Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e In Utero A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

O objetivo geral desta manipulação celular in vivo é modificar especificamente as células de certas regiões do sistema nervoso central do córtex de camundongo, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o desenvolvimento e a função do cérebro, por exemplo, através da identificação de diferentes cascatas de sinalização e da determinação do nível de diferenciação celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a manipulação rápida e eficiente de vários tipos de células no sistema nervoso central sem a geração demorada de camundongos geneticamente modificados.

Geralmente, a demonstração desse método é útil, porque os indivíduos novos nesse método geralmente lutam para encontrar a posição correta do eletrodo, o que é crítico para a eletroporação específica. Para iniciar este procedimento, abra a cavidade abdominal de uma rata grávida anestesiada com um bisturi. Evite que a cavidade abdominal aberta seque, umedecendo-a com solução salina de álcool metílico morno a 0,9%.

Em seguida, extraia cuidadosamente os chifres uterinos usando uma pinça de anel. Em seguida, posicione um embrião E14 de forma que não haja vasos visíveis acima do local da punção. Para ter uma melhor visualização, use um eletrodo de 5 milímetros para localizar o ângulo e a posição da área desejada no cérebro para transfecção.

Para a eletroporação in utero da área cortical, injete lentamente 1,5 a dois microlitros da solução de DNA no ventrículo lateral esquerdo. E certifique-se de que a profundidade de inserção seja de um a dois milímetros, medida a partir da parede uterina. Em seguida, verifique se há coloração azul-esverdeada com uma demarcação nítida.

Para melhor visualização, use um eletrodo de 5 milímetros para localizar o ângulo e a posição do local desejado no cérebro para transfecção. Depois disso, coloque o centro das pás do eletrodo de platina de três milímetros logo antes dos primórdios da orelha e certifique-se de que elas não sejam colocadas acima dos vasos ou da placenta. Em seguida, aplique tensão para iniciar a transfecção.

Para a eletroporação in utero da formação do hipocampo, injete dois microlitros de solução de DNA no ventrículo lateral direito de um embrião E15. Em seguida, coloque o pólo negativo das pás do eletrodo de platina de três a cinco milímetros logo antes do primórdio da orelha e o pólo positivo no meio do primórdio da orelha. Em seguida, aplique tensão para iniciar a transfecção.

Para a eletroporação in utero do núcleo septal lateral e estriado, injete um microlitro de solução de DNA no ventrículo lateral direito de um embrião E12. Em seguida, coloque os eletrodos de 5 milímetros no nível dos primórdios da orelha. Em seguida, aplique tensão para iniciar a transfecção.

Para a eletroporação in utero do tálamo e hipotálamo, injete de um a 1,5 microlitros de solução de DNA no ventrículo lateral de um embrião E12 a E13. Em seguida, aguarde de dois a três minutos para que a solução se difunda no terceiro ventrículo. Em seguida, coloque os eletrodos de 5 ou três milímetros logo após os primórdios da orelha.

Depois disso, aplique tensão para iniciar a transfecção. Este esquema mostra as posições apropriadas para os pólos positivo e negativo para transfectar áreas corticais. E este, mostra as posições do pólo positivo e negativo para transfectar as formações hipocampais.

As posições dos pólos positivo e negativo para transfecção do estriado e do núcleo septal lateral são mostradas aqui. E as posições apropriadas dos eletrodos para transfectar o tálamo e o hipotálamo são mostradas aqui. A especificidade da transfecção depende do tamanho do eletrodo.

Aumentar o tamanho da pá do eletrodo reduz a especificidade da transfecção. Isso é especialmente óbvio em estágios embrionários mais jovens, mas também visível em estágios embrionários tardios. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 15 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante manusear os embriões e as mães com muito cuidado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar regiões específicas no sistema nervoso central do camundongo Black 6.