar causou um aumento de 2,77 vezes no sinal gerado por peixes-zebra ao longo de 24 horas, com um valor de P inferior a 0,0001. Como visto aqui, a solução do ensaio não altera a cor nem os níveis absolutos de fluorescência na ausência de embriões.No entanto, o ensaio é altamente sensível a pequenas alterações na taxa metabólica dentro do poço. Esta figura representa os sinais gerados por tilápias embrionárias após incubação por 24 horas. Os poços cor-de-rosa indicam peixes com alta taxa metabólica.Poços roxos contêm peixes com taxas metabólicas moderadas, e os poços azuis representam uma taxa metabólica baixa. Isso também mostra a versatilidade desse ensaio e sua aplicação entre espécies de teleósteos. Como a redução do alamar blue induzida pelo NADH2 é não reversível, o sinal se acumula ao longo do tempo, o que permite que pequenas alterações sejam amplificadas.É mostrada aqui a alteração relativa na fluorescência induzida por um a cinco peixes após uma, duas e quatro horas. Com cada aumento no número de peixes, a alteração relativa na fluorescência aumenta significativamente com o tempo, e quanto maior o número de peixes, maior a magnitude da alteração na fluorescência ao longo do tempo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada com até 5.000 peixes embrionários por dia.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado para não lesionar os peixes embrionários. Após a realização deste ensaio, outros procedimentos podem ser realizados, como a medição de lipídios neutros com vermelho de Nile, ou a medição da atividade fagocítica por meio da ingestão de paramécios marcados com fluorassay. Isso nos permite comparar a relação entre a taxa metabólica e o metabolismo de lipídios, ou entre a taxa metabólica e a atividade fagocítica.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do metabolismo energético e doenças metabólicas estudarem o gasto energético em peixes-zebra sem limitações na produtividade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o reagente fluorométrico resazurina para medir a produção de NADH2 no peixe-zebra.

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Biologia

Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir...

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

Um protocolo é descrito para detecção in vivo de efeitos de inibidores mitocondriais no organismo modelo Caenorhabditis elegans e para identificação de potenciais compostos potenciadores. Este protocolo pode ser usado para rastrear bibliotecas de medicamentos em busca de compostos que modulam a função mitocondrial.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

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Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

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Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

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Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

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O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.

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Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

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