Name: Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a descrever a regulação do transcriptoma de microRNAs por fatores de transcrição usando mineração de dados, shRNA e análise bioinformática. Este método integra múltiplas fontes para compreender a dinâmica da transcrição gênica.

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação CLL Global Research. A Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde através de um Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA16672).

1. Identificar fator de transcrição Sites obrigatório em promotora dos genes microRNA utilizando a abordagem de Mineração de Dados <ol><li> Use o navegador do genoma da Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC) para extrair dados de imunoprecipitação (CHIP) sequenciação de cromatina gerados como parte da Enciclopédia de projeto elemento de DNA (ENCODE). <ol><li> Abra o navegador da tabela no navegador genoma UCSC. </li><li> Use as seguintes especificações para extrair a tabela: Clade: (mamíferos), genoma: (Humana), Assembly: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), o grupo: (regulamento), da faixa (TxnFactorChIP), tabela: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), região : (Genoma), formato de saída (todos os genes da tabela selecionada). </li><li> Salvar a saída do 1.1.2 como um arquivo .txt e em uma planilha. </li><li> Classificar e filtrar para o factor de transcrição de interesse (por exemplo, STAT2). </li></ol></li><li> Use a lista de promotores de microRNA com base em H3K4me3 epigenética assinatura disponível em Baeer et al. 9 </sup&gt;. Copie esta lista em um arquivo .txt. </li><li> Para corresponder de acordo com as coordenadas sobre o genoma humano, mapear os dados de 1.1 e 1.2 (por exemplo, STAT3 vinculativa para os promotores de microRNA putativos) e determinar a afinidade de ligação mediana usando o código escrito em C sharp, conforme descrito no suplemento de codificação de arquivos 1. </li></ol> 2. Utilização de shRNA para sub-regular a expressão de um factor de transcrição de interesse <ol><li> Placa de 1,5 x 10 6 células de linha celular 293 de rim embrionário humano em placas de 10 cm a cerca de 50% de confluência (DMEM com FBS a 10%). </li><li> transfectar células de linha 293 de rim embrionário humano de células com 5 ug de proteína de fluorescência verde lentivírus (GFP) contendo shRNA dirigido para o factor de transcrição de interesse e com 5 ug de vectores de embalagem usando o reagente de transfecção para células aderentes de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Como um controlo, transfectar as células de linha 293 de rim embrionário humano com célulasshRNA mexidos e os vectores de embalagem de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Mantenha a mistura de transfecção em células durante 16 h (a 37 ° C, incubador de CO2), em seguida mudar para meios frescos 10 ml de 10% de meio DMEM com FBS a 10%. </li><li> Esperar 48 horas pós transfecção, centrifugar a cultura de células (300 x g, 5 min) e recolher o sobrenadante infecciosa. Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 mm (25 mm de agente tensioactivo livre de celulose membrana de etilo) para remover quaisquer células flutuantes. </li><li> Concentra-se o sobrenadante e recolher o lentivírus utilizando um dispositivo de filtro de ultra-centrifugaï¿½o com limite de 100 kDa. Centrifugação a 950 xg durante 30 - 60 min, até que o volume foi concentrado para menos de 250 ul. Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C. </li><li> Transfectar as células com o lentivírus. Remover lentivírus congelado de -80 ° C congelador e descongelar até à temperatura ambiente. Transferir 100 ul de sobrenadante virai para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco. <ol><li> Bring-se o volume dentro do tubo para 1 ml com meio de soro reduzido. Adiciona-se brometo de hexadimetrina a 1 ml de suspensão de vírus para concentração final de 10 ng / mL, misturar suavemente e deixe a mistura repousar durante 5 min. </li></ol></li><li> Centrifugar 5 x 10 6 células para cada transdução suavemente e ressuspender o sedimento de células em 0,5 ml de meios contendo vírus. Deixe que as células permanecem na incubadora durante 4-24 h, depois adicionar 0,5 ml de meio com FBS a 20% a uma concentração final de 10% de FBS. </li><li> Esperar 48 a 72 h e corar as células com iodeto de propídio (PI) e proteína fluorescente verde (GFP) de acordo com as instruções do fabricante. Proteger as células da luz e usar um classificador FACS para medir as taxas de GFP + / PI - células. Desde manchas PI única célula morta, esta taxa é uma estimativa da eficiência de transfecção em células vivas. </li><li> Classificar a população de células positiva para a expressão GFP (GFP +) por FACS classificador como descrito anteriormente 10. </li><li> Use Westeblotting imunológico RN como anteriormente descrito 10 para determinar os níveis de um factor de transcrição de interesse antes e depois de infectar as células de interesse (por exemplo, células CLL) com shRNA designado. </li></ol> 3. Determinar o nível de expressão de MicroRNA transcriptoma em células transfectadas com Fator de Transcrição-shRNA <ol><li> Isolar ARN utilizando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Rotular o ARN e que hibridizam para microARN microarray 11. </li><li> Determine o microRNA diferencialmente expressos em células transfectadas com transcrição fator-shRNA ou com controle de vetores vazios 5. </li><li> Validar os resultados de microarranjos para os microRNAs mais diferencialmente expressos usando PCR em tempo real 5. </li></ol> 4. Determinar a sobreposição entre a Bioinformática ea Abordagem shRNA Ao descrever o transcriptoma Dependente Fator de Transcrição <ol><li> para detArminho as proporções esperadas e observadas de genes microRNA que abrigam fator de transcrição sites em seus promotores vinculativo e foram reprimidos na transcrição fator-shRNA células transfectadas, faça o seguinte: <ol><li> Obter a razão de genes que abrigam o factor de transcrição de interesse no seu promotor microARN / total a partir do lista gerada no ponto 1.3. Esta lista é a proporção esperada (por exemplo, genes microRNA com sítios de ligação de STAT3 genes microRNA / total testado = 0,25). </li><li> Determinar o número de genes que foram regulados negativamente em células transfectadas factor de transcrição-shRNA da lista gerada em 3.3 e tem factor de transcrição de locais de ligação de interesse a partir da lista gerada no ponto 1.3. Este número / número total de genes regulados negativamente é a proporção observada (por exemplo, os genes microRNA STAT3 com sítios de ligação / número total de microARNs downregulated = 0,6). </li></ol></li&gt; <li> Use χ2 estatísticas para comparar as proporções observadas e esperadas que foram gerados acima e determinar se a lista de genes que foram regulados negativamente em células transfectadas factor de transcrição-shRNA são enriquecidos com locais de ligação de factor de transcrição no seu promotor. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O mecanismo subjacente a ARN polimerase II dependente de transcrição de genes codificadores de proteínas tem sido extensivamente estudada. Embora estes elementos constituem apenas 1% - 2% do genoma humano, a evidência do projecto CODIFICAR sugerem que mais de 80% do genoma humano podem ser submetidos a transcrição 17 e que regula a transcrição dos elementos de ADN não codificantes permanece largamente desconhecido 6 . Vários estudos, o que indicava que Pol II é também r...

MicroRNAs são endógenos RNAs reguladores não codificação pequenas que normalmente funcionam como reguladores negativos de expressão do mRNA ao nível pós-transcricional. Aproximadamente 1000 não codificadora de 20 a 25 nucleótidos de comprimento microARNs são encontrados no genoma humano 1,2. MicroRNAs regular a expressão do gene através de emparelhamento de bases entre a sequência canónica de sementes do microARN e a sua sequência complementar jogo semente, que é normalmente localizado na região 3 &#39;não traduzida (UTR) dos mRNAs alvo. Colectivamente, microARNs regular mais de 30% dos genes codificadores de proteínas 3, mas apenas pouco se sabe sobre a transcrição a partir de ADN de microARNs. Tem sido sugerido que a regulação da transcrição microARN é semelhante à do ARNm de 4,5. Em particular, semelhante à sua actividade na promoção da transcrição de genes codificadores de proteínas, factores de transcrição são pensados ​​para activar a transcrição de microARNs 6. Factor de transcrição-microRNA interação tem sido relatada como um fator modulador da expressão do gene 7, e podem também formar feed-back e loops de feed-forward. Por exemplo, Yamakuchi et ai. Relataram um circuito de retroalimentação em que p53 induz a expressão de microRNA34a, que por sua vez inibe a tradução do SIRT p53 repressor e aumentando desse modo a actividade de p53 8. Considerando que exemplos específicos de expressão dependente de factor de transcrição de microARNs têm sido relatados, um método aceite, o qual fornece informações sobre a forma como um factor de transcrição de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma é inexistente. O objectivo do protocolo aqui sugerida é a de fornecer uma descrição detalhada da transcrição dependente de factor de regulação do microARN-transcriptoma. Ao combinar os dados publicamente disponíveis, ferramentas de bioinformática e utilizando tecnologia de microarray, os pesquisadores que seguem este algoritmo seria capaz de capturar em uma escala genômica como qualquerfactor de transcrição de qualquer tipo de células de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma e para explorar uma contribuição putativo do factor de transcrição-regulação da expressão de ARNm em microARN.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m filtro de seringa</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de filtro ultracentrífugo Amicon com limiar de 100&nbsp; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagente</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td> <td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Linha celular humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

descrevendo um regulamento dependente fator de transcrição do microrna transcriptoma

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Enquanto a regulação da transcrição de genes codificadores de proteínas foi extensivamente estudado, pouco se sabe sobre a forma como factores de transcrição envolvidos na transcrição de ARN não-codificantes, especificamente de microARNs. Aqui, propomos uma estratégia para estudar o papel potencial do fator de transcrição na regulação da transcrição de microRNAs usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento. Nós usamos a assinatura epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microRNA e cromatina imunoprecipitação (CHIP) dados -sequencing do projeto ENCODE para identificar promotores de microRNA que são enriquecidos com sítios de ligação de factor de transcrição. Por células de interesse com shRNA alvo um factor de transcrição de interesse e submetendo as células a matriz microRNA transfecção, estudamos o efeito deste factor de transcrição sobre o transcriptoma microRNA. Como exemplo ilustrativo usamos nosso estudo sobre o efeito da STAT3 no transcriptoma microRNA de ly crônicaleucemia mphocytic (CLL) células.

STAT3 é um factor de transcrição que normalmente induz a transcrição de genes que têm efeitos anti proliferativos 12 e apoptótica. Se STAT3 também afetam o transcriptoma RNA não-codificante é actualmente desconhecida. Em todas as células CLL STAT3 é constitutivamente fosforilada na serina 707 resíduos 10,13. Fosfosserina STAT3 serviços de transporte para o núcleo, se liga ao DNA e activa genes conhecidos por ser activada por tirosina pSTAT3 em outros tipos de célula...

Aqui propomos uma estratégia para estudar o efeito de um fator de transcrição de interesse no transcriptoma de microRNA usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento de matrizes de microRNA após a transfecção de células com pequeno hairpin (sh)RNA visando um fator de transcrição de interesse.

Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

O objetivo geral desta metodologia é descrever como um fator de transcrição de interesse regula o transcritoma de microRNAs. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre se fatores de transcrição que modulam a transcrição de genes codificadores de proteínas também estão envolvidos na transcrição de microRNAs. A principal vantagem desta metodologia é que ela integra mineração de dados, dados laboratoriais e análise bioinformática para fornecer uma descrição abrangente das transcrições de genes de microRNA dependentes da atividade do fator de transcrição de interesse.Embora este método possa fornecer informações sobre a interação entre a transcrição de genes de microRNA e a atividade do estado do fator de transcrição, é importante lembrar que este é um método descritivo e que a confirmação de tal associação deve ser realizada utilizando ensaios adicionais. Para começar, abra um navegador de genoma, como o navegador de genoma da Universidade da Califórnia em Santa Cruz, a fim de extrair dados de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina. Uma vez no site, vá até o menu superior, selecione Ferramentas e abra o Navegador de Tabelas.Insira as especificações, conforme mostrado aqui, nos campos correspondentes e, em seguida, selecione Obter Saída para extrair a tabela. Salve a saída como um arquivo de texto. Depois, importe o arquivo para uma planilha.Uma vez no programa de planilha, ordene a coluna de nomes e filtre os resultados por um fator de transcrição de interesse, como STAT2. Em seguida, copie a lista de promotores de microRNA com base em sua assinatura epigenética H3K4me3 e cole a lista em um arquivo txt. Depois, utilize o código suplementar escrito em SQL e fornecido nos arquivos de dados suplementares para mapear os dados coletados e determinar a afinidade mediana de ligação.Primeiro, adicione 1,5 milhão de células HEK293 a uma placa de 10 centímetros e acrescente DMEM suplementado com 10% de FBS. Incube as células por 24 horas até que atinjam cerca de 50% de confluência. Em seguida, substitua o meio de cultura.Em seguida, adicione um agente de transfeção combinado com cinco microgramas de uma proteína fluorescente verde Lentivírus contendo o shRNA alvo e cinco microgramas de vetores de empacotamento, conforme as instruções do fabricante. Como controle, realize a transfeção de uma placa idêntica de células utilizando shRNA aleatório (scrambled) e os vetores de empacotamento. Incube a mistura de transfeção com as células por 16 horas e, em seguida, troque o meio para 10 mililitros de meio DMEM fresco suplementado com 10% de FBS.48 horas após a transvecção, remova o meio das células. Em seguida, centrifugue por cinco minutos para coletar o sobrenadante infeccioso. Filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 mícron para remover quaisquer células em suspensão.Em seguida, adicione o meio a um dispositivo de filtro ultracentrífugo com limite de 100 quilodaltons. Centrifugue o meio para concentrar o lentivírus até que o volume seja inferior a 250 microlitros. Transfira o líquido restante para um criotubo e armazene o vírus concentrado a menos 80 graus Celsius até o momento de uso.Quando estiver pronto para continuar, retire o Lentivírus congelado do freezer a menos 80 e leve o frasco à temperatura ambiente. Transfira 100 microlitros do sobrenadante viral para um tubo microfuge novo de 1,5 mililitro e adicione 900 microlitros de meio sem soro. Em seguida, adicione 10 nanogramas por mililitro de brometo de hexadimetrina à suspensão viral de um mililitro.Agite suavemente o tubo e deixe a mistura em repouso por cinco minutos. Recolha cinco milhões de células para cada transdução planejada e, em seguida, re-suspenda suavemente o pellet celular em 0,5 mililitros de meio contendo o vírus. Transfira as células para uma placa de 12 poços e incube-as por quatro a 24 horas.Em seguida, adicione 0,5 mililitros adicionais de meio contendo 20% de FBS. Entre 48 e 72 horas após a transdução, colete as células e as marque com iodeto de propídio de acordo com as instruções do fabricante. Após a marcação, proteja as células da luz e utilize um citômetro de fluxo para estimar a eficiência de transdução mediante a medição das taxas de células positivas para GFP e negativas para iodeto de propídio.Em seguida, colete a população celular positiva para GFP classificada e extraia suas proteínas. Por fim, utilize o método de western blotting para determinar os níveis do fator de transcrição alvo antes e após a infecção das células com o shRNA designado. Após a transfeção de células de LLC com shRNA para STAT3, os níveis de mRNA de STAT3 e da proteína STAT3 diminuíram significativamente.Além disso, um arranjo de microRNA das células de LLC mostrou 23 microRNAs cuja expressão diferiu significativamente entre as células de LLC transfectadas com shRNA para STAT3 e as células de LLC transfectadas com um vetor vazio. Os resultados do arranjo de microRNA foram validados para sete dos genes, mostrados aqui, utilizando RT-PCR quantitativa. Após este procedimento, outros métodos como imunoprecipitação de cromatina, ensaio de mobilidade eletroforética e um ensaio de diferença podem ser realizados para validar que este fator de transcrição se liga e ativa o promotor de um gene espelho específico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como integrar análises de bioinformática, dados disponíveis publicamente e o silenciamento de um fator de transcrição utilizando a abordagem de shRNA para descobrir como esse fator de transcrição regula a expressão de genes de microRNA.

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Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções...

Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria

Nós apresentamos uma combinação de microscopia de Cryo-electron, nanotecnologia lipídica, e a análise da estrutura aplicada para resolver a estrutura ligada a membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas: humana e porcina. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal as duas formas FVIII recombinante funcionais em nanotubos de lipídios negativamente carregados (LNT) é descrito.

Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

Descrevemos aqui métodos simples para a preparação de vesículas, o encapsulamento de transcrição e maquinaria de tradução, e o controlo da produção da proteína. Os sistemas isentos de células resultante pode ser utilizado como um ponto de partida para a construção de imitadores celulares cada vez mais complexas.

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

Aprenda a descrever a regulação do transcriptoma de microRNAs por fatores de transcrição usando mineração de dados, shRNA e análise bioinformática. Este método integra múltiplas fontes para compreender a dinâmica da transcrição gênica.

Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma

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