A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

O objetivo geral deste experimento é determinar a carga tumoral relativa da metástase intraperitoneal do câncer de ovário em um modelo murino de xenoenxerto ortotópico singênico. Este novo método para obter imagens e quantificar a carga tumoral relativa pode nos ajudar a responder a questões-chave na regulação da metástase do câncer de ovário. A vantagem fundamental dessa técnica é que, ao não misturar os espectros fluorescentes, a autofluorescência do tecido é removida das imagens, permitindo a medição da carga tumoral relativa padronizada.

Essa técnica fornece informações sobre a metástase do câncer de ovário humano com implicações para o monitoramento da eficácia da terapêutica. A demonstração visual desse método é fundamental porque estamos combinando uma técnica de imagem robusta com um procedimento analítico para extrair dados quantitativos das imagens. Demonstrando o procedimento hoje estará Yueying Liu, gerente de programa de laboratório do Stack Lab.

Após 10 semanas de crescimento de células tumorais, coloque o corpo de cada camundongo anestesiado em um sistema de imagem óptica de pequenos animais, um de cada vez. Examine todos os camundongos da coorte em cada ponto de tempo. Para observar células tumorais marcadas com fluorescência, execute uma aquisição multiespectral para coletar um total de cinco imagens.

Selecione uma exposição padrão de 15 segundos, binning dois por dois, um campo de visão de 16 centímetros e um F stop de 1,1. Em seguida, adquira uma imagem de refletância de todo o animal usando luz branca de um filtro de excitação aberto, um filtro de emissão aberto, uma exposição padrão de 0,2 segundos com binning dois por dois e um campo de visão de 16 centímetros, com uma parada F de 2,8. Após a eutanásia, use uma tesoura de dissecção pontiaguda para cortar a pele anteriormente ao longo da linha média ventral do camundongo, da parte superior das coxas até a parte inferior da caixa torácica.

Separe suavemente a pele do tecido peritoneal, certificando-se de não perfurar a parede peritoneal. Em seguida, corte lateralmente, tanto ao longo da parte inferior da caixa torácica quanto na parte superior das coxas, para criar dois retalhos de pele. Coloque o mouse em seu lado ventral no scanner, de modo que a cavidade peritoneal fique voltada para baixo com as abas da pele abertas.

Escaneie o mouse com seus órgãos in situ, usando os mesmos parâmetros que foram usados anteriormente para o mouse ao vivo. Agora, continue dissecando o camundongo extraindo o fígado, o omento, o pâncreas, o estômago, o diafragma e os intestinos delgado e grosso usando técnicas padrão. Além disso, remova o peritônio esquerdo e direito, os ovários, os rins, o mesentério e, por último, a almofada de gordura.

Observe, enumere e registre cada um dos tumores visíveis nos órgãos. Use um paquímetro para medir o diâmetro de cada tumor. Designe tumores com menos de dois milímetros de diâmetro como pequenos, entre dois e cinco milímetros como médios e maiores que cinco milímetros como grandes.

Em seguida, coloque os órgãos no modelo de escaneamento de órgãos, encontrado na Figura Quatro do protocolo de texto que acompanha, e use-o para organizar a localização de cada órgão durante o próximo escaneamento. Use PBS para manter os órgãos úmidos. Digitalize cada folha de órgãos usando o sistema de imagem óptica de pequenos animais e os parâmetros que foram usados anteriormente.

Após a digitalização, coloque os órgãos em 10% de formaldeído e processe-os para histologia usando técnicas padrão. Para reduzir a quantidade de fluorescência automática em cada varredura multiespectral, primeiro carregue a proteína fluorescente vermelha in vivo arquivo espectral seguido pelo piso automático in vivo arquivo vermelho na janela de imagens não misturadas e selecione não misturar. Em seguida, exporte os arquivos dot bip em um formato tif de ponto não dimensionado de 16 bits e carregue-os na Imagem J, acessando o arquivo, abra e selecionando o arquivo tif de ponto de 16 bits correto.

Em seguida, vá para o menu de imagem e selecione ajustar, depois contraste de brilho e defina o valor mínimo exibido como zero e o valor máximo exibido como mais 35353. Em seguida, no menu de imagens novamente, vá para procurar tabelas e selecione vermelho quente. Vários modelos animais exigirão diferentes níveis de brilho, mas é importante manter o brilho consistente ao longo de um determinado estudo.

Usando a ferramenta de seleção à mão livre, desenhe uma região de forma livre de seleção de interesse ao redor de cada órgão. A região de forma livre de interesse deve ser desenhada perto das bordas do órgão. Em seguida, digite control e M para usar a ferramenta de medição para calcular a área de superfície de cada órgão.

Registre esses dados em uma planilha. Com a região de interesse que foi desenhada em torno de cada órgão, clique com o botão direito do mouse e selecione duplicar para incluir apenas o órgão. Em seguida, na imagem, vá para ajustar, depois limite e defina o nível de limite inferior para mais 1.200 e o nível de limite superior para mais 1.700.

Além disso, verifique o fundo escuro e selecione ok. Isso selecionará apenas as regiões mais brilhantes. As imagens podem exigir manipulação manual dos controles deslizantes de limite na Imagem J para que as áreas anteriormente mais claras sejam selecionadas para a etapa de análise, conforme mostrado acima.

Diferentes modelos de doenças exigirão diferentes restrições de limiar, mas é importante manter os níveis de limiar consistentes ao longo de um determinado estudo. Em analisar, selecione analisar partículas e altere o tamanho do pixel ao quadrado para 10 até o infinito. Escolha mostrar contornos, marque para selecionar apenas exibir resultados e clique em OK.

Isso medirá as áreas e as densidades integradas brutas das regiões brilhantes consideradas tumores. Registre os valores da área de superfície e a densidade bruta integrada de cada seleção de tumor juntos na mesma folha de propagação contendo as áreas de superfície do órgão. Em seguida, em analisar, selecione ferramentas e vá para a barra de calibração.

Adicione uma barra de escala de calibração às imagens dos órgãos. As montagens podem conter um número maior ou menor de órgãos, conforme ditado por um determinado estudo. Em seguida, em arquivo, vá para salvar como e salve a montagem como um ponto tif e um ponto jpeg.

Em seguida, abra o arquivo jpeg de pontos dos órgãos e vá para o menu inserir para adicionar uma caixa de texto a cada imagem. Adicione rótulos de órgãos criando uma caixa de texto abaixo de cada uma das três linhas de órgãos. Abra cada um dos arquivos tif de ponto de 16 bits das digitalizações de corpo inteiro na Imagem J na ordem do número do mouse.

Em seguida, vá para o menu de imagem e selecione ajustar e, em seguida, contraste de brilho. Defina o valor mínimo exibido como zero e o valor máximo exibido como mais 35353. Em seguida, volte ao menu de imagens e procure tabelas e selecione vermelho quente.

Quando isso estiver concluído, salve a montagem como um arquivo dot tif e um arquivo jpeg de ponto. A linha celular de câncer de ovário murino ID8 que é injetada nos camundongos 10 semanas antes da imagem fluoresce no canal vermelho e continua a fazê-lo durante o crescimento. A imagem ao vivo usando um sistema de imagem óptica de pequenos animais é capaz de visualizar as células ID8 em expansão no camundongo e fornece uma abordagem mais precisa do que simplesmente pesar o camundongo para avaliar a carga tumoral.

Após a eutanásia e a remoção da camada de pele ventral, os órgãos intactos podem ser vistos com mais detalhes. No entanto, órgãos individuais colocados no modelo de varredura de órgãos exibem a carga tumoral claramente em cada órgão. A carga tumoral no omento e pâncreas, ovários e mesentério do camundongo mostrado à esquerda é muito maior do que os mesmos órgãos do camundongo mostrado à direita.

A observação da carga tumoral diferencial é confirmada quantitativamente tanto em termos de área de serviço do tumor quanto de intensidade do sinal tumoral. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para obter imagens de até 18 ratos vivos por hora. A dissecção e a imagem ex vivo de órgãos individuais levam cerca de 20 minutos por amostra.

Após esse procedimento, outros métodos, como a ressonância magnética quantitativa, podem ser realizados para abordar hipóteses como o impacto da obesidade na metástase do câncer de ovário, conforme mostrado em nosso artigo de pesquisa sobre câncer de 2015.