A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

O objetivo geral deste experimento é ilustrar a utilidade de um modelo de camundongo transgênico, permitindo a expressão induzível e direcionada de um cache de EGFP marcado com fluorescência, dois peptídeos in vivo e a interrupção resultante de complexos de ligação endógena. Neste experimento, a expressão do cache dois marcado com fluorescência será direcionada para células Perkin cerebelares. Essa abordagem genética pode abordar questões-chave sobre o papel dos complexos de ligação no posicionamento nuclear em diferentes tecidos.

A expressão induzível e direcionada de E-G-F-P-K dois tem várias vantagens. Primeiro, requer um único esquema de reprodução de camundongos caigar com qualquer cepa de cruzeiro existente. Em segundo lugar, essa abordagem ignora a alidade perinatal observada em modelos de camundongos de mutações germinativas de componentes complexos de ligação.

Finalmente, este método permite estudar a fisiologia de complexos de ligação dentro de células ou tecidos específicos. In vivo. Chloe Potter, membro do laboratório, mostrará as diferentes etapas necessárias para visualizar o E-G-F-P-K dois em células G de Burkin cerebelares.

Para começar, crie camundongos CLAC Z com PCP dois camundongos CRE para produzir PCP dois CAG C dois camundongos conforme descrito em publicações anteriores. Quando os filhotes resultantes nascerem, faça a genotipagem. Para identificar aqueles que abrigam EGFP e Cree Transgenes conforme descrito anteriormente, prepare 50 mililitros de uma solução de sacarose a 30% em PBS e armazene-a a 20 graus Celsius negativos até o dia da colheita do tecido na idade apropriada, realize uma perfusão cardio trans dos camundongos sob anestesia para preparar o tecido cerebral para dissecação conforme descrito no protocolo escrito, coloque o cérebro dissecado em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS e separe o cerebelo do cérebro.

Em seguida, use um bisturi para dissecar o cerebelo no plano sagital e transfira as seções para uma solução de sacarose a 30% e armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Prepare uma pasta de gelo seco e dois metilbutano. Deixe a temperatura do banho se equilibrar por cinco minutos.

Em seguida, preencha um molde criogênico com composto OCT e coloque metade do cerebelo dissecado no molde usando um microscópio de dissecação e um par de pinças. Posicione o cerebelo de forma que a superfície bi dissecada que está perto da linha média do cerebelo fique voltada para cima no molde. Em seguida, transfira o molde criogênico para a pasta de olho seco por cinco minutos até que o composto OCT tenha formado uma matriz branca sólida ao redor da amostra de tecido.

Armazene a amostra embutida a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário. Rotular lâminas de polilisina pré-tratadas para a recolha de secções de tecido e montar o bloco de tecidos cerebelares no suporte de tecido com OCT fresco. Assim que o bloco estiver firmemente preso, monte o porta-lenços e raspe fatias de 40 micrômetros para remover o excesso de OCT até que o tecido seja alcançado.

Defina a espessura em 15 micrômetros e colete as seções entrando em contato cuidadosamente com a seção OCT com o lado revestido de polilisina da lâmina. Armazene as seções de tecido a 20 graus Celsius negativos até prosseguir com a coloração e a imagem. Quando estiver pronto para continuar, descongele as seções cerebelares no escuro para evitar o desbotamento das proteínas fluorescentes.

Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe um retângulo ao redor do perímetro das seções de tecido. Adicione cerca de 500 microlitros de aldeído paraforme a 4% às seções por cinco minutos para fixar o tecido. Em seguida, use um vácuo para aspirar o fixador, tomando cuidado especial para não perturbar as seções de tecido com uma pipeta.

Aplique suavemente PBS na lâmina sem perturbar as seções de tecido. Após cinco minutos, use a pipeta a vácuo mais para remover cuidadosamente o líquido, repita o enxágue PBS um total de três vezes. Em seguida, adicione cerca de 500 microlitros de solução de bloqueio às lâminas e incube-as por 10 minutos.

Remover e substituir a solução de bloqueio pela mesma solução contendo uma a 300 diluições de anticorpos de ligação de cal ou nesina dois. Em seguida, remova a solução de anticorpos e enxágue as lâminas com PB S3 vezes. Incube as lâminas por uma hora em temperatura ambiente no escuro.

Em seguida, prepare uma diluição a 1000 de anti-US Alexa piso 5 94 para as lâminas rotuladas de encadernação de vaca e anti Alexa Fluor 5 94 para as duas lâminas rotuladas Nesprin na solução de bloqueio e armazene as soluções no escuro até que sejam necessárias. Remova suavemente o enxágue final do PBS e cubra as seções com os anticorpos secundários diluídos por uma hora no escuro. Após a incubação, remova a solução secundária de anticorpos.

Em seguida, aplique a coloração nuclear, como DPI, a 300 nanomolares em PBS por cinco minutos. Depois, enxágue as seções mais duas vezes em PBS. Remova o máximo possível de solução de PBS e cubra a seção de tecido com uma gota de meio de montagem.

Coloque uma lamínula de vidro em cima da seção de tecido evitando bolhas de ar e reserve por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, use um microscópio fluorescente para visualizar a coloração de anticorpos e proteínas fluorescentes. Para fatias cerebelares, use uma objetiva de 20 x ou 40 x.

Para visualizar os dois aros nucleares do E-G-F-P-C como mostrado aqui, o E-G-F-P-C dois pode ser visualizado diretamente em fatias cerebelares no canal Fitzy. Além disso, a colocalização de EGFP com ligação de vaca, que rotula especificamente as células de Perkin, confirma que a expressão de E-G-F-P-C dois está confinada a células de perkin dentro das células de Perkin. O cache dois do EGFP é direcionado para o envelope nuclear, conforme indicado pelos padrões semelhantes ao RIM positivo do EGFP observados ao redor do núcleo.

Neste exemplo, a expressão do cache dois do EGFP foi detectada em mais de 70% das células Perkin positivas de ligação de vacas. O cache EGFP dois desloca a nesprina endógena do envelope nuclear através da saturação dos domínios solares disponíveis. Consequentemente, a NESINA dois endógena é deslocada do envelope nuclear das células de Perkin que expressam o cache dois do EGFP.

Enquanto as células de Perkin que não expressam E-G-F-P-C duas retêm nesina endógena dois no envelope nuclear como controle esperado interate, que não expressam CRE recombinase exibem NESIN dois no envelope nuclear de toda a população de células do biquíni um. Portanto, blocos de tomografia computadorizada de tecidos estão disponíveis. E-G-F-P-K dois podem ser visualizados em cerca de quatro horas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a extensão da fixação do PFF e/ou condições de incorporação podem afetar drasticamente a antigenicidade do seu epítopo. Portanto, é muito importante determinar as condições ideais de fixação que preservam seu epítopo específico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o modelo de camundongo transgênico CK two para direcionar a expressão do caju VGFP para tecidos específicos.