Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral

O objetivo geral deste procedimento é identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por microscopia de campo escuro e mapeamento hiperespectral. Isso é feito identificando primeiro uma região de interesse em uma amostra de controle positivo contendo nanopartículas e capturando uma imagem de campo escuro. O segundo passo é criar uma imagem hiperespectral ou cubo de dados da região de interesse usando a câmera hiperespectral.

Em seguida, uma biblioteca espectral de referência é criada a partir do cubo de dados de controle positivo, que é filtrado em relação a um controle negativo para remover quaisquer falsos positivos. A etapa final é usar a biblioteca espectral de referência para mapear amostras experimentais para identificar e localizar nanopartículas da mesma composição. Em última análise, a microscopia de campo escuro aprimorada e o mapeamento hiperespectral são usados para identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas de maneira mais rápida e menos intensiva em recursos do que outras técnicas, como microscopia eletrônica.

Este método oferece várias vantagens sobre as técnicas convencionais de imagem e caracterização de nanomateriais, como microscopia eletrônica. Nessa amostra, a preparação é tipicamente mínima e não destrutiva. A aquisição e análise de imagens é menos demorada e dispendiosa, e pode ser aplicada para imagens de nanopartículas em uma variedade de matrizes.

Os indivíduos sabiam que o método às vezes tem dificuldades porque criar as amostras de controle positivo apropriadas e as bibliotecas espectrais de referência é desafiador e demorado. Mas uma vez que essas etapas iniciais são concluídas, as amostras experimentais podem ser avaliadas rapidamente. Embora esse método possa fornecer informações sobre a penetração cutânea de nanopartículas, ele também pode ser aplicado a outras amostras biológicas, como lavagem broncoalveolar e esfregaços de sangue, bem como amostras não biológicas, como filtros usados em avaliações de exposição ocupacional.

Demonstrando essa técnica estará Plar Sosa, um estudante de medicina do meu laboratório Comece conectando e ligando a fonte de luz, o controlador de palco, a câmera óptica, a câmera hiperespectral e o sistema de computador. Em seguida, levante o stage e o condensador para a posição de operação e aplique cuidadosamente três a cinco gotas de óleo de imersão Tipo A na lente do condensador. Se alguma bolha for criada, limpe o óleo e reaplique-o na lente.

Em seguida, posicione a amostra no stage e levante lentamente o condensador até que o óleo de imersão entre em contato com a parte inferior da lâmina. Isso será perceptível através do anel de iluminação que se ilumina rapidamente, onde o óleo entra em contato com a lâmina. Com o condensador no lugar, mude para a objetiva de 10 x e, em seguida, foque e alinhe o condensador para maximizar o brilho, se necessário, ajuste os botões de alinhamento do condensador para centralizar o ponto brilhante.

Abra o software de imagem óptica. Focalizar a amostra utilizando o botão de focagem objetiva fina. Em seguida, encontre uma região de interesse.

Ajuste o foco do condensador conforme necessário para equilibrar a iluminação. Clique na guia de configurações na barra de menu e clique no botão de captura de imagem. Para evento de captura.

Selecione o formato de imagem desejado e atribua um nome de arquivo para a imagem. Além disso, selecione o valor de lapso de tempo padrão e, finalmente, clique em OK. Em seguida, vá para o menu de exposição e selecione as configurações de exposição que criam a imagem de maior contraste.

Aqui, o nível é definido como 0.0%O ganho é definido para 2.8 decibéis e a velocidade do obturador é definida para 56 milissegundos segundos. Capture a imagem clicando no botão de imagem na barra de menus. Altere o objetivo para 40 x e 100 x.

Capturando imagens em ampliações mais altas, certifique-se de que o guia de luz esteja direcionado para a câmera hiperespectral e, em seguida, abra o software de imagem hiperespectral para aquisição dos cubos de dados HSI no software, abra o microscópio hiperespectral na barra de menus e selecione os controles do microscópio HSI. Aqui defina a ampliação objetiva e o caminho seguro. Em seguida, altere a captura de área nas configurações e altere o número de linhas.

Neste estudo, usamos 720 definir o tempo de exposição. Aqui usamos 0,25 segundos. Deixe todo o resto como padrão e clique em visualizar HSI para visualizar a imagem.

Observe o gráfico de intensidade resultante que representa a intensidade do comprimento de onda mais alto à medida que o usuário se move pelo eixo x do centro do campo da câmera. Mova o cursor para gerar um contorno preciso do gráfico. Isso fará com que um indicador numérico de intensidade apareça à esquerda.

Foque a imagem com base nessa visualização ajustando o foco fino da objetiva para aumentar a nitidez dos picos nesta imagem. Em seguida, otimize a intensidade da luz ajustando o foco do condensador de brilho da fonte ou cancele a visualização e ajuste o tempo de exposição no software. Clique em capturar e observe como quatro novas janelas com os nomes disponíveis.

Lista de bandas. Zoom número um. Número um, rolagem e banda RGB número um aparecem.

Maximize a janela de banda RGB número um, pois este é o cubo de dados, que será usado para todas as referências futuras. Certo? Clique neste cubo de dados, salve-o como um arquivo tiff e clique em OK. Clique com o botão direito do mouse na janela de imagem do cubo de dados e clique com o botão esquerdo no espectro do perfil Z.

Quando a janela pop-up do perfil espectral aparecer à esquerda, clique nos pixels de interesse no destino do cubo de dados. Os mais brilhantes são aqueles que podem ser identificados com segurança como representando o material de interesse. No menu de análise de partículas, selecione a ferramenta de filtro de partículas para identificar as partículas presentes no cubo de dados.

No novo conjunto de janelas pop-up, o máximo espectral deve exceder o valor, portanto, é maior que os pixels de fundo, mas menor que os materiais de interesse. O máximo de dados válidos é 16.000. Na janela de ferramentas de revisão do filtro de partículas, clique em selecionar tudo.

Em seguida, clique em exportar para biblioteca espectral e atribua o nome à sua biblioteca espectral. Depois de selecionar uma amostra para servir como controle negativo, obtenha vários cubos de dados da amostra. Usando a câmera hiperespectral, pelo menos uma é necessária, mas mais podem ser capturadas.

Para aumentar a seletividade com o cubo de dados de controle negativo aberto, clique em filtrar biblioteca espectral No menu de análise localizado na barra de ferramentas principal do programa, clique em abrir novo arquivo e selecione a biblioteca espectral criada anteriormente para o controle positivo como o arquivo de entrada, clique em OK. Na janela da biblioteca espectral do filtro cyto viva. Clique na imagem e escolha o nome do arquivo de saída para a biblioteca espectral de referência e clique em OK.

Em seguida, clique no nome do arquivo do cubo de dados de controle negativo como uma imagem de origem. O software analisará a biblioteca espectral e removerá cada espectro que corresponda a qualquer espectro do cubo de dados de controle negativo. Obtenha cubos de dados das amostras experimentais com o cubo de dados experimental aberto.

Clique no menu espectral no submenu de métodos de mapeamento Abra o mapeador de ângulo espectral. Selecione o nome do cubo de dados experimentais na janela pop-up e clique em OK. Se nenhum nome de arquivo estiver listado, clique em abrir novo arquivo e escolha o cubo de dados experimental.

Em seguida, clique em OK na janela pop-up chamada Coleção de membros finais, SAM, clique em importar na barra de menus. Em seguida, selecione no arquivo da Biblioteca Espectral. Abra a biblioteca espectral de referência criada anteriormente e clique em OK.

Na nova janela pop-up chamada Biblioteca Espectral de Entrada, clique em selecionar todos os itens, clique em OK. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na cor e selecione. Aplicar cores padrão a todos, clique em selecionar tudo seguido de aplicar e, em seguida, escolha o nome do arquivo de saída e clique em OK.

Abra o menu de sobreposição na janela do cubo de dados e selecione a classificação. Em seguida, navegue até o nome do arquivo de saída e clique em OK. No menu da janela de ferramentas de classe interativa, abra o menu de opções e selecione as classes de mesclagem para criar um esquema de cores unificado.

Para facilitar a análise dos dados usando outro software, selecione um único espectro na lista de classes base. Em seguida, selecione todas as classes, exceto as não classificadas, para mesclar na base. Em seguida, clique em OK.

Em seguida, clique na cor base selecionada e todos os espectros correspondentes serão mostrados nessa cor. Para obter uma imagem amatic que mostrará os espectros correspondentes sobre um fundo preto, clique na caixa de cores não classificadas, que é preta Por padrão, a vantagem mais significativa da técnica é sua capacidade de identificar nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por microscopia de campo escuro e mapeamento hiperespectral. Essas imagens demonstram esse processo usando amostras histológicas de pele.

Embora algumas partículas sejam facilmente óbvias no campo escuro, imagem óptica, partículas adicionais são detectadas usando imagens hiperespectrais. Aqui é mostrado o tecido da pele suína na camada da epiderme, que foi exposto às nanopartículas Illumina. Um aglomerado de nanopartículas de alto contraste foi encontrado depositado sobre o estrato córneo na camada dérmica, que foi exposta a nanopartículas de sílica.

Várias nanopartículas de alto contraste podem ser vistas depositadas sobre o tecido conjuntivo. Finalmente, no tecido subcutâneo, que foi exposto às nanopartículas da Síria. Várias nanopartículas dispersas de alto contraste podem ser vistas depositadas ao longo da identificação de nanopartículas de adipócitos usando este método.

Em outras amostras de tecido, como pulmão, fígado, baço, rins e gânglios linfáticos é possível. Seguindo este procedimento, a análise de imagem pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como a contagem de partículas e a localização das partículas. Certas considerações e desvantagens, como a necessidade de controles altamente especializados e as limitações na resolução da imagem fotônica, devem ser ponderadas com as dos métodos convencionais.

Ao selecionar as técnicas analíticas mais apropriadas para investigar questões de pesquisa específicas, optamos por demonstrar essa aplicação específica porque ela tem o potencial de complementar a pesquisa atual e futura em nanotoxicologia. Também pode informar pesquisas sobre absorção, distribuição, metabolismo e excreção de nanopartículas em órgãos e tecidos.