Name: Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e In Utero A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a técnica de eletroporação in utero para transfecção específica de regiões do sistema nervoso central em camundongos C57BL/6. Este método permite manipulação celular rápida sem gerar animais geneticamente modificados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Técnico apoiado por Melanie Pfeifer e Nikolai Schmarowski (Instituto de Anatomia Microscópica e Neurobiologia, Centro Médico Universitário de Mainz).

Declaração de Ética: A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as directrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais. 1. In Utero Eletroporação Nota: No útero electroporação foi realizada como publicado anteriormente 12,14. Portanto, o método só é descrito resumidamente a seguir (Figura 1). <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar a solução rápida de cor verde livre de endotoxina avançada plasmídeo transfecção-grade (contendo 1,5 pCAGGS), como descrito anteriormente 12. </li><li> Puxe e moer (35 ° de ângulo de capilares de vidro de borosilicato) (0,8-0,9 de diâmetro) para injectáveis. </li><li> Esterilizar instrumentos. </li></ol></li><li> Cirurgia <ol><li> Administrar analgésicos (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, sc, 24 h) depósito, pelo menos, 30 min antes de iniciar a cirurgia. </li><li> Manter o comprimento dea anestesia para um máximo de 35-45 min (fase III - fase de anestesia cirúrgica de acordo com a Guedel 15 - máximo de 25-30 min). </li><li> Anestesiar ratos cronometrados grávidas com isoflurano (indução de uma câmara de: 2,8%, a cirurgia por máscara: 2,5%). Confirme anestesia por falta de resposta aos pés-pitada. </li><li> Aplicar pomada para evitar a secura ocular durante a anestesia. </li><li> Esterilizar a área cirúrgica com 7,5% de solução providona-Iodo e cobrir o mouse com gaze estéril (úmido com solução salina 0,9% benzilo álcool), com apenas a área cirúrgica exposta. </li><li> Cortar abrir a cavidade abdominal com um bisturi (incisão na pele: 1.5-2 cm, incisão muscular: 1-1,5 cm). </li><li> Preserve a cavidade abdominal aberta de secar umedecendo com solução salina aquecida álcool benzílico a 0,9% ou outra solução isotônica estéril como dirigido por pessoal veterinário ou comitê. </li><li> Extrair cuidadosamente cornos uterinos (usando uma pinça de anel, não toque no útero com o dedos). </li></ol></li><li> A injecção de ADN e electroporação. Nota: Os detalhes exatos para segmentar regiões específicas são indicadas na secção 2. <ol><li> Injectar-se lentamente a solução de cor de ADN para o ventrículo como indicado na Figura 1 e da secção 2 através dos capilares de borosilicato preparados. </li><li> Aplique a tensão adequada para a fase embrionária correspondente (por exemplo., 36-38 V para E14) através de eletrodos especializados pinças-platina (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, intervalo de pausa 950 ms). As pás de electroporação de pulso durante a aplicação da tensão para minimizar os danos da parede uterina. </li></ol></li><li> Publicar eletroporação / cuidados pós-operatórios <ol><li> Recolocar cuidadosamente os cornos uterinos na cavidade abdominal. </li><li> Suturar o músculo e a incisão na pele separadamente. </li><li> Deixe o resto do mouse em um dispositivo de suporte térmico para a recuperação. </li><li> Supervisionar o mouse durante a recuperação (comportamento, alimentação econsumo de água), 4 horas, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. Se necessário, aplicar analgésicos adicionais (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, 24 horas depósito) para mais 2 dias. </li></ol></li></ol> 2. A transfecção de áreas cerebrais específicas Nota: A posição do pólo positivo é mostrado como o ângulo entre a linha de centro vertical através do ventrículo preenchido com a solução de ADN (o ventrículo direito ou terceira) e a posição do pólo positivo. Ao encher o ventrículo esquerdo as posições são invertidas-espelho. Na Figura 4 as posições da orelha primordial são mostrados, que fornecem importantes pontos de referência. <ol><li> A transfecção de áreas corticais (Figura 2A, a Tabela 1). <ol><li> Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de áreas corticais utilizar embriões E14. </li><li> Injectar 1,5-2 ul de solução de ADN-ADN contendo 4 ug no ventrículo lateral direitoatravés dos capilares de borosilicato preparados. <ol><li> Posicione cuidadosamente o embrião usando uma pinça anel de modo que não há vasos visíveis acima do local da punção. </li><li> Injectar-se lentamente a solução de DNA de aproximadamente 0,75 mm coronal da sutura lambdoidal e 0,5 mm lateral da sutura sagital (Figura 3). Certifique-se que a profundidade de inserção é de 1,2 mm (E14, medido a partir da parede uterina). Verifique se há uma coloração azul-verde com uma demarcação nítida. </li></ol></li><li> Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms). <ol><li> Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm. </li><li> Utilize uma tensão que varia de 36-38 V. </li><li> Colocar o centro dos eléctrodos apenas anterior dos primórdios da orelha. </li><li> Para transfectar os ângulos de uso córtex retrosplï¿½icos 330-0 °, para transfectar o córtex motor 0-40 °, para transfectar o córtex somatossensorial 40-95 °, para transfectaro córtex piriforme 95-110 ° (Figura 2A). </li></ol></li><li> Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões de 4 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3. </li></ol></li><li> A transfecção do hipocampo (Figura 2B, Quadro 1). <ol><li> Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de formação hipocampal utilizar embriões E15. </li><li> Injectar-2 uL de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados. </li><li> Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms). <ol><li> Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm. </li><li> Utilize uma tensão que varia de 38-40. </li><li> Colocar o centro do pólo negativo imediatamente anterior à orelha e o primórdio do centro Of o pólo positivo no meio de o primórdio da orelha. </li><li> Para transfectar as giro dentado usar ângulos de 190-210 °, para transfectar as Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, para transfectar as CA2 230-250 °, para transfectar as CA1 250-275 ° (Figura 2B). </li></ol></li><li> Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Análise após a formação do hipocampo completo (após o nascimento, p21) executar conforme descrito na seção 3. </li></ol></li><li> A transfecção do núcleo septal lateral e corpo estriado (Figura 2C, Tabela 1) Nota: Os ângulos de sobreposição com aqueles para transfecção do hipocampo. Para transfectar eficazmente o núcleo septal lateral e o corpo estriado sem transfecção hipocampo indesejado fases anteriores embrionárias (E12) tem que ser usado. <ol><li> Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação in utero do núcleo septal lateral e striathum usar embriões E12. </li><li> Injectar 1 ul de solução de ADN-contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados. </li><li> Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms). <ol><li> Usar um eléctrodo de 0,5 mm. </li><li> Use 33 V. </li><li> Colocar o centro dos eléctrodos ao nível dos primórdios da orelha. </li><li> Para transfectar os ângulos de uso do núcleo septal lateral 100-170 °, para transfectar as estriado 170-240 ° (Figura 2C). </li></ol></li><li> Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3. </li></ol></li><li> A transfecção do tálamo e hipotálamo (Figura 2D, Tabela 1) <ol><li> Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para o em Utero eletroporação do tálamo e hipotálamo uso de embriões E12-E13. </li><li> Injectar-1-1,5 ul de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral (esquerda ou direita) através de capilares de borosilicato preparados. Espera durante 2-3 min, até a solução se difunde para o terceiro ventrículo. Alternativamente injectar directamente no terceiro ventrículo. Nota: Isso melhora especificidade, mas pode causar uma taxa de sobrevivência diminuiu (de alto risco de danos). </li><li> Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms). <ol><li> Usar um eléctrodo 0,5 ou 3 mm. </li><li> Utilize uma tensão que varia de 33-35 V. </li><li> Colocar o centro dos eléctrodos apenas posterior os primórdios da orelha. </li><li> Para transfectar os ângulos de utilização a partir de 25-40 ° tálamo, para transfectar o hipotálamo 90-180 ° (Figura 2D). </li></ol></li><li> Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios como descrita no ponto 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3. </li></ol></li></ol> 3. Perfusão Fixation <ol><li> Preparativos <ol><li> Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C. </li><li> Encha uma seringa de 50 ml com PBS (4 ° C) e uma segunda seringa aquecido com PFA. Evite bolhas. </li><li> Conecte as seringas a uma torneira de três vias. Conecte o terceiro fim a um conjunto de infusão voada (borboleta). </li><li> Lave o conjunto de infusão voado com PBS. </li></ol></li><li> Perfusão <ol><li> Profundamente anestesiar os ratos (ou pós-natal grávida transfectadas) com aplicação subcutânea de cloridrato de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg). </li><li> Confirme o estágio de tolerância cirúrgico por falta de resposta aos pés-pitada. </li><li> Abra a cavidade abdominal logo abaixo da caixa torácica. </li><li> Corte cuidadosamente o diafragma. </li><li> Cuidadosamente abra a caixa torácica através de um corte na each local até a clavícula. </li><li> Inserir a ponta da borboleta para dentro da câmara do coração esquerdo (a partir do ápice do coração). </li><li> Corte o apêndice atrial esquerdo. </li><li> Lentamente perfundir o rato com PBS (aproximadamente 10 ml). </li><li> Alterne a torneira de três vias. </li><li> Perfundir o mouse com 5-10 ml PFA 4%. </li><li> Decapitar o mouse com uma tesoura e dissecar o cérebro começando no forame magno. Realize a dissecção como publicado anteriormente 16. </li><li> Postfixate o cérebro por 2 dias em PFA 4%. Manter os cérebros a 4 ° C no escuro. </li></ol></li></ol> 4. A imuno-histoquímica <ol><li> Gerar 70 um secções (por exemplo, com um vibratome). </li><li> Opcional: aumentar a fluorescência com coloração de anticorpos. <ol><li> Bloquear as secções durante 1 hora à temperatura ambiente (0,1-0,2% de Triton X-100, 5% de soro de cabra normal) </li><li> Incubar O / N com o anticorpo apropriado (anti-GFP, 1: 1000) </li><li> Lavar 3-5 Vezes com tampão de 0,1 M fosfato. </li><li> Incubar 3-5 h com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado (Alexa Fluor 488 anti-coelho-IgG conjugada, 1: 1000). </li><li> Opcional: contracoloração com 4-6-diaminodino-2-fenilindole (DAPI, 0,2 g / ml em tampão fosfato 0,1 M) durante 1 min. </li><li> Analise de fluorescência com um microscópio de fluorescência apropriado. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu ammonis 1-3, o giro denteado, o estriado, o núcleo septal lateral, o tálamo e o hipotálamo de camundongos C75BL/6. Com todas as informações fornecidas, este é o primeiro protocolo, que fornece todas as informações necessárias para recriar facilmente as transfecções dessas regiões cerebrais no camundongo C57BL / 6. As publicações anteriores são focadas principalmente apenas e...

Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes 1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos 4. Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregado negativamente é injectada num ventrículo. Durante o pulso eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao pólo positivo e, por conseguinte, a região transfectadas podem ser seleccionadas simplesmente alterando a posição do pólo positivo. Tem sido frequentemente demonstrado que várias regiões do sistema nervoso central pode ser TArgeted 3,5-8. Por exemplo, estudos recentes mostram transfecções específicos do hipocampo, córtex piriforme ou o estriado 9-11. No entanto, as informações sobre as posições adequadas são muitas vezes apenas mal padronizados e nem sempre são fáceis de transferir para diferentes linhagens de camundongos. A transfecção de certos estágios embrionários está longe de ser trivial. Muitos fatores influenciam deve ser levado em consideração ao escolher o set-up para específica in utero eletroporação. Em primeiro lugar, para transfectar de forma otimizada as respectivas fases embrionárias, é necessário o conhecimento sobre as tensões apropriadas. Altas tensões diminuir a taxa de sobrevivência, enquanto que baixas voltagens reduzem a eficiência de transfecção 2,3,12. Também o tamanho da pá eletrodo desempenha um papel crucial, porque o uso de pás de eletrodos que são demasiado grandes resultados em menor especificidade ou podem causar a morte devido ao carinho do ritmo cardíaco 4,12,13. O aplicadatensão e do tamanho e da posição do eletrodo de remo são as características mais importantes a considerar, mas também há outros fatores que influenciam o resultado da eletroporação, como a quantidade aplicada de solução de DNA. Nós desenvolvemos um protocolo detalhado que permite a transfecção rápido e eficiente de várias regiões do cérebro de C57BL / 6 rato 12. Neste protocolo de informação detalhada sobre as tensões para ser usado e o tamanho do eléctrodo de pá para uma maior especificidade é fornecido. Além disso, as informações sobre o ventrículo para ser preenchido, juntamente com as recomendações para a quantidade de solução de plasmídeo e a posição do eléctrodo é fornecido. A indicação das informações de posição detalhada em um mapa e de uma maior visualização destas posições permite específica simples e eficiente in utero eletroporação do córtex retrosplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme t,cornu Ammonis ele 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral, no tálamo e hipotálamo.

<table><tbody><tr><td>Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Capilares</td> de vidro borossilicato Addgene <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,8-0,9 mm de diâmetro)</td> <td>seriam Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Foreno)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td>Número de aprovação <td>da Pfizer GmbH</td><td>: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>pomada para os olhos (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>álcool benzílico a 0,9% solução salina</td><td>solução salina Farmácia do Centro Médico Universitário Mainz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gaze (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>sutura de seda perma-hand estéril Ethicon</td><td>Johnson & Pinça de anel Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>1/ 1,5 mm</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>pinça de anel 4,8/ 6 mm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>pinça de anel 2,2/ 3 mm</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Adson Serrilhada Reta 12 cm</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>ÍrisTesoura-Delicada Reta-Afiada/ Blunt 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Tesoura-Reta 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo NeedleHolder-com Lock-Tungsten Carbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Hot Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Micropette Extrator</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de platina 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0,5</td><td></td></tr><tr><td>eletrodos de platina 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Eléctrodos de platina 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Eléctrodos de platina 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

específicos do striatum cortex-, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus-, lateral septal nucleus- e<em&gt; in utero</em&gt; a electroporação em ratinhos c57bl / 6 mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

A eletroporação in utero é uma técnica amplamente utilizada para manipulação espaço-temporal rápida e eficiente de vários genes no sistema nervoso central de roedores. A superexpressão de genes desejados é tão possível quanto os estudos de perda de função mediados por shRNA. Portanto, oferece uma ampla gama de aplicações. A viabilidade de direcionar células específicas em uma área distinta aumenta ainda mais a gama de aplicações potenciais desse método muito útil. Para direcionar com eficiência regiões específicas, o conhecimento sobre as sutilezas, como o estágio embrionário, a voltagem a ser aplicada e, principalmente, a posição dos eletrodos, é indispensável.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado que permite a eletroporação in utero específica e eficiente de várias regiões do sistema nervoso central do camundongo C57BL/6. Em particular, é mostrado como transfectar regiões que se desenvolvem no córtex retroesplenial, no córtex motor, no córtex somatossensorial, no córtex piriforme, no cornu ammonis 1-3, no giro denteado, no estriado, no núcleo septal lateral, no tálamo e no hipotálamo. Para esta informação sobre o estágio embrionário apropriado, a voltagem apropriada para o estágio embrionário correspondente é fornecida. Mais importante ainda, um mapa de ângulo, que indica a posição apropriada do pólo positivo, é representado. Este protocolo padronizado ajuda a facilitar a eletroporação eficiente no útero, o que também pode levar a um número reduzido de animais.

A Figura 2, mostra exemplos para a específica in utero electroporação das regiões em desenvolvimento para o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu Ammonis 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral , o tálamo eo hipotálamo. Os resultados das transfecções são mostrados a seguir ao ângulo recomendado (Figura 2). Para melhor visualização dos ângulos in vivo a posição do eléctrodo (0,5 mm) também são exi...

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

O objetivo geral dessa manipulação celular in vivo é modificar especificamente células de determinadas regiões do sistema nervoso central, como o córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado, em camundongos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento e a função do cérebro, por exemplo, mediante a identificação de diferentes cascatas de sinalização e a determinação do grau de diferenciação celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a manipulação rápida e eficiente de diversos tipos celulares no sistema nervoso central, sem a necessidade do demorado processo de geração de camundongos geneticamente modificados.De modo geral, a demonstração deste método é útil, porque indivíduos novos neste procedimento frequentemente têm dificuldade em encontrar a posição correta do eletrodo, o que é crítico para a eletroporação específica. Para iniciar este procedimento, abra cirurgicamente a cavidade abdominal de um camundongo grávido anestesiado com um bisturi. Evite que a cavidade abdominal aberta seque, umedecendo-a com solução salina morna a 0,9% de álcool metílico.Em seguida, retire cuidadosamente os cornos uterinos utilizando uma pin&ccedil;a de anel. Depois, posicione um embri&atilde;o E14 de modo que n&atilde;o haja vasos vis&iacute;veis acima do local da pun&ccedil;&atilde;o. Para obter uma melhor visualiza&ccedil;&atilde;o, utilize um eletrodo de 5 mil&iacute;metros para localizar o &acirc;ngulo e a posi&ccedil;&atilde;o da &aacute;rea desejada no c&eacute;rebro para transfe&ccedil;&atilde;o.Para a eletroporação intraútero da área cortical, injete lentamente de 1,5 a dois microlitros da solução de DNA no ventrículo lateral esquerdo. E assegure-se de que a profundidade de inserção seja de um a dois milímetros, medida a partir da parede uterina. Em seguida, verifique a coloração azul-esverdeada com uma delimitação nítida.Para melhor visualização, utilize um eletrodo de 5 milímetros para localizar o ângulo e a posição do local desejado no cérebro para a transfeção. Em seguida, posicione o centro das pás do eletrodo de platina de três milímetros logo anterior às estruturas precursoras da orelha, e certifique-se de que elas não estejam posicionadas acima dos vasos ou da placenta. Posteriormente, aplique tensão para iniciar a transfeção.Para a eletroporação in utero da formação hipocampal, injete dois microlitros de solução de DNA no ventrículo lateral direito de um embrião E15. Em seguida, posicione o polo negativo das lâminas de eletrodo de platina de três a cinco milímetros logo anterior ao primórdio da orelha e o polo positivo no meio do primórdio da orelha. Depois, aplique uma voltagem para iniciar a transfeção.Para a eletroporação in utero do núcleo septal lateral e do estriado, injete um microlitro de solução de DNA no ventrículo lateral direito de um embrião E12. Em seguida, posicione os eletrodos de 5 milímetros no nível dos primórdios auriculares. Posteriormente, aplique tensão para iniciar a transfeção.Para a eletroporação in utero do tálamo e hipotálamo, injete um a 1,5 microlitros de solução de DNA no ventrículo lateral de um embrião entre E12 e E13. Em seguida, aguarde dois a três minutos para que a solução difunda até o terceiro ventrículo. Depois, posicione os eletrodos de 5 ou três milímetros logo posterior aos primórdios auriculares.Após isso, aplique uma voltagem para iniciar a transfeção. Este esquema mostra as posições apropriadas para os polos positivo e negativo ao transfectar áreas corticais. E este outro mostra as posições dos polos positivo e negativo para transfectar as formações hipocampais.As posições do polo positivo e negativo para transfeção do estriado e do núcleo septal lateral são mostradas aqui. E as posições apropriadas dos eletrodos para transfeção do tálamo e do hipotálamo são mostradas aqui. A especificidade da transfeção depende do tamanho do eletrodo.O aumento do tamanho da paleta do eletrodo reduz a especificidade da transfeção. Isso é especialmente evidente em estágios embrionários mais jovens, mas também visível em estágios embrionários tardios. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 15 minutos, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante manipular os embriões e as mães com grande cuidado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar regiões específicas do sistema nervoso central do camundongo Black 6.

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Este artigo descreve em pormenor um protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo em E14.5 em ratinhos. Mostramos também que este é um método valioso para estudar dendritos e espinhas nessas duas regiões cerebrais.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica...

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Apesar da importância funcional e clínico do...

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Aprenda a técnica de eletroporação in utero para transfecção específica de regiões do sistema nervoso central em camundongos C57BL/6. Este método permite manipulação celular rápida sem gerar animais geneticamente modificados.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e In Utero A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse (Vídeo) | JoVE Journal

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e

Explorar mais vídeos