Name: Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a monitorar neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas de camundongos anestesiados usando microscopia intravital confocal em tempo real. Este método permite analisar o comportamento de leucócitos em condições de estado estável e inflamatórias.

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Este trabalho foi apoiado pela EMBO (para Y.E.), Foundation Machaon (para Y.E.) e SNSF (para B.A.I.). Agradecemos ao Bioimaging Core Facility pela disponibilidade do microscópio Nikon A1r e assistência técnica. Agradecemos à Sra. Clarissa Bartley pela correção em inglês.

NOTA: os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética Institucional Animal Care, em Genebra, Suíça e Veterinário Cantonal. Número de autorização GE / 63/14. 1. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da medula <ol><li> Sacrifício rato (8-12 semanas de idade) por deslocamento cervical. Esterilizar patas traseiras com etanol 70%. Retire a pele das pernas traseiras. </li><li> Dissecar fêmures e tíbias do mouse e remover o tecido de pernas com um bisturi. Lavar os pés com etanol 90% e coloque em um prato de cultura cheio com PBS. </li><li> Sob o capô cultura, tecido limpo de o fémur ea tíbia, com um bisturi e separada na articulação do joelho. Cortar cada extremidade dos ossos. </li><li> Lavar medula óssea a partir de cada osso, utilizando uma agulha de 23G e uma seringa de 1 ml cheio com meio de preparação (sem vermelho de fenol DMEM / F12, 1% de soro de rato), para um tubo de 50 ml de parafuso. Disrupt agregados celulares por delicadamente passaging através do ne 23Gedle e uma seringa de 1 ml. Levar o volume total a 25 ml com meio de preparação. </li><li> Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante de descarte. Pelete ressuspender em 1 ml de glóbulos vermelhos de tampão de lise RBLC (8,3 g de NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml de EDTA (100 mM), completar para 1 L com água destilada, filtro de 0,22 um) em uma de 15 ml de parafuso tubo. Incubar 30 segundos em gelo. </li><li> Adicionar 10 ml de meio e centrifuga-se a preparação de 250 x g, 5 min, 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio de preparação. </li></ol> 2. Neutrófilos Enriquecimento por selecção negativa <ol><li> Adicionar 150 mL de Rato neutrófilos enriquecimento cocktail (kit plataforma de isolamento de células, tais como EasySep). Misturar e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Adicionar 10 ml de fenol vermelho DMEM livre. Inverter e centrifugar uma vez a 250 x g, 3 minutos, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante de descarte. Pellet ressuspender em 1,75 ml de meio de preparação em 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo. Adicionar 250 ul BiotCocktail na Seleção. Misturar e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Vortex as partículas magnéticas (do kit de isolamento de células de plataforma) durante 30 segundos para ressuspender as partículas. Adicionar 500 ul de partículas magnéticas a suspensão de células. Misturar e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Colocar o tubo em o íman. Espere 3 min. </li><li> Inverter o ímã em um novo 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo. As células indesejadas permanecerá no tubo dentro do magneto. Descarte este tubo em um resíduos de risco biológico. </li><li> Coloque o novo tubo no ímã. Espere 3 min. </li><li> Inverter o ímã para um novo 15 ml parafuso tubo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo. </li><li> Volume completo até 5 ml com DMEM sem fenol vermelho. </li></ol> 3. Marcação de Neutrófilos <ol><li> Adicionar 0,5 mL de um corante laranja, tais como celular Rastreador Orange (concentração de trabalho1 ï¿½, CMRA - clorometil- rodol-acetato, estoque 10 mM em DMSO). Incubar 2 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 2,5 ml de meio de preparação. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante de descarte. Pelete Ressuspender em 1 ml de meio de preparação em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Tomar uma alíquota de contar com hematocytometer. </li><li> Incubar 5 min a 37 ° C. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante de descarte. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar. </li><li> Sobrenadante de descarte. Ressuspender o granulado como 10x10 6 células por 100 ul de PBS. Manter em gelo até injeção iv. NOTA: as células têm de ser injectados iv tão rapidamente quanto possível. 6-12x10 6 neutrófilos / rato são normalmente obtidos. </li></ol> 4. Rato Preparação para Microscopia intravital NOTA:.. Etapa 4.1) e 4.2) deve ser realizada no início da experiência para evitar tempo de espera prolongado de neutrófilos marcados na ICe. <ol><li> Pesar o CX 3 CR1 rato gfp (8-12 semanas de idade). </li><li> Preparar 800 ul de anestésicos (cetamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg em PBS). </li><li> Anestesiar mouse. Ip injeção com 200 mL / 20 g de rato. Anestesia controle por toe beliscar e verificando a freqüência respiratória. </li><li> Injectar neutrófilos (10x10 6 células em 100 ul de PBS) por via intravenosa na veia da cauda usando laterais ou do seio retro-orbital, para a conveniência do experimentador. </li><li> Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento e proteger os olhos com gel ocular. </li><li> Uma lamela de vidro (35 mm de diâmetro) é colocado em cerca de 10 cm prato de cultura de tecido, que tem um orifício de diâmetro de 30 mm. O uso de óleo é o de manter a placa de cultura de tecido em contacto com a lamela. </li><li> Inciso pele abdominal com uma tesoura para expor o peritônio. Inciso peritônio com uma tesoura para expor intestino. </li><li> Adicionar 200 ul de PBS (pré-aquecida a 37 ° C) para a pcavidade eritoneal. Leve o mouse na mão e transformá-lo virado para baixo, de modo que o intestino fica fora da cavidade peritoneal com uma pressão suave. Posicione o mouse na placa de cultura de tecidos. </li><li> Gentilmente deroll intestino com cotonetes esterilizados para a lamela, a fim de expor os vasos mesentéricos. </li><li> Corte lenços de papel em bandas e os molhe com 37 ° C aquecida PBS. Imobilizar o intestino com os pedaços de tecidos de papel para reduzir os movimentos resultantes do peristaltismo. </li><li> Coloque o prato de cultura de tecidos e o rato dentro da câmara termostatizada 37 ° C para o palco bandeja feito por encomenda do microscópio invertido. Introduzir uma seringa contendo anestésicos sc na pata traseira. NOTA: Para além disso, o rato pode receber oxigénio (0,5 L / min) com uma máscara. </li><li> Controle do mouse para anestesia por beliscar dedo do pé e verificar a freqüência respiratória a cada 30 min. Se necessário, fornecer um impulso de anestésicos (20 l) para manter adequadamente anestesia. NÃOE: A secagem da vasculatura deve ser evitada. Por isso, a sua humidade é mantida por molhagem regularmente os lenços de papel usados ​​para imobilizar o intestino com 37 ° C aqueceu-PBS. </li></ol> 5. Medição de neutrófilos e monócitos Comportamento no Vessels inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital <ol><li> Definir lasers para 488- 561- e com o menor poder necessário para evitar fototoxicidade induzida por laser. Nas nossas experiências, é inferior a 0,5%. Intensidade da GFP em monócitos e corante laranja em neutrófilos é tão brilhante que geralmente 0,3% é suficiente. NOTA: Isto representa uma potência de laser de 0,15-0,25 mW com o nosso sistema. </li><li> Adquirir imagens de 512 x 512 pixels (ou seja, 635 um) em 2,2 segundos com uma pinhole aberto usando o 20X objetivo seco do microscópio invertido. Usar uma profundidade Z entre 10 e 20 um, que garante um sinal suficientemente com as baixas potências de laser. NOTA: Nós geralmente realizar experimentos com um z-profundidade entre 12 a 1656; m. No caso de filmes e figuras apresentadas, a profundidade Z é de 20 uM. O contraste de fase permite a identificação de paredes endoteliais e formação de imagens é executada no mesentério. Dado que as células de patrulha em se movem lentamente com uma velocidade de 5-10 uM / min 6, a gravação de um campo de interesse cada 20 segundos é satisfatória. Com as configurações descritas, o estágio motorizado permite a gravação de até 7 campos de interesse, ao mesmo tempo. </li><li> Colocar o rato e os vasos mesentéricos termostato na câmara do microscópio são lhes permitir recuperar a partir da preparação durante 30 minutos antes da aquisição do primeiro filme. Durante este tempo, escolher vários domínios de interesse. Concentre-se na superfície luminal do vaso para o objectivo mais próximo. Se necessário, aproveitar o ligeiro auto-fluorescência do endotélio para ajustar o foco. NOTA: A cirurgia durante a preparação do mouse ligeiramente salienta o endotélio. Consequentemente, rolando de neutrófilos e/ ou monócitos pode ser observado na primeira a seguir à preparação de 15 min rato. </li><li> Grave um primeiro filme durante 30 minutos sob condições de estado estacionário, uma imagem a cada 20 segundos. NOTA: O software adquire cada campo de interesse em 2.2 segundos e o estágio motorizado move-se automaticamente de um campo para o outro. Ele vai voltar para a primeira posição no prazo de 20 segundos, durante os 30 minutos do filme gravação. </li><li> Para iniciar a inflamação dos vasos sanguíneos, adicionar uma gota de 20 ul de PBS contendo 100 ug de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 directamente sobre os vasos trabalhada. </li><li> Controlar o foco para cada área de interesse. NOTA: Durante o curso de aquisição, há sempre pequenas alterações de concentração no eixo z. Apesar do 10-20 jiM z profundidade, isto pode resultar num decréscimo da intensidade de fluorescência. Portanto, reorientar manualmente cada campo de juros no final de cada filme, se necessário. Grave filmes durante 30 min-períodos e até 3 horas paraTal após o início da inflamação. </li><li> No final da experiência, o sacrifício do rato anestesiado por deslocamento cervical. </li></ol> 6. Geração de arquivos de filme e Rastreamento de leucócitos NOTA: O software de aquisição Nikon gera .nd2 arquivos, mas o procedimento a seguir seria semelhante com outros softwares e marcas. <ol><li> Ficheiros de exportação como a série de tiff. </li><li> Ir para software ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importar a série de tiff. Cada canal como um arquivo diferente. </li><li> Aplicar um filtro mediano com um raio de 2,0 pixel para os canais verde e vermelho para reduzir o ruído de fundo (Processo&gt; Filtros&gt; medianos ...). </li><li> Converta arquivos em binário (Processo&gt; binário&gt; Faça binário). Para ativar o software para calcular o limite para cada imagem. </li><li> Mesclar canais em uma série de imagens (Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais ...). Selecione os monócitos no green canal, os neutrófilos no canal vermelho e da luz transmitida no canal cinza. </li><li> Converta imagens empilhados em cores RGB (Imagem&gt; Cor&gt; pilha para RGB). </li><li> Salve o arquivo como .avi </li><li> Os dados são importados e compilado no software Imaris (Bitplane). Movimentos de monócitos e neutrófilos são, então, rastreados usando o Assistente de Rastreamento Spot. </li></ol>

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<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As metodologias descritas neste manuscrito fornecer uma abordagem consistente para estudar de forma eficiente monócitos e comportamento de neutrófilos nas veias mesentérica, em condições de estado estacionário e inflamatórias. O passo crucial da preparação é a imobilização de tecidos do intestino com PBS-humedecidos. Se realizada corretamente, vasos mesentéricos são bem expostos na lamela para aquisição de imagem. Isso permite a seleção de vários domínios de interesse para monitorar o compor...

<html> Os neutrófilos e os monócitos são células do sistema imune inato que continuamente circulam no sangue. Após a lesão ou infecção, os sinais inflamatórios induzir diapedese de leucócitos em tecidos danificados e infectadas, aqui iniciar uma resposta imune celular 1-3. A rapidez da mobilização de leucócitos determina o resultado positivo das respostas imunes. Estes processos intrincados contar com moléculas específicas (por exemplo, selectinas, quimiocinas vinculado do endotélio) presentes no endotélio inflamado que ajudam para o estabelecimento de contactos adesivas entre leucócitos circulantes e do endotélio 1-3 .Para obter insights sobre as moléculas implicadas na leucócitos recrutamento cascata, é importante para visualizar a cinética do recrutamento de células e para controlar o comportamento de cada célula / população. Um método eficaz envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse. conteúdo &quot;&gt; Até à data, várias abordagens utilizando microscopia intravital foram desenvolvidos para a imagem da vasculatura 4,5. Por exemplo, a imagem latente da derme ou veias da orelha vasculatura mesentéricos por microscopia confocal intravital foi usada para identificar o comportamento de patrulha Ly6C murino e humano monócitos baixos CD14 dim CD16 + monócitos no lado luminal dos vasos sanguíneos sob condições de estado estacionário 6-8. O modelo de vasculatura do mouse cremaster é muitas vezes usado para monitorar o comportamento dos neutrófilos ou monócitos Ly6C inflamatória elevadas em condições inflamatórias ou isquêmicas em ratinhos transgénicos. Nesse caso, cremaster é estimulada através de injecção intrascrotal de IL1β, CCL2, TNFp ou fMLP. Depois de 4/2 hora, os tecidos são então exteriorizado e analisados ​​por microscopia confocal intravital 9-11 cirurgicamente. O protocolo seguinte descreve um método para monitorizar monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo com qualquerinvertido de fluorescência confocal. Além disso, o nosso método fornece detalhes sobre como imagem do mesmo navio antes (condição de estado estacionário) e, após a inflamação e como seguir a cinética do recrutamento de leucócitos. Para este fim, usamos o CX 3 CR1 rato gfp / peso, cujo monócitos expressam eGFP, iv injetado com uma laranja neutrófilos murino marcadas com corante. Utilizando um microscópio invertido confocal, é possível (1) para monitorizar e analisar os monócitos patrulha Ly6C baixas sob condições de estado estacionário e (2) para seguir o recrutamento de monócitos e neutrófilos no mesmo vaso, após a inflamação local. Aqui nós criamos as condições inflamatórias usando o agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Além disso, tal imagem pode ajudar a determinar o papel de moléculas específicas de interesse nos vários passos da cascata de recrutamento de leucócitos se realizada em ratinhos knock-out específicas ou na presença de anticorpos bloqueadores 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>Tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x Plano CFI Apocromático 0.45&nbsp; &nbsp; DT:4mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Laranja CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse Neutrófilo Enrichement Kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de Imersão Tipo A</td><td>Nikon</td><td></td><td>qualquer óleo viscoso&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Controle de Temperatura Life Box</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>microscópio invertido, estágio motorizado x/y/z, software de elementos NIS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>fenol vermelho livre DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>qualquer meio livre de vermelho de fenol é adequado</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstituir em PBS</td></tr><tr>Tecnologias de <td>células-tronco</td><td></td> de<td>soro de rato</td><td>incluídas no kit de enriquecimento de neutrófilos de camundongo EasySep Placa de</td></tr><tr><td>cultura de tecidos 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imagiologia neutrófilos e monócitos em mesenteric veins por microscopia intravital em ratos anestesiados em tempo real

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Resposta imunitária eficaz é dependente rápida mobilização de leucócitos do sangue para o local da infecção ou lesão. Investigar a migração de leucócitos in vivo é essencial para compreender a base molecular da migração transendotelial de leucócitos e a interacção com o endotélio vascular. Uma poderosa abordagem envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse. Aqui apresentamos um protocolo para monócitos de imagem e neutrófilos no CX 3 CR1 gfp / p iv rato injetado com neutrófilos marcados com corante laranja com um microscópio confocal invertido. Filmes de lapso de tempo recolhidas a partir de 30 minutos a várias horas de imagens permitem a análise do comportamento de leucócitos nas veias mesentérica em ambas as condições estaduais e inflamatórias estáveis. Nós também descrevem os passos para induzir localmente inflamação dos vasos sanguíneos com TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 e monitorar o subsequeNT recrutamento de neutrófilos e monócitos. A técnica apresentada pode também ser utilizado para monitorizar outras populações de leucócitos e as moléculas implicadas na investigar o recrutamento de leucócitos ou o tráfico que utilizam outros estímulos ou ratinhos transgénicos.

O manuscrito descreve um protocolo optimizado para controlar facilmente o comportamento dos monócitos e neutrófilos no mesentério de ratos anestesiados em tempo real. A utilização de uma câmara de 37 ° C-termostatizada é obrigatório para manter a temperatura do rato e também devido à temperatura de movimento dependentes dos leucócitos. Preparação do rato é apresentada na Figura 1. A Figura 2 mostra toda a área visto ao microscópio. Luz transmitida permite a identificação das veias mesen...

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

O objetivo geral deste procedimento de microscopia confocal intravitai é monitorar a dinâmica de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas sob condições de estado estável e inflamatórias em camundongos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da imunologia, como quais são as bases moleculares da migração de leucócitos, recrutamento e interação com o endotélio vascular. As principais vantagens dessa técnica são a capacidade de rastrear e analisar a patrulha de monócitos LY60 low sob condições de estado estático e acompanhar o recrutamento de monócitos e neutrófilos para o mesmo vaso após estímulos inflamatórios locais. O procedimento será demonstrado por Stefan Ler, técnico do laboratório. Para preparar uma suspensão de células únicas a partir da medula óssea, esterilize as patas traseiras de um camundongo com oito a 12 semanas de idade com etanol 70%, e então use um bisturi para coletar os fêmures e tíbias quando todos os ossos tiverem sido desconectados.Lave as pernas com etanol 90% e transfira os ossos para uma placa de cultura contendo PBS. Em seguida, em uma câmara de cultura, use o bisturi para limpar os fêmures e as tíbias e separá-los na articulação do joelho. Depois, corte as extremidades dos ossos e use uma seringa de um mililitro carregada com meio de preparação, equipada com uma agulha de 23 graus, para lavar a medula de cada osso em um tubo cônico de 50 mililitros.Desagregue os agregados celulares passando-os novamente pela ponta da agulha e, em seguida, complete o volume total da suspensão celular até 25 mililitros com meio fresco, centrifugue as células e depois as ressuspenda. Suspenda o palato em um mililitro de tampão de lise de hemácias e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Após 30 segundos, interrompa a lise com 10 mililitros de meio de preparação.Centrifugue novamente as células e ressuspenda o pellet em dois mililitros adicionais de meio de preparação para enriquecer os neutrófilos por seleção negativa. Primeiro, incube as células da medula óssea com 150 microlitros de coquetel de enriquecimento de neutrófilos de camundongo em gelo por 10 minutos.No final da incubação, adicione 10 mililitros de DMEM sem vermelho de fenol. Inverta o tubo uma vez e centrifugue as células. Re-suspenda o pellet em 1,75 mililitro de meio de preparação e transfira as células para um tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros.Em seguida, incubar as células com 250 microlitros do coquetel de seleção de biotina no gelo durante 10 minutos. Ao final da incubação, suspender as partículas magnéticas do kit de isolamento celular com 30 segundos de vortex. Em seguida, incubar as células com 500 microlitros das partículas no gelo durante 10 minutos.No final da incubação, coloque o tubo no ímã. Após três minutos, inverta o ímã em um novo tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Para coletar as células não marcadas, coloque o tubo contendo as células não marcadas no ímã.Após três minutos, inverta o ímã em um tubo cônico de 15 mililitros para transferir as células não marcadas, deixando a última gota no tubo. Em seguida, complete o volume até cinco mililitros com meio DM livre de vermelho de fenol fresco. Agora, adicione meio microlitro do corante citoplasmático apropriado, como o CellTracker Orange utilizado aqui, às células a 37 graus Celsius.Após dois minutos, a 37 graus Celsius, lave as células com 2,5 mililitros de meio de preparação e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio de preparação em um tubo de 1,5 mililitro, conte as células e então incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após centrifugar as células, suspendemos o pellet em um mililitro de PBS seguido por outra centrifugação enquanto as células estão girando. Use óleo para fixar uma lamínula de vidro de 35 milímetros a uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros com um orifício de diâmetro de 30 milímetros.Em seguida, ressuspenda o pellet em uma concentração de um vezes 10 elevado a sete células por 100 microlitros de PBS e coloque as células no gelo o mais rápido possível após a marcação. Injete as células de neutrófilos marcadas por via intravenosa em um camundongo CX3CR1 GFP anestesiado com idade entre oito e 12 semanas e coloque o animal sobre uma plaqueta aquecida. Em seguida, aplique imediatamente pomada nos olhos do animal e use uma tesoura para abrir a pele abdominal, expondo o peritônio, e faça uma incisão no peritônio com a tesoura para expor o intestino.Em seguida, administre 200 microlitros de PBS a 37 graus Celsius na cavidade peritoneal e vire o camundongo com o rosto voltado para baixo sobre a placa de cultura celular para remover os intestinos da cavidade peritoneal com pressão suave. Em seguida, usando cotonetes estéreis, enrole cuidadosamente os intestinos sobre a lamínula para expor os vasos mesentéricos e imobilize o tecido com pedaços de papel-toalha umedecidos com PBS a 37 graus Celsius para reduzir os movimentos resultantes da peristalse. É muito importante ter paciência para imobilizar cuidadosamente o intestino com os papéis umedecidos em PBS.Caso contrário, movimentos resultantes da peristalse durante a aquisição de imagens arruinarão o experimento. Em seguida, transfira a placa de cultura de tecidos e o camundongo para uma câmara termostatizada a 37 graus Celsius sobre uma plataforma adaptada de microscópio invertido e administre uma segunda dose de anestésico por via intramuscular na pata traseira. Agora, ajuste os lasers apropriados à potência mais baixa necessária para evitar fototoxicidade induzida por laser e permita que o camundongo descanse por 30 minutos.Quando o animal tiver se recuperado, grave o primeiro filme por 30 minutos em condições de estado estacionário. Em seguida, para iniciar a inflamação do vaso sanguíneo, aplique uma gota de 20 microlitros de PBS contendo 100 microgramas do agonista TLR dois TLR um PAM três CSK quatro diretamente sobre os vasos analisados. Por fim, adquira um segundo filme, tomando cuidado para controlar o foco após a adição do agonista, já que a inflamação induz alterações na largura do endotélio, modificando o foco no eixo Z. Aqui, os diferentes passos do processamento de imagem para o primeiro ponto temporal de um filme adquirido em condições de estado estacionário, conforme acabou de ser demonstrado, são apresentados neste filme.A vigilância de monócitos verdes do LASIK cilo em condições de estado estável pode ser visualizada com neutrófilos vermelhos observados circulando na corrente sanguínea. Aqui, o mesmo campo de interesse é mostrado 90 minutos após a adição de PAM três CSK quatro, resultando no recrutamento maciço de neutrófilos e monócitos para a parede endotelial, que os monócitos examinam meticulosamente usando o software apropriado, permitindo rastrear os caminhos exatos dos monócitos e neutrófilos. A vigilância do endotélio pode ser monitorada antes e após o início da inflamação.É importante observar que uma perda de foco no eixo Z ou um deslocamento em XY pode ocorrer como consequência de movimentos intestinais que comprometem o experimento. Esta técnica pode ser ainda modificada utilizando diferentes modelos de camundongos geneticamente modificados ou pela injeção de anticorpos bloqueadores ou fármacos farmacêuticos para determinar o papel de moléculas específicas de interesse no comportamento dos leucócitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar a dinâmica de leucócitos saturados em veias mesentéricas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Neste vídeo, demonstramos a visualização em tempo real das interações entre células sanguíneas e endoteliais nas veias mesentéricas de um modelo de camundongo injetado intraperitonealmente com lipopolissacarídeo.

Microscopia intravital para analisar as interações células sanguíneas-endoteliais em um modelo de camundongo com inflamação

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Aprenda a monitorar neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas de camundongos anestesiados usando microscopia intravital confocal em tempo real. Este método permite analisar o comportamento de leucócitos em condições de estado estável e inflamatórias.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

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