Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

O presente relato descreve um ensaio enzimático in vitro para medir a atividade da fosfatidiletanolamina metiltransferase usando extratos de células de Leishmania. Este ensaio é baseado na transferência de um grupo metil radioativo de S-[^Metil-3H]adenosil-L-metionina para fosfatidiletanolamina endógena.

O objetivo geral desta metodologia é quantificar a atividade da fosfatidiletanolamina metiltransferase ou PEMT de extratos de células inteiras. Neste método, podemos responder a questões-chave no campo do metabolismo lipídico, como a importância das metiltransferases de fosfatidiletanolamina na biossíntese de fosfatidilcolina. A principal vantagem deste protocolo é que ele pode ser medido a partir do extrato de células inteiras e não requer purificação da enzima.

Portanto, este protocolo pode fornecer algumas informações sobre como os parasitas sintetizam seu lipídio mais abundante, a fosfatidilcolina. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tipos de células, como células de mamíferos e bactérias. Crescimento de células de Leishmania em frasco plástico estéril selado com tampa hermética a 26 graus Celsius em meio M199 suplementado sem agitação.

Colha as células por centrifugação a 1500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Quando atingem uma densidade celular de 10 a 20 milhões de células por mililitro. Depois de remover o sobrenadante com uma pipeta, lave as células ressuspendendo o pellet celular com uma pipeta sorológica na metade do volume da cultura de solução salina tamponada com fosfato frio.

Centrifugue as células novamente a 1550G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante com uma pipeta. Prossiga para a próxima etapa ou congele o pellet celular em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, suspenda novamente o pellet celular em um tampão de lise 2X de volume igual. Adicione 1X volume de contas de vidro e vortex vigorosamente a quatro graus Celsius por 10 minutos. Adicione dois volumes de tampão de lise 1X e misture.

Em seguida, centrifugue os extratos celulares a 1500G e quatro graus Celsius por 10 minutos para granular células e núcleos inteiros. Transferir o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de centrifugação fresco e fresco e manter os extractos celulares congelados até à conclusão da experiência. Adicione dois microlitros de extratos celulares a um mililitro de solução de ácido bicinconínico e duplique.

Incube os padrões e amostras de proteína por 10 minutos em banho-maria pré-aquecido a 60 graus Celsius. Transfira as amostras para o gelo por três minutos. Medir os absorventes nos padrões e as amostras de proteínas com um espectrofotómetro no comprimento de onda de 562 nanómetros.

Calcular a concentração proteica dos extractos celulares utilizando como referência o padrão de albumina de soro bovino, tal como descrito no protocolo do fabricante. Dilua os extratos celulares a uma concentração de proteína de 10 miligramas por mililitro com tampão de lise 1X. Em uma coifa química, teste cada amostra e duplique em um tubo cônico de 15 mililitros.

Prepare 20 microlitros de um molar TrisHCL PH 7,5 por tubo e mantenha-o no gelo. Prepare também dois mililitros de solução de parada de metanol de clorofórmio em temperatura ambiente para cada tubo. Pipete 20 microlitros do TrisHCL de um molar em cada tubo cônico de 15 mililitros no gelo.

Em seguida, seguindo as diretrizes de segurança de radiação, no equivalente a zero vírgula zero zero seis micromolares tritiadas SAM e 50 micromolares frio SAM por tubo para um total de 50 vírgula zero seis micromolares SAM. Neste ponto, adicione um volume de água fria por tubo que foi calculado de acordo com o protocolo de texto. Transfira cada tubo cônico para um banho-maria pré-aquecido a 30 graus Celsius.

Adicione 20 microlitros de extratos celulares a cada tubo para iniciar a reação. Incube as amostras pelo tempo desejado. Pare a reação adicionando dois mililitros de metanol de clorofórmio a cada tubo.

Transfira os tubos cônicos para a temperatura ambiente. Trabalhando em uma coifa química, adicione 700 microlitros de água a cada tubo contendo a amostra de reação enzimática. Vortex vigorosamente por 30 segundos.

Em seguida, centrifugue a 1500g por cinco minutos em temperatura ambiente para separar a fase orgânica da aquosa. É crítico, ao transferir a fase inferior, não tomar nenhuma parte da fase aquosa, pois isso influenciará o cálculo do ensaio. Use uma pipeta para transferir a fase orgânica inferior para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione um mililitro de água a cada fase inferior contendo tubo e vórtice vigorosamente por 30 segundos. Em seguida, centrifugue novamente a 1500G por cinco minutos para separar a fase orgânica da fase aquosa. Transferir a fase orgânica inferior para um tubo de cintilação com uma pipeta.

Secar as amostras sob uma corrente de gás azoto. Descarte as fases aquosas contendo o SAM radioativo não incorporado e os tubos cônicos radioativos de acordo com as diretrizes de radiação. Em seguida, adicione dois mililitros de líquido de cintilação por tubo.

Medir a radioactividade incorporada com um contador de cintilação de acordo com o protocolo do fabricante e os instrumentos utilizados. Calcule a atividade enzimática em nanomoles por miligrama de proteína usando a equação listada no protocolo de texto. Aqui é mostrado um ensaio PEMT dependente do tempo que foi realizado com extrato de células inteiras de Leishmania como fonte enzimática usando PE endógeno como substrato.

A quantidade de radioatividade na fase orgânica foi quantificada por contagem de cintilação e utilizada para calcular a quantidade de grupos metil tritiados transferidos para PE. A atividade do PEMT foi linear por aproximadamente 20 minutos. Em seguida, atingiu um platô em cerca de 30 minutos, após o qual permaneceu constante por mais 15 minutos. Como esperado, a atividade de PEMT não foi detectada quando nenhum extrato celular foi adicionado e foi detectada quando extratos celulares foram adicionados ao ensaio.

Além disso, essa atividade foi abolida na presença de brometo de octadeciltrimetilamônio 100 micromolar, que é um inibidor específico das metiltransferases de fosfatidiletanolamina majoritária LMJ PEM One e LMJ PEM two. A atividade do PEMT também foi dependente da concentração de proteína e essa atividade foi linearmente proporcional à quantidade de proteína aplicada para o ensaio enzimático. Por fim, foi realizado um ensaio de PEMT dependente da concentração de SAM, no qual foram testadas concentrações crescentes de SAM.

A atividade do PEMT atingiu um platô em uma concentração de SAM de aproximadamente zero vírgula cinco milimolares. Um mestre este protocolo pode ser realizado em três a cinco horas, dependendo do número de amostras. Ao tentar este protocolo, é muito importante usar o SAM adquirido recentemente, pois este composto é instável.

Não se esqueça de que, trabalhar com patógenos e radioatividade pode ser extremamente perigoso. Portanto, é importante seguir as diretrizes de segurança e usar equipamentos de laboratório adequados.