2.6: Hibridização in situ de montagem completa

A hibridização in situ de montagem completa é uma técnica poderosa que permite aos cientistas entender a base molecular do desenvolvimento embrionário. "Montagem inteira" indica que todo o embrião será usado, não apenas uma fatia de tecido. "In situ" é uma frase latina que significa "em posição". E, finalmente, "hibridização" refere-se à ligação complementar de uma molécula de RNA produzida sinteticamente a um transcrito de mRNA dentro da célula de um organismo.

Este vídeo demonstrará o procedimento, os resultados esperados e as aplicações selecionadas dessa técnica que podem permitir uma melhor compreensão dos distúrbios do desenvolvimento.

Os genes subjacentes à morfogênese do organismo são expressos em padrões temporal e espacialmente restritos durante o curso do desenvolvimento embrionário.

Sondas de RNA produzidas sinteticamente, chamadas ribotrobas, são usadas para detectar mRNAs por ligação complementar. As riboprobolas são marcadas com nucleotídeos especiais contendo "haptenos", como dinitrofenol, biotina ou digoxigenina. Os haptenos são moléculas que podem provocar uma resposta imune quando ligadas a moléculas maiores e, portanto, são alvos de ligação de anticorpos. Esses anticorpos de detecção são conjugados a enzimas, como a peroxidase de rábano ou a fosfatase alcalina, que catalisam reações químicas onde um corante fluorescente ou colorido pode ser depositado.

As técnicas tradicionais de hibridização in situ requerem a preparação de seções de tecido de um embrião para facilitar a detecção das estruturas internas. Como resultado, uma avaliação completa da expressão gênica em todo o organismo precisará ser reconstruída a partir das fatias de tecido de 5-6 μm com a ajuda de um software de computador. No entanto, com o desenvolvimento de técnicas de montagem completa, a análise da expressão gênica em distâncias maiores dentro de todo o embrião pode ser obtida.

Depois de examinar os princípios por trás da hibridização in situ de montagem inteira, vamos examinar o protocolo experimental passo a passo.

O primeiro passo neste procedimento envolve a identificação da sequência alvo no organismo modelo a ser investigado. A sequência de DNA alvo é então amplificada por PCR usando primers contendo sequências de iniciação de RNA polimerase. O molde de DNA amplificado agora é transcrito in vitro com nucleotídeos marcados com hapteno. Esta ribossonda marcada com hapteno está agora pronta para a etapa de hibridização.

Os embriões são preparados para hibridização por meio de fixação com formaldeído, um reagente de reticulação que estabiliza as proteínas e protege contra RNases. Após a fixação, o formaldeído é removido lavando o embrião várias vezes com solução salina tamponada com fosfato contendo uma pequena quantidade de detergente, como Tween. Para remover os lipídios celulares e facilitar a penetração da sonda nos tecidos, os embriões são desidratados em uma série graduada de lavagens com metanol, por exemplo: 25%, 50%, 75%, 100% de metanol. Os embriões podem ser preservados em 100% de metanol por até um mês (ou mais) a -20?C.

Para preparar os embriões para a hibridização, eles devem ser reidratados por uma série graduada de lavagens com metanol com progressivamente menos metanol por lavagem. Os embriões são então digeridos com uma protease para facilitar a difusão da ribossonda nos tecidos. A ribossonda marcada é adicionada ao embrião e a hibridização é realizada.

Lavagens pós-hibridização são realizadas para remover hibridizações inespecíficas. RNases A e T1 são adicionadas para remover sondas hibridizadas incompletas, digerindo RNA de fita simples. As sondas hibridizadas são detectadas com um conjugado anticorpo-enzima que se liga às riboprobinas marcadas com hapteno. Como mencionado anteriormente, enzimas como a fosfatase alcalina são conjugadas a anticorpos específicos do hapteno e são detectadas pela adição de substratos enzimáticos para provocar uma mudança de cor. O produto da reação forma um precipitado roxo escuro marcando a localização do mRNA expresso, como visto neste exemplo.

Agora que você sabe como fazer hibridização in situ de montagem inteira, vejamos algumas aplicações da técnica.

A hibridização in situ de montagem inteira tem sido usada para ajudar os cientistas a combater doenças mortais transmitidas por mosquitos, como malária, dengue e doença do Nilo Ocidental. Ao caracterizar os genes envolvidos na reprodução e desenvolvimento do mosquito, novos inseticidas biológicos ou químicos podem ser projetados para melhor direcionar os mosquitos transmissores da doença.

Outra aplicação dessa técnica envolve a caracterização de alterações no padrão de expressão gênica associadas à exposição a teratógenos, ou agentes que interferem no desenvolvimento fetal.

Aqui, a hibridização in situ de montagem inteira foi usada em um modelo de peixe-zebra da síndrome alcoólica fetal para identificar genes cujos padrões de expressão são alterados após a exposição ao álcool. Isso pode ajudar no desenvolvimento de terapias para mitigar as consequências da exposição ao álcool no útero.

A hibridização in situ de montagem total também pode ser usada para validar alterações fenotípicas associadas a doenças congênitas. Mutações associadas à síndrome de Bardet-Biedl foram introduzidas em embriões de peixe-zebra por meio de mRNAs mutantes produzidos sinteticamente. Após um período de tempo definido, os embriões foram divididos em grupos com base na gravidade dos defeitos. A visualização da expressão de genes a jusante do gene mutado foi usada para validar as alterações fenotípicas. Assim, a hibridização in situ de montagem total em combinação com a pontuação fenotípica pode facilitar uma melhor compreensão dos papéis de mutações específicas subjacentes aos defeitos de desenvolvimento.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre hibridização in situ de montagem inteira. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que permite a caracterização temporal e espacial precisa da expressão gênica dentro de um organismo. A hibridização in situ de montagem inteira está sendo usada atualmente para gerar um atlas de padrões de expressão gênica durante o desenvolvimento em uma infinidade de organismos modelo. Esses estudos podem facilitar o desenvolvimento de novas terapias para tratar doenças humanas, incluindo o câncer. Obrigado por assistir!