Name: Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas usando microscopia darkfield aprimorada e mapeamento hiperespectral. Este método rápido e não destrutivo supera a microscopia eletrônica em custo e tempo.

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Os autores agradecem a Günter Oberdörster, DVM, PhD e Alison Elder, PhD (University of Rochester) e Mary Frame, PhD (Stony Brook University) pelas colaborações de pesquisa em animais, resultando em amostras de tecido para análise. Além disso, os autores agradecem: Christina Rotondi (Núcleo de Histologia da Faculdade de Medicina de Albany); Rani Sellers, DVM, PhD e Barbara Cannella, PhD (Centro de Histologia e Patologia Comparativa da Faculdade de Medicina Albert Einstein); Leonardo Bezerra e Ahlam Abuawad (membros da equipe de pesquisa do Brenner); e Leslie Krauss, Byron Cheatham e Elyse Johnson (CytoViva). Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão OH-009990-01A1 do CDC-NIOSH e pelo NanoHealth and Safety Center, no estado de Nova York, concedido a SB.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para amostras de tecido que foram submetidos a coloração histológica convencional, a identificação e análise de nanopartículas de óxido de metal pode ser conseguida através de uma combinação de EDFM, mapeamento HSI, e técnicas de análise de imagem. Embora haja flexibilidade na preparação de amostras para histologia ou imuno-histoquímica (por exemplo, usando tecidos fixados ou congelados; tipo de mancha), é importante que as amostras são seccionados a uma espessura de 5-10 mm para melhor visualização. As amostras usadas aqui foram fixados em formalina e antes de seccionamento com um micrótomo rotativo a 6 mm de espessura embebido em parafina, montadas em lâminas de vidro para microscópio, coradas com hematoxilina e eosina e lamínulas. Tecidos da pele de suíno de um ex vivo colaboração penetração cutânea toxicologia foram usadas para este estudo. Os tecidos foram expostos a nanopartículas de óxido de metal (alumina, sílica, céria) em suspensões aquosas. Detecção da região (s) de interesse (eleme alto contrastents) com EDFM é um primeiro passo crítico que facilita a posterior mapeamento e análise HSI. Amostras de controlo positivas e negativas devem ser visualizados e analisados ​​em primeiro lugar, a fim de criar uma biblioteca espectral para referência. Os espectros coletados a partir do controlo positivo são exportados para uma biblioteca espectral controlo positivo. Em seguida, todos os espectros a partir das imagens de controlo negativo são subtraídos da biblioteca espectral do controlo positivo, a fim de melhorar a especificidade (reduzir os falsos positivos). A biblioteca espectral filtrado resultante é considerado o RSL que serve para a análise dos materiais de interesse. Todas as amostras de tecido são submetidos ao mesmo processo de imagem e são mapeados contra o LSR. A imagem resultante irá conter apenas áreas com elementos de interesse sobre um fundo preto. Esta imagem pode então ser analisado utilizando o ImageJ com as suas funções de limiar e de análise de partículas para se obter a área de partículas mapeados por campo de visão. Os dados numéricos obtidos a partir ImageJ pode ser exportaçãoed para uma planilha para análise posterior. É importante considerar que, como amostras biológicas são inerentemente diferentes um do outro, e métodos de coloração pode afetar a visualização através EDFM e HSI, as configurações de exposição deve ser determinado de acordo com o que produz a melhor imagem de alto contraste para um tipo específico de amostra. Embora a redução de falsos positivos pode ser conseguido através da filtragem de bibliotecas espectrais, é crucial para se obter controlos negativos fiáveis ​​que têm evitado a contaminação com o elemento de interesse, como o espectro correspondente a esta contaminação poderia potencialmente ser filtrados a partir da biblioteca espectral do controlo positivo , aumentando as taxas de falsos negativos. Além disso, a faixa de intensidade espectro que é detectável com o software de imagem hyperspectral não pode ultrapassar o limite do software particular (para este estudo, ou seja, 16.000 unidades): áreas com um elevado número de partículas acumuladas que produzem spintensidades ectral acima do limite de intensidade são deixados de fora da biblioteca espectral, devido ao risco de aumentar o número de falsos negativos. Enquanto o sistema HSI confere muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais, existem algumas desvantagens e limitações a considerar. Uma delas é que a grande quantidade de dados ópticos recebidos podem exigir poder de computação substancial. Outra é que HSI pode ser demorada, principalmente nos estágios iniciais, quando as bibliotecas de espectros de referência estão sendo criados. Além disso, o tempo de imagem pode levar vários minutos por captura de imagem, tornando-o mais lento do que simples imagem de campo escuro; No entanto, é ainda mais rápido do que a execução preparação das amostras e visualização por microscopia electrónica. Além disso, sistemas complexos pode resultar em vários espectros característicos, que exigem o desenvolvimento de controles altamente especializados e fazer o estabelecimento de, bibliotecas de referência universais padronizados difíceis 26. Finalmente, a tecnologianique resultados em resolução mais baixa do que as técnicas probe- ou elétron-microscopia, tais como microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de transmissão, que podem resolver átomos individuais. A resolução dessa técnica é limitada devido à sua natureza fotônico, que a impede de ser uma ferramenta de alta precisão para medir tamanhos de partículas no nível nanométrico ou para localizar precisamente materiais a um nível sub-micron. Enquanto que a técnica pode ser capaz de identificar partículas dentro de determinados compartimentos de tecidos ou organelas celulares superiores a 1 uM (tais como núcleos de células), ou organelos pequenos recursos são difíceis de visualizar com precisão com este método. Também digno de nota, dada a sua resolução espacial, este método não pode diferenciar entre as nanopartículas individuais e aglomerados 11. Outras considerações incluem: certos materiais (como metais nobres) têm muito mais elevada reflectância e perfis espectrais distintas, o que pode torná-los mais fáceis de Analyze e mapa espectral com esta ferramenta. Outros, tais como os óxidos metálicos semi-investigados neste estudo e nanomateriais à base de carbono 24, 27, pode ser mais difícil, devido à sua composição elementar, forma, e de acordo com a matriz. Em dois estudos de inalação de murino por Mercer et ai., Um sistema similar ao empregue no presente estudo foi utilizada a fim de localizar os nanotubos de carbono no pulmão e nos órgãos secundários com base na sua extraordinariamente elevado contraste com os tecidos circundantes. No entanto, o mapeamento hiperespectral não foi demonstrada em qualquer um dos estudos, provavelmente porque a forma única de fibras de carbono foi suficiente para uma característica de identificação. Outra consideração refere-se especificamente aos tecidos: desde depositando nanopartículas de interesse para órgãos específicos através de processos biofísicos normais é imprevisível (e muitas vezes ele próprio objecto de estudo), determinação de um controlo positivo aplicável pode ser difícil e requer a consideração de como a geração do controle mIGHT afetar o estado de um material de interesse. Por exemplo, se uma biblioteca espectral é criado a partir de nanopartículas cristalinas de interesse, pode ser difícil para mapear a biblioteca para as mesmas nanopartículas em tecidos ou células, devido a alterações nos espectros resultantes da alteração da partícula (por exemplo, devido a alterações nas pH, dissolução, aglomeração, a ligação às proteínas) e do microambiente global ou matriz. Finalmente, a técnica está limitada na sua natureza semi-quantitativa: ela só pode ser tão quantitativa como outras técnicas de microscopia bidimensional de resolução semelhante, o que significa que não pode ser facilmente usado para executar tarefas, tais como caracterização de carga órgão total de um material. No geral, EDFM e HSI fornecer várias vantagens em relação às técnicas convencionais de imagem e caracterização de nanomateriais, como TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permite a aquisição de imagens mais rápido e análise, o que economiza tempo e custo em comparação com mais conven intensivatécnicas adicionais. Além disso, a preparação da amostra para EDFM / HSI é tipicamente tanto mínima e não destrutiva, o que poupa tempo e também permite uma análise mais flexível de uma dada amostra, uma vez que pode, em seguida, ser utilizados para outras técnicas. Além disso, a HSI é versátil, permitindo a análise de materiais em nano-escala e de muitas composições numa grande variedade de matrizes. A equipe de pesquisa está trabalhando para aperfeiçoar o método descrito aqui para outros materiais e tipos de amostras, incluindo uma avaliação aprofundada da especificidade da tecnologia. A próxima etapa crítica sob investigação pela equipa de investigação é a validação dessas técnicas em relação aos padrões tradicionais de ouro (por exemplo, Raman, TEM, SEM) para os materiais e tipos de tecido de interesse.

Como nanomateriais são cada vez mais usados ​​em uma variedade de indústrias e aplicações, existe uma necessidade de métodos de imagem em nanoescala e caracterização que são mais rápido, acessível e conveniente do que as modalidades tradicionais, como a microscopia eletrônica. Para visualizar as interações de nanopartículas (NP) com as células, tecidos e sistemas vivos, têm sido empregadas muitas técnicas ópticas, incluindo contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia 1 e abordagens baseadas em campo evanescente, como a Total Internal Reflection (TIR) ​​ou quase microscopia de varrimento de campo óptico (NSOM) 2,3. No entanto, estas são abordagens analíticas de ponta, fora do alcance da maioria dos laboratórios não especializados 4. A microscopia electrónica, incluindo microscopia electrónica de transmissão (TEM), também tem sido utilizada para estudar a interacção com células 5,6,7,8 NP. Alto ângulo anular darkfield (HAADF) digitalização microscopia eletrônica de transmissão tem sido usado para estudar a interação de NPscom vírus 9. A microscopia confocal é uma outra técnica popular usada para estudar as interações célula-NP 10. Nos últimos anos, imagem hiperespectral (HSI) técnicas baseadas em campo escuro foram utilizados como uma ferramenta analítica promissora para estudar NPs de 11 em matrizes biológicas. Sistemas HSI gerar uma representação tridimensional de dados espaciais e espectrais, conhecido como um hipercubo ou datacube 12. O mapa espacial de variação espectral é usado para identificação do material. Perfis espectrais de materiais conhecidos pode ser gerado e utilizado como bibliotecas de referência para comparação com as amostras desconhecidas. Uma das vantagens principais com sistemas HSI é a sua capacidade de combinar imagiologia com espectroscopia, estabelecendo assim a localização e distribuição de NPs desconhecidos in vivo ou ex vivo, bem como ligando-os a uma outra partícula de referência conhecida, a composição semelhante. Há várias vantagens deutilização de sistemas de HSI sobre técnicas de imagem convencionais: a preparação da amostra mínima é necessária; preparação da amostra é tipicamente não-destrutiva na natureza; aquisição e análise de imagem é mais rápida; a técnica é de 13 rentável; ea distribuição espacial e análise de compostos de composição mista e / ou em matrizes complexas é mais facilmente conseguido 14. Para nanomateriais pesquisa envolvendo amostras preciosos, uma das considerações mais importantes é a disponibilidade de um método de imagem não destrutivo, que permite o potencial para examinar amostras repetidamente por um ou mais métodos. Repetida ou múltiplas análises pode ser desejado o desenvolvimento de conjuntos de dados globais, que não estariam disponíveis a partir de um único método. Para este respeito, estudando suas propriedades ópticas é a forma mais segura para analisar a amostra. Usando um microscópio de campo escuro reforçada (EDFM) e HSI sistema para estudar a resposta óptica da amostra - nomeadamente Reflectance, mas também absorvância e transmitância - identificação e caracterização recurso pode ser realizada 15. Endpoints potenciais caracterização incluirá uma avaliação do tamanho e forma de nanopartículas ou aglomerados e distribuição das nanopartículas dentro de uma amostra relativa. Neste artigo, descreve métodos de mapeamento especificamente para as nanopartículas de óxido de metal no tecido post-mortem usando um sistema HSI baseado em um algoritmo jogo pixel-espectral referido como um mapeador ângulo espectral (SAM). Nós escolhemos esta aplicação em particular porque ele tem o potencial para complementar atual e futura no domínio da investigação nanotoxicology vivo, em modelos animais são usados ​​para avaliar as implicações para a saúde da exposição a nanomateriais artificiais. A aplicação deste método pode também informar a investigação entrega da droga em nanoescala que utiliza modelos de tecido ou animais. Em particular, a absorção de nanopartículas, distribuição, metabolismo e excreção em todo organs e tecidos poderiam ser investigados com este sistema. Uma grande variedade de aplicações estão sendo investigados para uso em investigação biomédica 11. Este método poderia ser utilizado para a avaliação de amostras biológicas diferentes (tais como vários tecidos, tipos de amostras de lavagem bronco-alveolar, e esfregaços de sangue) que tenham sido expostos a nanopartículas de uma variedade de composições elementares 16-19. Além disso, este método é útil para o estudo de nanopartículas biodistribuição in vivo e in vitro, que é pertinente para os estudos de libertação de fármacos 11 nanoescala. Além amostras biológicas, EDFM e HSI pode ser utilizado para avaliar as nanopartículas em amostras ambientais, tais como esgotos 20. Avaliação da exposição ocupacional pode ser facilitada pela utilização desta técnica, bem como, uma vez que pode ser utilizado para avaliar a eficácia do equipamento de protecção individual na prevenção da penetração de nanopartículas. Além disso, a pesquisa de team está actualmente a desenvolver um EDFM semelhante e protocolo HSI para a avaliação de amostras de mídia de filtro de nanopartículas coletados a partir de avaliações de exposição ocupacional. Embora a preparação destes diferentes tipos de amostras para EDFM e HSI pode variar, é importante que eles são preparadas de tal forma que eles podem ser facilmente visualizados pelo sistema óptico. Tipicamente, a amostra deve ser preparado como se iria ser visualizado através de microscopia de campo claro tradicional. Existem vários sistemas de imagem hyperspectral comercialmente disponíveis 11.

<table><tbody><tr><td>Unidade CytoViva 150 (condensador)</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td><td>montado no microscópio Olympus BX43</td></tr><tr><td>Microscópio Olympus BX43 - Slot do Analisador - HSI com objetivas de ar de 10x e 40x e objetiva de imersão em óleo de 100X</td><td>obtida através do CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>para uso com o condensador da unidade CytoViva 150</td></tr><tr><td>Câmera digital Firewire Dagexcel-M - Refrigerada; inclui o software</td> <td>Exponent 7obtido através da câmera de campo escuro aprimorada CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>e do software</td></tr><tr><td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; inclui câmera hiperespectral Pixelfly, controlador de estágio XY, software de imagem hiperespectral ENVI</td> obtido por meio da <td>câmera hiperespectral</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> e software</tr> de <tr><td>lâminas de microscópio de vidro limpas para sala limpa (lâminas de vidro B)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>detritos e artefatos reduzidos em comparação com lâminas de microscópio de vidro convencionais para imagens ideais</td></tr> de <tr><td>limpeza de lamínulas de microscópio de vidro limpas (#1.0; 22 mm x 22 mm x&nbsp; 1.45 mm)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>redução personalizada</td> de <td>detritos e artefatos em comparação com lamínulas de vidro convencionais para imagem ótima</td></tr><tr><td>tipo A microscopia óleo de imersão</td><td>Fisher Scientific</td><td>12368B</td><td>fornecedores múltiplos</td></tr><tr><td>70% isopropanol em água</td><td></td><td></td><td>vários fornecedores</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> National <td>Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>software de código aberto gratuito download on-line</td></tr><tr><td>de nanopartículas de óxido metálico</td><td>fornecidas à equipe de pesquisa por parceiros</td><td></td> industriais <td>nanopartículas de alumina, sílica e céria em suspensões aquosas. Devido a um Acordo de Confidencialidade entre os autores e parceiros da indústria, mais informações sobre o produto não podem ser divulgadas.</td></tr></tbody></table>

identificação dos nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por aprimorado mapeamento darkfield microscopy e hyperspectral

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Os nanomateriais são cada vez mais prevalentes em toda a indústria, manufatura e pesquisa biomédica. A necessidade de ferramentas e técnicas que auxiliem na identificação, localização e caracterização de materiais em nanoescala em amostras biológicas está aumentando. Os métodos atualmente disponíveis, como a microscopia eletrônica, tendem a consumir muitos recursos, tornando seu uso proibitivo para grande parte da comunidade de pesquisa. A microscopia de campo escuro aprimorada complementada com um sistema de imagem hiperespectral pode fornecer uma solução para esse gargalo, permitindo a caracterização rápida e menos dispendiosa de nanopartículas em amostras histológicas. Este método permite imagens em nanoescala de alto contraste, bem como a identificação de nanomateriais. Para esta técnica, amostras histológicas de tecido são preparadas como seriam para microscopia de luz. Primeiro, as amostras de controle positivo são analisadas para gerar os espectros de referência que permitirão a detecção de um material de interesse na amostra. Controles negativos sem o material de interesse também são analisados para melhorar a especificidade (reduzir falsos positivos). As amostras podem então ser fotografadas e analisadas usando métodos e software para microscopia hiperespectral ou comparadas com esses espectros de referência, a fim de fornecer mapas da localização dos materiais de interesse em uma amostra. A técnica é particularmente adequada para materiais com espectros de refletância altamente exclusivos, como metais nobres, mas também é aplicável a outros materiais, como óxidos semimetálicos. Essa técnica fornece informações difíceis de adquirir a partir de amostras histológicas sem o uso de técnicas de microscopia eletrônica, que podem fornecer maior sensibilidade e resolução, mas são muito mais intensivas em recursos e demoradas do que a microscopia de luz.

Microscopia Hyperspectral é útil para a sua capacidade para identificar os materiais de uma maneira semelhante à espectrofotometria. Como indicado na Figura 1, cada material tem vários espectros característicos e uma forma geral da sua reflectância, que é único. Além disso, a Figura 1 ilustra a natureza dependente da matriz dos perfis espectrais: os perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em amostras de tecidos histológicos (painel superior) são diferentes dos perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em suspensão aquosa ( painel inferior). Ao mapear os perfis espectrais característicos para amostras desconhecidas na mesma matriz, a técnica é útil para determinar a presença ou ausência de um material, e pode também semi-quantitativamente comparar quantidades relativas de materiais em amostras. As bibliotecas de referência espectrais criados a partir de amostras de pele de controlo positivo são apropriados para mapeamento para experimentalamostras de pele. Como pode ser visto na Figura 2, as bibliotecas espectrais de referência bem mapeada para os controlos positivos correspondentes e não são mapeadas para os controlos negativos correspondentes. A vantagem mais significativa da técnica é a sua capacidade para detectar baixos níveis de materiais de interesse em amostras, bem como a diferenciá-los dos contaminantes. . Por exemplo, os nanotubos individuais pode ser observada nos pulmões durante a inalação de doses tão baixas como 40 ug num 20-30 g de rato de 25 A Figura 3 demonstra presente em amostras de pele histológicos: enquanto algumas partículas são prontamente evidente na imagem óptica de campo escuro (coluna 2), outros são detectados usando imagens hiperespectrais (coluna 3) que poderiam ter sido perdidas usando microscopia de campo claro (coluna 1) ou outros métodos. O uso de darkfield HSI também serve para melhorar a especificidade sobre microscopia de campo claro simples. Estas imagens podem então ser sujeitas a formas mais quantitativos de análise, nanálise de partículas otably via ImageJ. A microscopia de campo escuro reforçada tem várias aplicações diferentes, mesmo na ausência de imagem hiperespectral. O primeiro é a sua capacidade para gerar alta qualidade, imagens de alto contraste. Isto é melhor demonstrado na Figura 3, no qual as partículas de interesse são facilmente identificáveis, em comparação com os seus homólogos de campo claro. Estas imagens podem também ser objecto de análise quantitativa de partículas, embora na ausência de mapeamento hyperspectral, cautela é necessária para evitar confundir uma partícula contaminante de uma partícula de interesse. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Figura 1. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) em comparação com bibliotecas espectrais (nanopartículas em suspensão). Esta figura demonstra a importância de gerar uma biblioteca de referência espectral de nanomaterials de interesse na mesma matriz como amostras experimentais. A primeira linha mostra a biblioteca espectral de referência (RSL) para cada material neste estudo (alumina, sílica e óxido de cério). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Este RSL foi criado pelo método descrito neste protocolo, onde amostras de tecido de controlo positivo foram filtrados contra amostras de tecido de controlo negativo. A segunda linha mostra bibliotecas espectrais (SL) criadas a partir das nanopartículas de interesse na suspensão líquida sobre uma lâmina de vidro. Para alumina, uma pico bimodal em comprimentos de onda de 500 e 650 foi encontrado no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada em suspensão a alumina NP SL em cerca de 600. Para sílica, um pico a um comprimento de onda de cerca de 650 foi presente no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada na suspensão de sílica em NP SL arouND 600. Para céria, um pico bimodal foi encontrada em comprimentos de onda de 520 e 620 no LSR, ao passo que um pico menos distinta foi observada na céria NP SL suspensão em cerca de 560. Isto sugere que a matriz na qual estão incorporados os PN cria uma mudança de espectros que podem ser consideráveis ​​quando seleccionar os controlos para criar o SL como para a experiência específica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Figura 2. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) mapeado no controle positivo e controle negativo o tecido da pele porcina. Este valor serve como uma confirmação da ENO conforme apropriado para mapeamento para amostras experimentais, em que cada RSL (coluna da esquerda) bem mapeado no seu correspondente controlo positivo (coluna do meio) e não mapeia no seu correspondente controlo negativo (coluna da direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique h</a>ere para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Figura 3. Hyperspectral mapeamento de tecido porcino experimental pele exposta a nanopartículas de óxido de metal. Fileiras de cima para baixo correspondem a diferentes camadas da pele, de superficial a camada mais profunda: epiderme, derme e tecido subcutâneo, respectivamente. A primeira linha mostra o estrato córneo da epiderme, a partir de uma amostra de pele que foi exposta à NPs de alumina em suspensão; a segunda linha foi expostos à sílica NPs em suspensão; a terceira fileira de Ceria NPs em suspensão. Cada coluna representa a mesma área da pele trabalhada com técnicas diferentes. A primeira coluna corresponde à microscopia de campo claro (40X mag .; barra de escala = 50 mm), onde a área inscrita num quadrado vermelho foi ampliado (100X mag; barra de escala = 10 mm) com a microscopia de campo escuro reforçada (EDFM) na segunda coluna, onde setas brancas estão apontando para o alto contraste NPS. A terceira coluna foi obtida com uma câmera hyperspectral (HSI), mostrando as mesmas NPs alto contraste (setas brancas). EDFM e HSI imagens foram tiradas com uma ampliação de 100X; barra de escala = 10 mm. A quarta coluna mostra a imagem HSI mapeado contra o respectivo RSL para cada grupo de exposição, onde NPs de alumina são mostrados em verde, o NPS de sílica em vermelho, e céria NPs em amarelo, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A microscopia de campo escuro aprimorada e a imagem imagem hiperespectral com mapeamento espectral permitem a triagem, a localização, e a identificação de materiais do nanoscale em amostras histológicas com velocidade e precisão melhoradas sobre métodos tradicionais. O objetivo deste artigo é fornecer métodos para imagens de campo escuro e mapeamento hiperespectral de nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas.

Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por meio de microscopia de campo escuro e mapeamento hiperspectral. Isso é realizado primeiramente identificando uma região de interesse em uma amostra controle positivo contendo nanopartículas e capturando uma imagem de campo escuro. O segundo passo consiste em criar uma imagem hiperspectral ou cubo de dados da região de interesse utilizando a câmera hiperspectral.Em seguida, cria-se uma biblioteca espectral de referência a partir do cubo de dados do controle positivo, que é filtrado contra um controle negativo para remover quaisquer falsos positivos. O passo final consiste em utilizar a biblioteca espectral de referência para mapear amostras experimentais, identificando e localizando nanopartículas de mesma composição. Em última análise, a microscopia de campo escuro aprimorada e o mapeamento hiperspectral são utilizados para identificar nanopartículas de óxidos metálicos em amostras histológicas de maneira mais rápida e com menor consumo de recursos do que outras técnicas, como a microscopia eletrônica.Este método oferece diversas vantagens em comparação com técnicas convencionais de imageamento e caracterização de nanomateriais, como a microscopia eletrônica. A preparação da amostra é tipicamente mínima e não destrutiva. A aquisição e análise de imagens consomem menos tempo e são menos onerosas, podendo ser aplicadas ao imageamento de nanopartículas em diversas matrizes.Os indivíduos conheciam o método, mas às vezes tinham dificuldades, pois criar as amostras adequadas de controle positivo e bibliotecas espectrais de referência é desafiador e consome muito tempo. No entanto, uma vez concluídas essas etapas iniciais, as amostras experimentais podem ser avaliadas de forma bastante rápida. Embora este método possa fornecer informações sobre a penetração cutânea de nanopartículas, ele também pode ser aplicado a outras amostras biológicas, como lavados broncoalveolares e esfregaços sanguíneos, bem como a amostras não biológicas, como filtros utilizados em avaliações de exposição ocupacional.Quem demonstrará esta técnica será Plar Sosa, um estudante de medicina do meu laboratório. Comece ligando e ativando a fonte de luz, o controlador da platina, a câmera óptica, a câmera hiperspectral e o sistema de computador. Em seguida, eleve a platina e o condensador até a posição de operação e aplique cuidadosamente três a cinco gotas de óleo de imersão tipo A sobre a lente do condensador. Se forem formadas bolhas, remova o óleo e reaplique-o sobre a lente.Em seguida, posicione a amostra na platina e levante lentamente o condensador até que o óleo de imersão entre em contato com a face inferior da lâmina. Isso será perceptível pelo anel de iluminação que rapidamente se torna mais brilhante no ponto em que o óleo toca a lâmina. Com o condensador posicionado, mude para a objetiva de 10 x e, em seguida, foque e alinhe o condensador para maximizar o brilho; se necessário, ajuste os botões de alinhamento do condensador para centralizar o ponto luminoso.Abra o software de imagem óptica. Foque a amostra utilizando o botão de foco fino do objetivo. Em seguida, localize uma região de interesse.Ajuste o foco do condensador conforme necessário para equilibrar a iluminação. Clique na aba de configurações na barra de menu e depois no botão de captura de imagem. Para o evento de captura.Selecione o formato de imagem desejado e atribua um nome de arquivo para a imagem. Além disso, selecione o valor padrão de intervalo de tempo e, finalmente, clique em OK. Em seguida, acesse o menu de exposição e selecione as configurações de exposição que geram a imagem com maior contraste.Aqui, o nível é definido como 0,0%. O ganho é ajustado em 2,8 decibéis e a velocidade do obturador é definida em 56 milissegundos. Capture a imagem clicando no botão de imagem na barra de menu. Altere a objetiva para 40x e 100x.Capturando imagens com aumentos mais elevados, certifique-se de que o guia de luz está direcionado para a câmera hiperspectral e, em seguida, abra o software de imageamento hiperspectral para a aquisição dos cubos de dados HSI no software: abra o microscópio hiperspectral na barra de menu e selecione os controles do microscópio HSI. Neste local, defina o aumento do objetivo e o percurso seguro. Em seguida, altere a captura de área nas configurações e modifique o número de linhas.Neste estudo, utilizamos 720 para definir o tempo de exposição. Aqui, usamos 0,25 segundos. Deixe todas as demais configurações como padrão e clique em visualizar HSI para ver a imagem.Observe o gráfico de intensidade resultante que representa a intensidade do maior comprimento de onda à medida que o usuário se move ao longo do eixo x do centro do campo da câmera. Mova o cursor para gerar um contorno preciso do gráfico. Isso fará com que um indicador numérico de intensidade apareça à esquerda.Focalize a imagem com base nesta pré-visualização ajustando o foco fino do objetivo para realçar os picos nesta imagem. Em seguida, otimize a intensidade da luz ajustando o brilho da fonte ou o foco do condensador, ou cancele a pré-visualização e ajuste o tempo de exposição no software. Clique em capturar e observe enquanto quatro novas janelas com os nomes disponíveis aparecem.Lista de bandas. Zoom do número um. Aparecem o número um, rolagem e a banda RGB do número um.Maximize a janela da banda RGB número um, pois este é o cubo de dados, que será usado como referência futura. Clique neste cubo de dados, salve-o como um arquivo tiff e clique em ok. Clique com o botão direito na janela da imagem do cubo de dados e clique com o botão esquerdo em perfil Z do espectro.Quando a janela pop-up do perfil espectral aparecer à esquerda, clique nos pixels de interesse no alvo do cubo de dados. Os mais brilhantes são aqueles que podem ser identificados com confiança como representando o material de interesse. No menu de análise de partículas, selecione a ferramenta de filtro de partículas para identificar as partículas presentes no cubo de dados.Na nova janela pop-up definida, o máximo espectral deve exceder o valor, de modo que seja mais alto que os pixels de fundo, mas mais baixo que os materiais de interesse. O valor máximo válido é 16.000. Na janela da ferramenta de revisão de filtro de partículas, clique em selecionar tudo.Em seguida, clique em exportar para biblioteca espectral e atribua um nome à sua biblioteca espectral. Após selecionar uma amostra para servir como controle negativo, obtenha vários cubos de dados a partir da amostra. Utilizando a câmera hiperspectral, é necessário pelo menos um, mas podem ser adquiridos mais.Para aumentar a seletividade com o cubo de dados do controle negativo aberto, clique em filtrar biblioteca espectral no menu análise localizado na barra de ferramentas principal do programa, clique em abrir novo arquivo e selecione a biblioteca espectral criada anteriormente para o controle positivo como arquivo de entrada, clique em ok. Na janela filtrar biblioteca espectral cyto viva. Clique em imagem e escolha o nome do arquivo de saída para a biblioteca espectral de referência, e clique em ok.Em seguida, clique no nome do arquivo do cubo de dados do controle negativo como imagem de origem. O software analisará a biblioteca espectral e removerá cada espectro que corresponda a qualquer espectro do cubo de dados do controle negativo. Obtenha cubos de dados das amostras experimentais com o cubo de dados experimentais aberto.Clique no menu espectral no submenu de métodos de mapeamento. Abra o mapeador de ângulo espectral. Selecione o nome do cubo de dados experimentais na janela pop-up e clique em OK. Se nenhum nome de arquivo for listado, clique em abrir novo arquivo e escolha o cubo de dados experimentais.Em seguida, clique em OK na janela pop-up chamada End Member collection, SAM, e clique em importar na barra de menu. Depois, selecione a partir do arquivo de biblioteca espectral. Abra a biblioteca espectral de referência previamente criada e clique em OK.No novo janela pop-up denominada Biblioteca Espectral de Entrada, clique em selecionar todos os itens e depois clique em OK. Em seguida, clique com o botão direito em cor e selecione. Aplique cores padrão a todos, clicando em selecionar todos e depois em aplicar. Escolha então o nome do arquivo de saída e clique em OK.Abra o menu de sobreposição na janela do cubo de dados e selecione classificação. Em seguida, navegue até o nome do arquivo de saída e clique em OK. No menu da ferramenta interativa de classes, abra o menu de opções e selecione mesclar classes para criar um esquema de cores unificado.Para facilitar a análise dos dados usando outros softwares, selecione um único espectro da lista de classe base. Em seguida, selecione todas as classes, exceto as não classificadas, para mesclá-las na classe base. Depois, clique em OK.Em seguida, clique na cor base selecionada e todos os espectros correspondentes serão exibidos com essa cor. Para obter uma imagem amática que mostre os espectros correspondentes sobre um fundo preto, clique na caixa de cores não classificadas, que é preta. Por padrão, a vantagem mais significativa da técnica é a sua capacidade de identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por microscopia de campo escuro e mapeamento hiperspectral. Essas imagens demonstram este processo utilizando amostras histológicas de pele.Embora algumas partículas sejam facilmente visíveis no campo escuro, na imagem óptica, partículas adicionais são detectadas utilizando imagem hiperespectral. Aqui é mostrado tecido de pele suína na camada da epiderme, que foi exposto a nanopartículas Illumina. Um aglomerado de nanopartículas com alto contraste foi encontrado depositado sobre a camada córnea na derme, que foi exposta a nanopartículas de sílica.Vários nanopartículas de alto contraste podem ser observadas depositadas sobre o tecido conjuntivo. Finalmente, no tecido subcutâneo, que foi exposto às nanopartículas da Síria. Várias nanopartículas dispersas de alto contraste podem ser vistas depositadas ao longo dos adipócitos, identificação de nanopartículas utilizando este método.Em outras amostras de tecido, como pulmão, fígado, baço, rins e nódulos linfáticos, isso é possível. Após este procedimento, pode-se realizar a análise de imagem para responder perguntas adicionais, como a contagem de partículas e a localização das partículas. Algumas considerações e limitações, como a necessidade de controles altamente especializados e as restrições na resolução da imagem fotônica, devem ser ponderadas em comparação com os métodos convencionais.Ao selecionar as técnicas analíticas mais apropriadas para investigar questões específicas de pesquisa, optamos por demonstrar esta aplicação particular porque ela possui o potencial de complementar pesquisas atuais e futuras em nanotoxicologia. Além disso, pode contribuir para estudos sobre absorção, distribuição, metabolismo e excreção de nanopartículas em órgãos e tecidos.

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Research

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Bioengineering

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