Name: A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a validar um modelo transgênico de camundongo para interromper complexos LINC de modo específico celular usando expressão induzível de EGFP-KASH2. Este método permite estudar o posicionamento nuclear em células de Purkinje cerebelares.

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Os autores agradecem à equipe do núcleo de Morfologia e Imaging, do núcleo (Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais) e do rato Genetics Núcleo da Universidade Washington em St. Louis Faculdade de Medicina Molecular Genetics. Os autores são apoiados pelo programa pequeno concessão do centro McDonnell para Celular e Neurobiologia Molecular, o Centro de Esperança para Doenças Neurológicas, o National Eye Institute (# R01EY022632 a DH), um Centro National Eye Institute Núcleo Grant (# P30EY002687) e um donativo incondicional da Investigação para Prevenir Cegueira ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Washington em St. Louis. 1. Rato Reprodução e Genotipagem <ol><li> Raça ratos com Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratos para produzir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Embora o restante deste protocolo centra-se na utilização da linha de Tg (PCP2-Cre) do rato para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje no cerebelo, um procedimento semelhante pode ser seguido com qualquer outra Tg (CRE) de ratinho ( A Figura 2A). </li><li> Realizar genotipagem para identificar filhotes abrigando ambos os transgenes EGFP e Cre como descrito anteriormente 19. </li></ol> 2. Preparação de Materiais para Dissecção e Tissue Colecção <ol><li> Preparação de 100 ml de 30% de sacarose em PBS (30 g de sacarose / 100 ml de PBS 1x) e armazenar a -20 ° C. O dia de tecido harvesting, degelo e de carga ~ 30-35 ml da solução de sacarose em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial. </li><li> Preparar 40 ml de 4% de PFA em PBS (10 mL 16% de paraformaldeído e 30 ml de PBS). Carga ~ 30-35 ml de 4% de PFA em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial. </li><li> Encha uma placa de cultura de tecido de 10 cm com 10 ml de PBS por dissecção de tecidos. </li><li> Preparar um cocktail de cetamina / xilazina que consiste em 16 mg / ml de cetamina e 3 mg / ml de xilazina. </li><li> Prepara-se uma solução de etanol a 70% para a dissecação. </li></ol> 3. Dissecção e Recolha de Tecidos <ol><li> Usando uma seringa de 1 ml, injectar 500 ul do cocktail de cetamina / xilazina por 25 gramas de peso corporal e esperar para ~ 15 min. Em alternativa, utilizar um outro método de sedação institucional aprovado que é apropriado para o sistema biológico de interesse. </li><li> Após sedação, aperte suavemente a pata traseira para confirmar a falta de resposta à dor, o pino todas as patas em uma bandeja de isopor com o lado dorsal dorato virado para baixo. </li><li> Pulverizar o abdômen com 70% de etanol e fazer uma incisão de abdômen inferior para a parte superior da caixa torácica para ter acesso ao coração. </li><li> Fazer uma pequena incisão no átrio direito do coração e inserir a seringa contendo a solução de sacarose a 30% para o ventrículo esquerdo do coração. </li><li> Perfundir a solução a uma taxa de ~ 2-5 ml por min. Quando vazio, remover a seringa e repita com a solução PFA 4%. </li><li> Desafixar o rato da bandeja de isopor e decapitar para acessar o cérebro. </li><li> Retire a pele ao redor da cabeça do animal usando uma pinça e tesouras. Fazer um buraco na parte posterior do crânio com uma agulha e remova cuidadosamente o crânio com tesouras e pinças de dissecação. </li><li> Uma vez que o cérebro é claramente acessíveis, utilizar uma pinça para remover o cerebelo e colocá-lo em PBS. Dividir o cerebelo no plano sagital com um bisturi e transferir para a solução de sacarose a 30% durante a noite a 4 ° C. Nota: Para prepararsão secções de parafina, fixar o cerebelo durante a noite a 4 ° C em 4% de PFA antes da incorporação do tecido e de corte. </li></ol> 4. Tissue Processing e Seccionamento <ol><li> Prepara-se uma suspensão de gelo seco e 2-metilbutano. Permitir que a temperatura do banho a equilibrar durante 5 min. </li><li> Encher um composto com cryomold PTU e colocar uma metade do cerebelo bissectado no molde. </li><li> Usando um microscópio de dissecção e um par de fórceps posição do cerebelo, de modo que a superfície bissectado (perto da linha média do cerebelo) é voltada para cima. </li><li> Transferir a cryomold para a pasta de gelo seco durante 5 minutos até que o composto de outubro formou uma matriz sólida em torno das branco espécime de tecido. Nota: Os espécimes congelados podem agora ser armazenados a -20 ° C se necessário. </li><li> Etiqueta pré-tratados lâminas poli-lisina para a recolha de tecidos e secções do crióstato preparar de acordo com as instruções do fabricante, a fim de recolher 15 um secções do Cerebellum. Para coletar as seções, entre em contato com cuidado a seção de outubro com o lado revestido a poli-lisina do slide. Para preservar a orientação da secção, não rodam a lâmina durante este passo. </li><li> Cortes de tecido loja C a -20 ° até prosseguir com coloração e tratamento de imagens. </li></ol> 5. Coloração e imagem das Cerebelo Secções <ol><li> Prepare as seguintes soluções antes da coloração de tecidos: ~ 50 ml de PBS ~ 5-10 ml de 4% de PFA em PBS ~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS </li><li> Seções cerebelar descongelar. Importante, minimizar sua exposição a qualquer fonte de luz contínua e intensa para evitar o desbotamento de EGFP. </li><li> Usando uma caneta barreira hidrofóbica, desenhe um retângulo em torno das secções de tecido. </li><li> Post-fixar as seções com PFA 4% para 5 min. Use líquido suficiente para cobrir toda a área delineada pela barreira hidrofóbica (usualmente ~ 500 mL). Usando um aspirador ou pipeta, remover o fixador ser particularmente cuidadosos para não perturbar as secções de tecido. </li><li> Com uma pipeta, aplicar suavemente PBS na lâmina sem perturbar as secções de tecido. Após 5 min usar o vácuo ou pipeta para remover cuidadosamente o líquido. Repetir a lavagem de PBS um total de três vezes. </li><li> Usando uma pipeta, aplicam-se cuidadosamente uma diluição adequada de anticorpos primários (3 ul Calbindina e / ou anticorpo Nesprin2 por 900 ul de solução) em 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS. Incuba-se durante uma hora à temperatura ambiente no escuro. Nota: EGFP-KASH2 será visível por microscopia de fluorescência directa em secções congeladas, e não é necessário utilizar um anticorpo anti-EGFP. No entanto, se secções de parafina foram preparadas, imagiologia de EGFP-KASH2 requer imunodetecção com um anticorpo anti-EGFP. </li><li> Remover a solução de anticorpos e enxaguar com PBS três vezes. </li><li> Prepare 1: 1000 de anticorpos secundários diluições Alexa Fluor-em 0,5% de Triton X-100,10% de soro de burro em PBS e armazenar no escuro. </li><li> Suavemente remover o enxaguamento final PBS e aplicar a diluição do anticorpo secundário durante uma hora no escuro. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário, enxaguar e lavar a secção de três vezes. Se necessário, aplicar um corante nuclear, tais como DAPI (~ 300 nM), durante a primeira aplicação de PBS. </li><li> Completamente remover a solução PBS de todo o tecido e lugar ~ 5-7 ul de montagem de mídia na secção de tecido. Coloque uma lamela de vidro na parte superior da secção de tecido e retiradas para ~ 15-30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Usar um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados para visualizar EGFP e quaisquer outros comprimentos de onda adequados para os anticorpos secundários utilizados em passos de 5,8 / 5,9. Em fatias do cerebelo, utilizar uma objectiva de 20x para visualizar EGFP-KASH2 jantes nucleares. </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
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<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O passo mais importante para estudar o papel com sucesso de complexos LINC in vivo utilizando o modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) é identificar uma linha de murganho adequados Cre (s). Com efeito, se Cre está activo em outros tipos de células-envolvidas em vias semelhantes, que podem complicar a interpretação dos resultados. Por isso, é importante examinar as células vizinhas, como mostrado nas camadas celulares e moleculares granulares do cerebelo (Figura 2B). Do mesmo modo, para maximizar ...

O envelope nuclear (NE) separa o nucleoplasma do citoplasma. É composto por uma membrana nuclear interna e externa (INM e ONM, respectivamente) que se ligam em poros nucleares. O lúmen delimitada pelas duas membranas é chamada o espaço perinuclear (SNP). A ONM é uma extensão do retículo endoplasmático rugoso (ER), eo INM adere à lâmina nuclear, uma malha de nuclear-V Tipo de filamentos intermediários representados por A e do tipo B lamins 1,2. Ligantes do Nucleoskeleton e do citoesqueleto (LINC) são complexos macromoleculares conjuntos que abrangem todo o envelope nuclear para ligar fisicamente o interior do núcleo de filamentos do citoesqueleto e motores moleculares (Figura 1A). Eles consistem de interações entre motivos evolutivamente conservadas que caracterizam duas famílias de proteínas transmembrana integrantes do NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteínas e Nesprins (SPectRINS Envelope Nuclear). Nos mamíferos, Sun1 e Sun2 arproteínas transmembranares e do INM nucleoplásmica cuja região N-terminal interage directamente com A e do tipo B laminas 3-5. Por outro lado do INM, dentro do SNP, proteínas Sun Harbor um estiramento evolutiva-conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminais do domínio chamado sol. SUN domínios interagir diretamente com o evolucionário conservado KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologia) de domínio, a assinatura molecular de Nesprins. Kash domínios consistem de um troço de ~ 30 aminoácidos C-terminais que se projeta para o SNP seguido por um domínio transmembranar 6. Pelo menos quatro genes distintos (Nesprin1-4 Nesprin) codificam proteínas contendo KASH que localizam no NE 7. As regiões citoplasmáticos de Nesprins, cujos tamanhos variam de ~ 50 kDa (Nesprin4) para uma surpreendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contêm spectrin múltiplas repetições, bem como os motivos específicos permitindo a sua interação com os componentes do citoesqueleto de actina, tais como, plectina e motores moleculares 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Estudos em vertebrados e invertebrados mostraram que Lamin / Sun / Nesprin / motores moleculares constituem um &quot;eixo&quot; evolutivamente conservada controlar a migração e ancoragem nuclear. Vários knock-out (KO) modelos do rato do LINC componentes complexos têm sido descritos e eram instrumentais em fornecer um quadro para entender os papéis de proteínas Sun e Nesprin no NE durante o desenvolvimento dos mamíferos 9,14,15. No entanto, estes modelos apresentam várias desvantagens significativas, principalmente: 1) dificuldade em interpretar fenótipos devido à célula efeitos não-autónomos, 2) dificuldade em distinguir as contribuições fenotípicas de KASH contendo vs. KASH-less Nesprin isoformas 16, 3) a redundância funcional de proteínas Sun e Nesprin no NE em numerosos tipos de células requer esquemas de melhoramento complexas para inativar todas as interacções SUN-Kash em camundongos 17 e 4) a letalidade perinatal de camundongos deficientes para a KASH-domínio de ambosNesprins1 e 2 opõe-se à análise de fenótipos adulto 18. Este protocolo descreve um novo modelo de ratinho concebido para romper todas as interacções SOL-Kash in vivo, numa célula de forma autónoma e regulada pelo desenvolvimento, ignorando assim muitas das desvantagens descritas acima. Este modelo de ratinho Cre / à base de LOX assenta em dois conceitos importantes: 1) o domínio KASH de qualquer proteína Nesprin conhecida é suficiente para atingir EGFP ao NE em sistemas de cultura de células e 2) domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kash, portanto, sobre-expressão de qualquer domínio KASH vai saturar todos os domínios SUN endógenos e inactivam os complexos LINC de uma forma dominante negativa 17 (Figura 1B). Este protocolo descreve a colheita de tecidos e etapas de processamento usados ​​para confirmar a interrupção de todas as interações SUN-Kash em células de Purkinje do cerebelo.

<table><tbody><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Solução de Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>de Adesão StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Calbindina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Abcam</td><td></td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Anticorpo</td><td></td><td></td><td>Anteriormente descrito na Ref. 21</td></tr><tr><td>Montagem Fluorescente Mídia</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-metil butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

a validação de um modelo de camundongo para disrupt complexos linc de um modo específico de célula

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

A migração nuclear e a ancoragem em tecidos em desenvolvimento e adultos dependem fortemente de grandes conjuntos de proteínas macromoleculares chamados LInkers do Nucleoesqueleto e Citoesqueleto (complexos LINC). Esses andaimes de proteínas abrangem o envelope nuclear e conectam o interior do núcleo aos componentes do citoesqueleto citoplasmático circundante. Os complexos LINC consistem em duas famílias de proteínas evolutivamente conservadas, proteínas Sun e Nesprins que abrigam motivos de assinatura molecular C-terminal chamados domínios SUN e KASH, respectivamente. As proteínas Sun são proteínas transmembranares da membrana nuclear interna cujo domínio nucleoplásmico N-terminal interage com a lâmina nuclear, enquanto seus domínios SUN C-terminal se projetam para o espaço perinuclear e interagem com o domínio KASH de Nesprins. As isoformas canônicas de Nesprin têm um terminal N de tamanho variável que se projeta no citoplasma e interage com os componentes do citoesqueleto. Este protocolo descreve a validação de uma estratégia de camundongo transgênico dominante-negativo que interrompe as interações endógenas SUN / KASH de maneira específica do tipo de célula. Nossa abordagem é baseada no sistema Cre / Lox que ignora muitas desvantagens, como letalidade perinatal e fenótipos não autônomos de células que estão associados a modelos germinativos de inativação do complexo LINC. Por esse motivo, este modelo fornece uma ferramenta útil para entender o papel dos complexos LINC durante o desenvolvimento e a homeostase em uma ampla gama de tecidos.

Este protocolo ilustra a utilidade do (EGFP-KASH2 / CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como indicado ...

As proteínas do envelope nuclear desempenham um papel central em muitos processos biológicos básicos e têm sido implicadas em uma variedade de doenças humanas. Este protocolo descreve um novo modelo de camundongo baseado em Cre / Lox que permite o controle espaço-temporal da ruptura dos complexos LINC.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

O objetivo geral deste experimento é ilustrar a utilidade de um modelo de camundongo transgênico, que permite a expressão induzível e direcionada de uma proteína marcada com EGFP, a cache dois, in vivo, e a consequente interrupção de complexos de ligação endógenos. Neste experimento, a expressão da cache dois marcada com fluorescência será direcionada a células de Purkinje cerebelares. Essa abordagem genética pode responder perguntas fundamentais sobre o papel dos complexos de ligação no posicionamento nuclear em diversos tecidos.A expressão induzível e direcionada de E-G-F-P-K dois apresenta várias vantagens. Primeiro, requer um único esquema de cruzamento de camundongos cay com qualquer linhagem cruise existente. Segundo, esta abordagem contorna a letalidade perinatal observada em modelos murinos de mutações na linha germinativa de componentes do complexo link.Por fim, este método permite estudar a fisiologia de complexos de ligação em células ou tecidos específicos in vivo. Chloe Potter, membro do laboratório, mostrará a você os diferentes passos necessários para visualizar a E-G-F-P-K dois em células de Purkinje cerebelares.Para iniciar, cruze camundongos clac Z com camundongos PCP dois CRE para produzir camundongos PCP dois CAG C dois, conforme descrito em publicações anteriores. Quando as ninhadas resultantes nascerem, realize a genotipagem. Para identificar aqueles que carregam os transgenes EGFP e Cree, conforme descrito anteriormente, prepare 50 mililitros de uma solução de 30% de sacarose em PBS e armazene-a a menos 20 graus Celsius até o dia da coleta de tecido na idade apropriada. Realize uma perfusão transcardíaca dos camundongos sob anestesia para preparar o tecido cerebral para a dissecação, conforme descrito no protocolo escrito. Coloque o cérebro dissecado em uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros contendo 10 mililitros de PBS e separe o cerebelo dos hemisférios cerebrais.Em seguida, use um bisturi para dissecar o cerebelo no plano sagital e transfira as secções para uma solução de sacarose a 30% e armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Prepare uma pasta de gelo seco e butano metílico. Deixe a temperatura do banho equilibrar por cinco minutos.Em seguida, preencha uma fôrma de criomoldagem com composto OCT e coloque uma metade do cerebelo dissecado na fôrma utilizando um microscópio estereoscópico e uma pinça. Posicione o cerebelo de modo que a superfície dissecada, próxima à linha média do cerebelo, fique voltada para cima na fôrma. Em seguida, transfira a fôrma de criomoldagem para a suspensão de gelo seco por cinco minutos, até que o composto OCT tenha formado uma matriz sólida e branca ao redor da amostra tecidual.Armazene o espécime embutido a menos 20 graus Celsius até o momento de uso. Rotule lâminas de politlisina pré-tratadas para coletar cortes teciduais e monte o bloco de tecidos cerebelares no suporte de tecido com OCT fresco. Uma vez que o bloco esteja firmemente fixado, posicione o suporte de tecido e corte fatias de 40 micrômetros para remover o excesso de OCT até que o tecido seja alcançado.Defina a espessura em 15 micrômetros e colete as seções fazendo contato cuidadoso da seção de OCT com o lado do lâmina revestido com polilisina. Armazene as seções de tecido a menos 20 graus Celsius até o momento de prosseguir com a coloração e a imagem. Quando estiver pronto para continuar, descongele as seções cerebelares no escuro para evitar o desbotamento das proteínas fluorescentes.Usando uma caneta com barreira hidrofóbica, desenhe um retângulo ao redor da periferia das seções de tecido. Adicione cerca de 500 microlitros de paraformaldeído a 4% às seções durante cinco minutos para pós-fixar o tecido. Em seguida, use um vácuo para aspirar o fixador, tomando particular cuidado para não perturbar as seções de tecido com uma pipeta.Aplicar suavemente PBS sobre a lâmina sem perturbar as seções de tecido. Após cinco minutos, utilizar a pipeta com vácuo para cuidadosamente remover o líquido; repetir a lavagem com PBS por um total de três vezes. Em seguida, adicionar cerca de 500 microlitros de solução bloqueadora às lâminas e incubar por 10 minutos.Remova e, em seguida, substitua a solução bloqueadora pela mesma solução contendo diluições de 1 a 300 dos anticorpos cal binding ou nesin dois. Em seguida, remova a solução de anticorpo e lave as lâminas com PBS três vezes. Incube as lâminas por uma hora à temperatura ambiente no escuro.Em seguida, prepare uma diluição de 1 para 1000 do anticorpo secundário anti-US Alexa Floor 5 94 para as lâminas marcadas com ligante bovino e anti-Alexa Fluor 5 94 para as lâminas marcadas com Nesprin dois na solução bloqueadora e armazene as soluções no escuro até o momento de uso. Remova cuidadosamente a última lavagem com PBS e cubra os cortes com os anticorpos secundários diluídos por uma hora no escuro. Após a incubação, remova a solução de anticorpo secundário.Em seguida, aplique uma coloração nuclear, como DPI a 300 nanomolares em PBS, durante cinco minutos. Depois, lave as seções duas vezes em PBS. Remova o máximo possível da solução de PBS e cubra a seção tecidual com uma gota de meio de montagem.Coloque uma lamínula de vidro sobre a seção do tecido evitando bolhas de ar e deixe repousar por 15 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, utilize um microscópio de fluorescência para visualizar a marcação por anticorpos e as proteínas fluorescentes. Para cortes do cerebelo, utilize uma objetiva de 20 x ou 40 x.Para visualizar os dois contornos nucleares do E-G-F-P-C conforme mostrado aqui, o E-G-F-P-C dois pode ser diretamente visualizado em fatias cerebelares no canal Fitzy. Além disso, a colocalização do EGFP com ligação ao anticorpo antivaca, que rotula especificamente as células de Purkinje, confirma que a expressão do E-G-F-P-C dois está restrita às células de Purkinje dentro das células de Purkinje. O EGFP cache dois é direcionado ao envelope nuclear, conforme indicado por padrões positivos para EGFP semelhantes a contornos observados ao redor do núcleo.Neste exemplo, a expressão de EGFP cache dois foi detectada em mais de 70% das células de Perkin positivas para ligação de cow. EGFP cache dois desloca a nesprina endógena do envelope nuclear por meio da saturação dos domínios sun disponíveis. Assim, a NESIN endógena dois é deslocada do envelope nuclear das células de Perkin que expressam EGFP cache dois.Embora as células Perkin que não expressam E-G-F-P-C dois retenham a nesina dois endógena na membrana nuclear conforme esperado no controle interate, as quais não expressam a recombinase CRE exibem NESIN dois na membrana nuclear de toda a população de células de biquíni Um. Assim, blocos de tecidos CT estão disponíveis. E-G-F-P-K dois pode ser visualizado em cerca de quatro horas.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a extensão da fixação com PFF e/ou as condições de inclusão podem afetar drasticamente a antigenicidade do seu epítopo. Por isso, é muito importante determinar as condições ideais de fixação que preservem o seu epítopo específico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o modelo de camundongo transgênico CK dois para direcionar a expressão do VGFP cashew a tecidos específicos.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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