Name: Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em camundongos normais para induzir déficits cognitivos agudos sem estereotaxia. Este método acelera pesquisas em neurobiologia e descoberta de fármacos para Alzheimer.

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Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Coréia Saúde Tecnologia R &amp; D projeto através do Instituto Coreano Indústria Saúde para o Desenvolvimento (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar, República da Coreia (número de concessão: H14C04660000).

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicações No. 8023, revisto 1978) e com o Comitê de Cuidado e Uso do animal do Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de KIST (Seul, Coréia). 1. Preparação de animais <ol><li> Prepara-se uma grupo de ratinhos ICR machos com 7 semanas de idade (ou C57BL / 6). </li><li> Deixe os ratos passam por um processo de aclimatação para 3-7 dias após o transporte para restaurar a homeostase. Em geral, colocar um grupo de 4-5 ratos em cada gaiola, e mantê-las a 22-23 ° C e 40% de humidade, com um 12/12 h ciclo de luz / escuro. Fornecer água e comida ad libitum. Nota: O processo de aclimatação é fundamental para permitir a recuperação do stress da navegação e adaptação à nova moradia, alimentação, água e cheiro, bem como uma nova gaiola e ciclo de luz. Nesta experiência, os ratinhos foram alojados em gaiolas individualmente ventiladas (IVCS) localizados na SPEespe- Pathogen Free (SPF) instalação -grade </li><li> Pesar cada mouse e excluir indivíduos cujo peso se desvia ± 10% da média. </li><li> Divida os participantes em dois grupos: um grupo com injecção de veículo (Ap (-)) e um grupo de Ap-injetada (Ap (+)). Se a experiência é testar a eficácia de um fármaco candidato particular, dividir os ratos em quatro grupos: (1) Ap (-) / fármaco (-), (2) Ap (-) / droga (+), (3) Ap (+) / fármaco (-), e (4) Ap (+) / droga (+). </li></ol> 2. Ap Peptide Preparação <ol><li> Tratar os peptídeos Ap, derivados através de síntese química ou 5 a partir de fontes comerciais, com pré-refrigerada 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para dissolver quaisquer agregados e para tornar os péptidos homogéneas 6 . <ol><li> Sonicar a solução Ap / HFIP num sonicador de banho-maria durante 5 min (a temperatura ambiente), gentilmente vórtice, e incubar a solução durante 30 min à TA. Remover o HFIP completamente por meio de evaporação com azotoe armazenar o Ap homogénea à temperatura de -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Prepare os monómeros de Ap: (. 100 uM Aâ, 10% de DMSO, 90% de PBS) fazer um estoque Ap mM dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir 10 vezes em tampão fosfato salino (PBS) </li><li> Prepare oligômeros de Ap. <ol><li> Incubar a solução de monómero de Ap (contendo Ap (1-42) ou de Ap (1-40)) (passo 2.2.) A 37 ° C durante 3 ou 7 dias, respectivamente. </li><li> Coloque a solução de Ap num tubo selado num saco de zíper contendo uma toalha de papel húmido para proporcionar um ambiente humidificado para evitar a evaporação de água durante o período de incubação. </li></ol></li><li> Confirmar Ap oligómeros preparados por meio de electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com ligação cruzada foto-induzido de proteínas não modificadas 6. </li><li> Preparar a solução de PBS de controlo contendo 10% de DMSO para a injecção ICV veículo. </li></ol> 3. Seringa Preparação </p&gt; <ol><li> Prepare uma micro com uma agulha de aço inoxidável 26 G para injecção ICV. </li><li> Esterilizar a seringa na autoclave com todos os outros aparelhos, que vai ser usado para o procedimento cirúrgico. Depois de o autoclave, colocar o aparelho sob a luz UV durante 20 min. </li><li> Enrole a agulha da microseringa com Parafilm para ajustar o seu comprimento até 3,8 mm, para permitir a máxima precisão na profundidade da injecção para dentro do cérebro (Figura 1A). (Para ratinhos B6, ajuste agulha de seringa de 3,6 mm). Nota: A compressão do Parafilm conduzirá à profundidade da injecção superior a 3,6 milímetros ventral. Para evitar que o Parafilm de ser comprimida durante a inserção da agulha, densamente envolver a agulha várias vezes. </li><li> Lavar o espaço interior da seringa com 70% etanol, duas vezes. </li><li> Sonicar a seringa e a agulha num sonicador de banho-maria durante 30 min à TA. </li><li> Lavar o espaço interior da seringa com 70% etanol, duas vezes. </li><li> Lavar a seringacom água destilada e seca-lo completamente numa hotte durante mais de 30 min. Deixar a seringa limpa sob uma luz UV durante 20 min antes de iniciar a injecção de Ap. </li></ol> 4. Ap-injetada mouse Preparação Modelo Nota: Limpar o campo operacional com um desinfectante para manter condições estéreis e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos para injecção ICV usando 70% de etanol e exposição aos raios UV. <ol><li> Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma mistura de xilazina (20 mg / kg) e tiletamina HCl / zolazepam HCl (80 mg / kg) antes da injecção ICV. Posicione o mouse sobre um tapete quente para manter a sua temperatura corporal, enquanto anestesiados e confirmar anestesia adequada, avaliando a resposta do pé-pitada. </li><li> Aplicar PBS estéril cai para ambos os olhos para evitar a secura da córnea durante o procedimento (Figura 1B). </li><li> Prepare dois espelhos desenhando várias linhas retas verticais em suas superfícies em caso de difficuLTY injectando a seringa perpendicularmente. </li><li> Coloque um espelho (M1) mesmo ao lado do corpo do mouse eo outro (M2) na frente da cabeça. Manter M1 paralela à linha média imaginária entre os dois olhos do rato e providenciar a M1 M2 perpendicular, de modo que os dois planos formam um ângulo de 90 ° (Figura 1C). Coloque M1 no lado esquerdo do mouse se o pesquisador é destro. Coloque M1 no lado direito do mouse, se o pesquisador é canhoto. </li><li> Spray de etanol a 70% para o meio da testa do mouse e esfregue-o com cotonetes secos. Não molhar muito grande de uma área da testa para evitar a diminuição da temperatura do corpo devido a evaporação do álcool. </li><li> Limpe a mesma área na testa com uma solução de clorexidina a 2% utilizando um cotonetes limpos. scrubbings repetida com álcool e de cloro para o total de três vezes cada. Nota: Se necessário, raspar o cabelo na testa do mouse, a fim de minimizar a possidade de contaminação </li><li> Localize bregma. <ol><li> Usando o polegar eo dedo indicador, firmemente mantenha a pele da testa, logo acima dos dois olhos, a ponto de ambos os olhos salientes. Arraste a pele de volta para fazer a testa tenso e minimizar os movimentos do crânio sob a pele. </li><li> Formar um triângulo invisível através da atribuição de três vértices: os dois olhos do rato e do ponto onde o polegar eo dedo indicador se encontram, o bregma. (Figuras 1B, seta vermelha: bregma) </li></ol></li><li> Localizar o ponto de injecção com fita de medição: ± 0,06 -1,0 mm posterior ao bregma, 1,8 mm lateral ± 0.1 para a sutura sagital, e 2,4 mm de profundidade (Figura 1D, estrelas azuis: pontos de injecção em cada hemisfério). (Para ratinhos B6: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral, e 2,2 mm de espessura) </li><li> Encher a seringa com 10 ul de solução de Ap ou veículo com a solução em excesso, a fim de evitar a injecção de ar acidental. </li><li> Coloque a seringa no thalínea e injeção (descrita no protocolo 4.7). Adicione a seringa perpendicular ao plano do ponto de injecção. Alinhar reflectida imagens da seringa em ambos os espelhos com as linhas traçadas nos espelhos de uma perspectiva fixo (Figura 1C). </li><li> Comece a inserção da agulha até que a embalagem atinge a pele parafilme. </li><li> Manter a seringa segurando a mão firme e usar outro lado para injectar 5 ml da solução de Ap ou veículo, lentamente ao longo de 5 segundos sem pausa. Certifique-se a seringa permanece perpendicular por toda parte. Depois de completar a injecção, aguarde 3 a 5 segundos antes de retirar a seringa para a difusão. </li><li> Assumindo a posição de triângulo original, exercer uma pressão moderada para proteger o crânio de quaisquer movimentos desnecessários. Retire a seringa sem inclinação. </li><li> Posicione o mouse Ab-injectado na almofada quente para a recuperação e manter sua decúbito esternal. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele recupera a consciência e não devolver o mOuse a uma gaiola contendo os ratos não-cirúrgico até que ele se recuperou totalmente. </li><li> Lava-se a seringa de acordo com os passos 3,3-3,6. </li><li> monitorar No pós-operatório a mobilidade dos ratinhos e verificar se há qualquer sinal de infecção ou doença nos ratos por 5-7 dias. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53308/53308fig1.jpg" /> Figura 1. Injection Aâ na região do ICV (A) agulha da seringa Parafilm envolto em comparação com uma agulha de seringa sem modificações.; (B) PBS gotas para os olhos para evitar a secura; o triângulo formado na testa de rato com o polegar, o dedo indicador, e os dois olhos de rato, bem como a linha média imaginária equidistante de cada olho; (C) dois espelhos (M1 e M2) com múltiplas linhas verticais desenhadas nas superfícies para ajudar perpendicular injeção da agulha da seringa; (D) o triângulo com os pontos de injeção, indicated como estrelas azuis (-1,0 ± 0,06 mm do bregma e 1,8 ± 0,1 milímetros sagital) em cada hemisfério do rato; Seta verde: parafilme, seta vermelha: bregma <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53308/53308fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Confirmação de Ap Injection por Y-labirinto e Análises do cérebro <ol><li> Avaliar a memória de trabalho de ratos Ap-injetados por meio de testes Y-maze 3,7,8 <ol><li> Esperar 3 dias após a injecção para o aparecimento de défices de memória. </li><li> Realizar os testes Y-maze usando um labirinto de plástico preto, com três braços idênticos marcados A, B, e C, cada um dos quais se ramifica num ângulo a partir do centro do labirinto 120 ° (largura x comprimento x altura, 10 cm x 40 cm x 12 cm). </li><li> Coloque um mouse no braço de partida (braço A) e permitir que o sujeito a explorar livremente o labirinto de 8 min. </li><li> Medir o número de entradas em cada braço e calcular o Alterntaxa de ração de cada sujeito 3,9. </li></ol></li><li> examinar diretamente cérebros post-mortem para verificar se a injeção alvo a região do ICV adequadamente. <ol><li> Anestesiar o rato com o mesmo procedimento como descrito na secção 4.1. Então sacrificar o mouse por deslocamento cervical. </li><li> Decapitar o mouse e remover a pele para expor o crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remover tecidos e músculos do crânio. </li><li> Fazer cortes na sutura lambdóide (entre os ossos parietais e interparietais) sem danificar o cérebro. Remova o occipital e ossos interparietais, em seguida, o parietal e ossos frontais. Remova o osso craniano usando uma pinça e isolar o cérebro do crânio, levantando as meninges. </li><li> Lavar o cérebro em solução salina estéril gelada e cortar o ICV região do cérebro no sentido coronal com uma faca cirúrgica (Figura 2). </li><li> Confirmar zona de injecção segundo o traçado da inserção da agulha notecido cerebral (Figura 2). Verifique se o traço agulha atingiu um dos ventrículos. Se o traço agulha não atender ou passar através dos ventrículos, excluir dados que do sujeito a partir da análise dos resultados experimentais. </li></ol></li></ol>

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<li>Harkany, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+approaches+in+experimental+models+of+beta-amyloid+neurotoxicity%3A+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective approaches in experimental models of beta-amyloid neurotoxicity: relevance to Alzheimer's disease.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 23, 963-1008 (1999).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allosteric+potentiation+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+galantamine+ameliorates+the+cognitive+dysfunction+in+beta+amyloid25-35+i.c.v.-injected+mice%3A+involvement+of+dopaminergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The allosteric potentiation of nicotinic acetylcholine receptors by galantamine ameliorates the cognitive dysfunction in beta amyloid25-35 i.c.v.-injected mice: involvement of dopaminergic systems.</a> Neuropsychopharmacology. 32, 1261-1271 (2007).</li>
<li>Yamada, K., Nabeshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer%27s+disease+and+evaluation+of+anti-dementia+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of anti-dementia drugs.</a> Pharmacol Ther. 88, 93-113 (2000).</li>
<li>Cho, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+of+amyloid-beta+concentrations+between+CSF+and+plasma+in+acute+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Correlations of amyloid-beta concentrations between CSF and plasma in acute Alzheimer mouse model.</a> Sci Rep. 4, 6777(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais importante neste protocolo é a injeção ICV de Ap. Este protocolo é projetado para injetar Aâ na região do ICV de camundongos sem instrumentos estereotaxia 11,12. Antes de iniciar uma experiência, um período preliminar de injeções de prática com um corante azul em vez de Ap deve ocorrer para atingir destreza suficiente. Imediatamente após a injecção, é necessário verificar se a injecção de pigmento foi realizada correctamente. Cuidadosamente retire o cérebro e verificar se a região apropriada foi ...

Dado que amilóide-β (Ap) é uma característica patológica da doença de Alzheimer (AD), o desenvolvimento de modelos animais AD tem incidido sobre a superexpressão neural de Ap. Por causa mutações na proteína precursora de amilóide (APP) ou presenilina (PS) levar a distúrbios de Ap equilíbrio e, finalmente, para a patogênese da familial AD 1, modelos de ratos que envolvem mutações no gene APP ou PS foram geralmente aceite. Entre o vasto leque de ratinhos transgénicos, modelos de ratinho prototípicas incluem o seguinte: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 e APP23. No cérebro, estes ratinhos apresentam geralmente agregação de Ap e, eventualmente, as placas senis; formação de placas é seguido por comprometimento cognitivo significativo de tal forma que eles mostram um fraco desempenho em testes comportamentais de aprendizagem e memória. A geração de usar camundongos transgênicos que, naturalmente, imitar AD patologia humana contribuiu, assim, para a sociedade AD pesquisa, permitindo-nos para monitorar a progressão da diSease. No entanto, utilizando ratinhos transgénicos não é económico e demorado porque leva meses para que os ratos desenvolvem placas de Ap e ainda mais tempo para mostrar sináptica induzida com Ap ou anormalidades comportamentais 2,3. Originalmente desenvolvido como uma alternativa para ultrapassar as deficiências dos modelos de ratinho transgénicos, modelos não transgénicas são também vulgarmente utilizado devido às suas vantagens distintas. modelos AD induzida pelo agente patogénico pode ser produzida através da injecção directa de Ap no cérebro, ao passo que os défices cognitivos ad como também pode ser desencadeada por outras químicas e físicas meios, tais como a injecção de compostos neurotóxicos como a escopolamina, a indução de lesões em áreas relacionadas com a cognição, como o hipocampo, ou por danos cortical 4. No entanto, a indução não patogênico de comprometimento cognitivo não reflete com precisão a fisiopatologia fundamental da AD; em vez disso, ele só imita seus resultados sintomáticos. Em contraste, um modelo de AD induzida pelo agente patogénico, o A46; modelo -injected rato, não só pode mostrar anormalidades comportamentais AD-like, mas também podem apresentar patologia Aâ, a característica comum compartilhada por AD familiar e esporádica. Apesar da dificuldade para visualizar as placas de Ap no tecido cerebral, o maior benefício do modelo com injecção de Ap, que faz com que seja atraente para investigação AD é a sua controlabilidade. Pesquisadores podem eliminar as diferenças individuais em modelos de ratos que podem levar a dados errados nos estudos relacionados com a droga. tratamento medicamentoso oportuna é activado dependendo de o mecanismo da droga candidata; para elaborar, um inibidor de agregação de Ap pode ser aplicada antes da injecção de Ap. Além disso, os investigadores podem assumir que a transformação patogénico que surge após a injecção Ap é derivada da exposição Ap porque os outros factores sejam estritamente controladas, incluindo diferenças individuais. Neste protocolo, uma vívida descrição de how para induzir um fenótipo AD-como em ratos normais via Ap intracerebroventricular injecção (ICV) sem instrumentos estereotáxica é apresentado. Minimizando os danos provocados-inserção para o tecido cerebral é essencial para evitar a possibilidade de danos estruturais e a inflamação induzida pela lesão. A falta de habilidade no manuseio do mouse leva à lesão neuronal inesperado. Além disso, as técnicas que permitem o ângulo e profundidade adequada para ser alcançado durante a injecção são especialmente importantes para contornar erros frequentes. Em adição a uma explicação detalhada, vivas da injecção ICV, a fiabilidade do modelo produzido pelo seguinte protocolo é também ilustrado nas secções seguintes. O protocolo a seguir poderia ser uma ferramenta confiável e de fácil compreensão que contribua para a investigação AD, proporcionando assim um degrau que poderia levar a uma descoberta significativa para a sociedade AD.

<table><tbody><tr><td>ICR camundongo</td><td>Orientbio</td><td></td><td>macho, 6-8 semanas, 27-29 g de peso corporal</td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongo</td><td>Orientbio</td><td></td><td>macho, 6-8 semanas, 21-23 g de peso corporal</td></tr><tr><td>Beta-amilóide1-42</td><td>em síntese interna</td><td></td><td>concentração estoque: 1 mM/DMSO, concentração injetada: 100 &mu; Seringa de injeção M / 10% DMSO e 90% PBS</td></tr><tr><td>ICV (calibre 26s)</td> <td>Hamilton</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>Evans corante azul (EBD)</td> <td>abcamBIoquímicos</td><td>ab120869</td><td>1% EBD em PBS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Gradi-GelTM II Gradiente PÁGINA Kit de Análise</td><td>ELPiS Biotech</td><td>EBS-1056</td><td>15% Gel</td></tr><tr><td>Kit de coloração de prata Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0377</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1150-01</td><td></td></tr><tr><td>LabDiet</td><td>Orientbio</td><td>5053</td><td></td></tr></tbody></table>

injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir acutely déficits cognitivos alzheimer-like

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

β amilóide (Aβ) é um importante mediador patológico da doença de Alzheimer (DA) familiar e esporádica. Nos cérebros de pacientes com DA, observa-se acúmulo progressivo de oligômeros e placas Aβ. Acredita-se que essas anormalidades Aβ bloqueiem a potenciação a longo prazo, prejudiquem a função sináptica e induzam déficits cognitivos. Evidências clínicas e experimentais revelaram que o aumento agudo dos níveis de Aβ no cérebro permite o desenvolvimento de fenótipos semelhantes aos de Alzheimer. Portanto, um protocolo detalhado descrevendo como gerar agudamente um modelo de camundongo AD por meio da injeção intracerebroventricular (ICV) de Aβ é necessário em muitos casos. Neste protocolo, estão incluídas as etapas do experimento com um camundongo injetado com Aβ, desde a preparação de peptídeos até o teste de anormalidades comportamentais. O processo de preparação das ferramentas e dos animais antes da injeção, de injeção do Aβ no cérebro do camundongo por meio de injeção de ICV e de avaliação do grau de comprometimento cognitivo são facilmente explicados ao longo do protocolo, com ênfase em dicas para injeção eficaz de Aβ no ICV. Ao imitar certos aspectos da DA com uma injeção designada de Aβ, os pesquisadores podem contornar o processo de envelhecimento e se concentrar na patologia a jusante das anormalidades Aβ.

Esta seção ilustra exemplos dos resultados que podem ser obtidos pela confirmação da agregação de Ap e avaliação Y-labirinto de déficits de memória. Usando o comprimento total de Ap (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mistura de monómeros, oligómeros de Ap, e fibrilas (Figura 3) foi produzido. Através do passo monomerization induzida por HFIP, foram obtidos monómeros relativamente homogéneos (pista B). Após a 7 dias de incubação, diversas tamanhos de agregados Ap (pista C)...

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é realizar a injeção intracerebroventricular de beta amiloide sem o uso de instrumentos estereotáxicos e induzir agudamente anormalidades comportamentais semelhantes às do Alzheimer em camundongos normais. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da neurobiologia, como a descoberta de fármacos para a Doença de Alzheimer. A principal vantagem desta técnica é que podemos realizar a injeção direta de A beta na região dos ventrículos cerebrais dos camundongos sem a ajuda de instrumentos estereotáxicos, permitindo-nos mimetizar anormalidades comportamentais semelhantes às do Alzheimer em camundongos sem precisar aguardar o processo de envelhecimento.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia ou diagnóstico da Doença de Alzheimer, porque pode ser usada para estudar a patologia downstream do beta-amiloide e para triagem de candidatos a fármacos. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades, porque encontrar a localização precisa do bregma no crânio do animal pode ser difícil. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de beta-amiloide a um milimolar com DMSO.Em seguida, dilua-o dez vezes em PBS. Depois, prepare uma solução de PBS contendo 10% de DMSO como veículo para injeção ICV. Em seguida, envolva a microsseringa com uma agulha de aço inoxidável de 26 graus usando tiras de Parafilm para ajustar o comprimento da agulha e permitir uma injeção controlada em profundidade.Enrole a seringa densamente várias vezes para que o Parafilm não seja comprimido durante a inserção da agulha, e o comprimento da agulha permaneça constante. Em seguida, corte as camadas de tiras de Parafilm para ajustar o comprimento da agulha a 3,8 milímetros entre a ponta da agulha e o Parafilm. Depois, lave a seringa duas vezes com etanol 70%.Posteriormente, enxágue a seringa com água destilada. Seque-a completamente em uma cabine de segurança química por pelo menos 30 minutos e deixe a seringa limpa sob luz UV por mais 20 minutos antes da injeção. Nesta etapa, posicione um camundongo anestesiado de sete semanas sobre uma plataforma aquecida.Em seguida, aplique gotas ou pomada de PBS estéril em ambos os olhos para prevenir a dessecação corneana durante o procedimento. Posteriormente, confirme a anestesia adequada avaliando o reflexo de retirada extensora ao apertar o dedo do pé. Então, prepare dois espelhos com múltiplas linhas verticais desenhadas nas superfícies para fornecer referências para a injeção perpendicular da seringa.Coloque um espelho ao lado do corpo do camundongo e o outro em frente à cabeça. Mantenha M1 paralelo à linha média imaginária entre os dois olhos do camundongo e posicione M2 perpendicularmente a M1, de modo que os dois planos formem um ângulo de 90 graus. Em seguida, pulverize etanol 70% na testa do camundongo e esfregue com cotonetes secos.Para localizar o bregma, coloque o polegar e o indicador diretamente acima dos olhos e pressione levemente a testa para baixo até que ambos os olhos protrudam. Ao mesmo tempo, puxe a pele da testa para trás para minimizar o movimento do crânio sob ela. Localize o local de injeção com uma fita métrica de alfaiate a uma profundidade de 2,4 milímetros abaixo do crânio.Encha a seringa com 10 microlitros de solução de A-beta ou veículo. Posicione a seringa de modo que fique perpendicular ao plano do local de injeção. Em seguida, alinhe as imagens refletidas da seringa em ambos os espelhos com as linhas desenhadas nos espelhos.Comece a inserir a agulha até que a película de Parafilm encoste na pele. Segure a seringa com uma das mãos e, com a outra, injete cinco microlitros da solução de A-beta ou do veículo, lentamente durante cinco segundos, sem pausas, e certifique-se de que a seringa permaneça perpendicular durante todo o procedimento. Após concluir a injeção, aguarde de três a cinco segundos antes de remover a seringa.Coloque o polegar e os dedos indicadores novamente na cabeça e segure-a para impedir movimentos desnecessários do crânio. Em seguida, remova a seringa sem incliná-la. Posteriormente, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida para recuperação.Para confirmar se o A-beta foi injetado na região ICV alvo, verifique o traçado da inserção da agulha no tecido cerebral para ver se ela atingiu um dos ventrículos. Se a injeção não foi bem-sucedida, exclua os dados desse indivíduo da análise dos resultados experimentais. Neste experimento, o peptídeo completo de A-beta com 42 aminoácidos foi utilizado para produzir uma mistura de monômeros, oligômeros e fibrilas de A-beta.Por meio da etapa de monomerização induzida por HFIP, obtiveram-se monômeros relativamente homogêneos. Após a incubação de sete dias, desenvolveram-se agregados de A-beta de diversos tamanhos, nos quais trímeros e tetrâmeros foram as espécies predominantes entre as formas oligoméricas do A-beta. Neste estudo, a memória operacional espacial foi avaliada em camundongos injetados com A-beta no teste do labirinto em Y, no qual a sequência de escolhas de braços e o número total de entradas nos braços foram registrados enquanto cada camundongo explorava livremente o labirinto.O grupo de camundongos injetado com A-beta apresentou taxas significativamente menores de alternância, indicando o desenvolvimento de déficits cognitivos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 minutos, incluindo os procedimentos anestésicos, se for executada corretamente. Ao realizar estes procedimentos, é importante lembrar-se de posicionar a agulha perpendicularmente ao plano de injeção.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de descoberta de fármacos para a Doença de Alzheimer explorarem a triagem in vivo de candidatos a medicamentos nesses modelos roedores de Alzheimer facilmente acessíveis. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar injeções intracerebroventriculares sem o uso de instrumentos estereotáxicos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Modelos transgênicos (Tg) do mouse do AD uma excelente oportunidade para investigar como e por que níveis Aâ ou tau na mudança CSF como a doença progride em pacientes humanos. Aqui, nós demonstramos uma refinada técnica de punção da cisterna magna para amostragem CSF serial do mouse.

A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato

Este vídeo demonstra uma técnica para a infusão contínua de anticorpos específicos do peptídeo beta-amilóide (Aβ) no hipocampo de um rato. O estudo emprega a implantação de um sistema de cânula bilateral para uma infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ juntamente com a infusão de oligômeros Aβ solúveis (Aβo) no hipocampo de ratos para estudar as interações entre os oligômeros e os anticorpos.

Infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ e oligômeros Aβ no hipocampo de ratos

Este vídeo demonstra o procedimento para injetar peptídeos beta-amilóides, cloreto de alumínio e um fator de crescimento neuroinflamatório, que coletivamente auxilia na formação de placas amilóides tóxicas na região do hipocampo. Isso causa comprometimento da memória no rato, característico da doença de Alzheimer.

Estabelecendo um modelo de rato com doença de Alzheimer por meio de uma injeção de peptídeo beta-amilóide

Este vídeo demonstra a infusão estereotáxica precisa de beta amilóide no giro dentado para estabelecer um modelo de camundongo da doença de Alzheimer. A determinação precisa de coordenadas e a entrega controlada de proteínas beta amilóides resultam em degradação neuronal, interrompendo o processamento da memória e contribuindo para o desenvolvimento da doença de Alzheimer.

Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Fonte: Arango-Lievano, M. et. al., Imagem longitudinal in vivo da cerebrovasculatura: relevância para doenças do SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens in vivo de dois fótons para visualizar placas amilóides marcadas com fluorescência e vasculatura cerebral. A fluorescência azul marca as placas, enquanto a fluorescência verde destaca os vasos sanguíneos cerebrais. Um mapa 3D da região de interesse e imagens em mosaico de alta resolução revelam interações detalhadas de placas...

Imagens in vivo de vasos cerebrais e placas amilóides em um modelo de camundongo com doença de Alzheimer

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Este é um protocolo para imitar a doença de Alzheimer em ratos por uma avaliação de imparidade de memória espacial, alterações patológicas neuronais, fardo de proteína (Aβ) beta amyloid neuronal, e agregação neurofibrilares, induzida pela injeção de Aβ25-35 combinado com tricloreto de alumínio e recombinante humano transformando β1-fator de crescimento.

Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos

O modelo de injeção de sangue autólogo de hemorragia intracerebral em camundongos descritos neste protocolo usa a técnica de injecção dupla para minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de agulha, não anticoagulantes no sistema de bombeamento, e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

Aprenda a injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em camundongos normais para induzir déficits cognitivos agudos sem estereotaxia. Este método acelera pesquisas em neurobiologia e descoberta de fármacos para Alzheimer.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like (Vídeo) | JoVE Journal

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

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