Name: Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a preparar veículos celulares com nanobastões de ouro para imagem fotoacústica de tumores usando macrófagos. Este método inovador melhora a estabilidade óptica dos agentes de contraste plasmônicos.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Regione Toscana e da Comunidade Europeia no quadro da bolha ERANET + Projetos LUS e BI-TRE.

Nota: Todas as concentrações de ouro nanorods são expressos em termos de Au molaridades nominais. Para efeito de comparação com outras obras, note que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 um nanobastões de ouro, no nosso caso. 1. Preparação de Cationic ouro nanobastões Nota: O método começa com a síntese de brometo de cetrimónio (CTAB) nanorods ouro -capped por a redução autocatalítico de HAuCl 4 com ácido ascórbico, de acordo com o protocolo apresentado por Nikoobakht et al 25 e adaptado de acordo com Ratto et al 26... Em seguida, esses nanobastões de ouro são modificados, a fim de ganhar mais biocompatibilidade e afinidade para membranas plasmáticas, pela combinação de polietilenoglicol vertentes 10, 11, 27, 28 e compostos de amônio quaternário 22. <ol><li> Purificar 24 ml CTAB-tampado nanobastões de ouro em um ConcentraçãN de 450 uM Au por dois ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Certifique-se de que a razão entre o volume morto para o volume inicial é de cerca de 1/200 ou inferior para todos os passos de centrifugação neste protocolo. Use CTAB 500 uM aquoso tal como uma solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em tampão de acetato de 6 ml de 100 mM a pH 5, contendo 500 uM de CTAB e 0,005% (v / v) de polissorbato 20. </li><li> Adicionar 30 ul de 10 mM de solução aquosa de alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etilenoglicol) (PM ~ 5000) e deixar a reagir durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 30 ul de 100 mM de (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N-brometo de trimetilamónio em sulfóxido de dimetilo e deixar em repouso durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Em seguida, adicionar 18 mL de 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água e purifica-se estas partículas por quatro ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Use 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água como solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em 2,4 ml de PBS estéril, a pH7.4. A concentração nominal final do ouro é de 4,5 mm. </li></ol> 2. Carregamento de Murino macrófagos com ouro nanobastões <ol><li> Utilizar a linha de células de monócitos / macrofágica J774A.1 e DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina como meio de cultura. Placa de 5 x 10 5 células em quatro placas de Petri de 60 mm de diâmetro e permitir-lhes crescer durante 24 h, de modo a ser subconfluentes no momento de desprendimento (ver passo 2.2). <ol><li> Durante todo o protocolo, manter as células em condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO2, 95% de ar e 100% de humidade relativa). Use uma câmara de fluxo laminar e equipamentos de proteção pessoal adequado para manipular as células. </li></ol></li><li> Após 24 h, carregar as células com nanobastões de ouro catiônicos e prepará-los para ser incorporado em filmes de quitosana: <ol><li> A fim de permitir que as partículas a ser absorvido pelas células, adiciona-se uma alíquota de 4,5Au mM nanorods ouro catiónico em PBS em cada caixa de Petri, de modo a atingir uma concentração final de 100 uM de Au. Deixar os pratos de Petri em incubação durante 24 horas. </li><li> Em seguida, observe as células sob um microscópio óptico para confirmar as suas boas condições eo upload. As células devem exibir a sua morfologia normal e um número de vesículas intracelulares escuras. Separe as células por um raspador, fundir os de duas placas de Petri, a fim de alcançar uma quantidade adequada de células para os seguintes passos (pelo menos 2 x 10 6 células), e centrifuga-se-lhes (120 xg, 6 min) para eliminar quaisquer excesso de ouro nanorods catiónicos. O pellet celular deve olhar quase preto. </li><li> Suspende-se o sedimento em 2 ml de PBS e contar as células pela utilização de uma câmara de Burker. Centrifugar a suspensão contendo 2 x 10 6 células (120 x g, 6 min) e fixar sua sedimento em 2 ml de 3,6% (w / v) de formaldeído em PBS, durante dez minutos à temperatura ambiente. Finalmente, lavar este sedimento três vezes por centrifugatde iões (120 xg, 6 min), a fim de remover o fixador. Use PBS como solução de lavagem. </li></ol></li></ol> 3. incrustação de macrófagos em Películas de quitosano Nota: As propriedades peculiares de quitosana 26, 27, 28, 29 são exploradas para produzir fantasmas biomiméticos que contêm macrófagos corados com nanobastões de ouro catiônicos. No que diz respeito a outros hidrogeles, tais como agarose, quitosano permite filmes que são muito mais forte e mais fino, que é crítico para microscopia PA 6. A fabricação desses fantasmas é realizada de acordo com protocolos anteriores 29, 30, 31, com algumas modificações, conforme prescrito no os seguintes 30. <ol><li> Prepara-se uma acidificada (pH 4,5, obtidos por adição de ácido acético) e viscoso 3% (w / v) de quitosano de baixo peso molecular (PM médio de 120 kDa) solução, misturá-lo completamente edeixá-lo homogeneizar durante 24 h a 40 ° C. </li><li> Em seguida, misturar macrófagos de murino contendo ouro nanorods catiónico (2 X 10 6 células) com 500 ul de solução de quitosano. </li><li> De modo a obter ~ 50 um de espessura fantasmas, despeje 250 mg da mistura em moldes de 1,91 cm 2 de poliestireno e deixá-los sob uma corrente de azoto durante 24 h. Posteriormente, o tratamento destas amostras com 500 uL de NaOH 1 M, de modo a induzir a reticulação, e lavá-los com 10 ml de água ultrapura. </li></ol> 4. Teste de Estabilidade Conversão de Fotoacústica Nota: A estabilidade da conversão PA é investigada por meio de experimentos PA com a instalação de fabricação caseira que é descrito na ref 6. <ol><li> Suspender um filme de quitosano contendo os macrófagos em água desionizada, por exemplo, pelo uso de um suporte de plástico imersas em uma placa de Petri, de modo a manter uma distância de aproximadamente 5 mm da parte inferior da placa. Coloque esta placa em um estágio XY micrométricaa fim de controlar a posição da amostra. </li><li> Concentre-se um feixe de laser com ~ 5 duração nseg pulso em ressonância com a banda plasmónico longitudinal dos nanorods ouro (por exemplo, a partir de um oscilador paramétrico óptico bombeado pela terceira harmónica de um laser de Nd comutação-Q: YAG com o comprimento de onda de 400 - 2500 nm e duração de impulso de 5 ns) perpendicular à superfície da película com um diâmetro do ponto ~ 300 uM. <ol><li> Coloque um atenuador em frente da saída do laser para ajustar a fluência do laser e utilizar um divisor de feixe para incidir parte do feixe de laser a um medidor de energia (por exemplo, um detector piroeléctrico) e monitorizar as flutuações de fluência. Manter a fluência óptica abaixo de ~ 1 mJ / cm2, por impulso durante o alinhamento. Utilize óculos de segurança a laser adequada sempre que o laser é ligado. </li></ol></li><li> Mergulhar um transdutor de ultra-sons (gama de frequência de 1 - 20 MHz) para a placa de Petri ~ 2 milímetros fora da superfície da película e ajustar a sua posição utilizando as traduções micrométricase fases de rotação para maximizar o sinal PA emitida a partir do filme. </li><li> Determinar uma fluência sonda F LO que não danificar a amostra 6: <ol><li> Irradiar um ponto aleatório da amostra a uma fluência de cerca de 1 mJ / cm2, por impulso de pelo menos 500 pulsos. Para cada pulso, PA adquirir o sinal correspondente a partir do transdutor de ultra-sons e de fluência laser a partir do medidor de energia com um osciloscópio. Nomeie a fluência médio como teste F LO. </li><li> Calcular a intensidade do sinal de PA como a sua amplitude de pico-a-pico em função do número de impulsos. A fim de contrabalançar as flutuações de intensidade de laser, normalizar a amplitude de cada sinal de PA para o rácio do seu próprio fluência a julgamento F LO. Analisar a tendência de a intensidade normalizada PA como uma função do número de impulsos e verificar a sua estabilidade ao longo do tempo. </li><li> No caso de instabilidade, repita os passos 4.4.1 a 4.4.3 com um valor menor de F LO <sup&gt; julgamento. No caso de estabilidade, repeti-los com um valor de ensaio F LO superior em ~ 10%, até uma perda de estabilidade surge. Defina a sonda fluência F LO como o segundo valor mais alto de julgamento F LO, que garante estabilidade. </li></ol></li><li> Meça uma fluência limiar reformulação: <ol><li> Escolha outro ponto aleatório da amostra e sondar uma intensidade PA média (I LO a) mais de 500 pulsos a F LO. </li><li> Definir uma fluência nominal superior a F LO e entregar 50 pulsos. Nome sua influência média, como F exc. </li><li> Sondar uma intensidade média PA (I LO b) mais de 500 pulsos a F LO mais uma vez. Calcular a relação R = I LO b / I LO a. Um valor de R abaixo da unidade dá provas de uma alteração irreversível das propriedades ópticas da amostra. </li><li> Utilizar a plataforma XY micrométrico para mover o filme e alterar o poinT da amostra ao acaso. Repita os passos 4.5.1 a 4.5.4 com diferentes valores de F iva, de modo a levar alguns valores de R abaixo, em torno e acima da unidade. 15 pontos são razoáveis. </li><li> Lote R como função de F exc e identificar o limite de fluência F remodelação th como valor que quando R começa a variar de um para além incerteza estatística. 6 </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A noção alvejar macrófagos associados a tumores está a emergir como um conceito poderoso para combater o câncer 34, 35, 36. Aqui, em vez de sua destruição, essas células são recrutados como veículos celulares para trazer nanobastões de ouro em um tumor, pela exploração do seu tropismo. Esta perspectiva requer um design inteligente das partículas, a sua integração nas células e sua caracterização. Verificou-se que a fotoestabilidade de macrófagos murinos carregados c...

Durante a última década, várias partículas plasmonic como nanobastões de ouro, nanoshells e nanocages, têm recebido uma atenção considerável para aplicações em óptica biomédica 1, 2, 3, 4. Em desacordo com nanoesferas de ouro padrão, estas partículas mais recentes ressoam na janela do infravermelho próximo (NIR), que prevê mais profunda penetração óptica através do corpo e maior contraste óptico mais componentes endógenos 1. Este recurso tem despertado interesse para aplicações inovadoras, tais como a fotoacústica (PA) de imagem e a ablação fototérmica de câncer. No entanto, vários problemas restringir a penetração clínica destas partículas. Por exemplo, a sua activação óptico tende a induzir o seu sobreaquecimento e modificar suas formas funcionais para com perfis mais esféricas, que dirige um photoinstability 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Outra questão que domina o debate científico é a sua entrega sistémica em tumores. Em particular, nanobastões de ouro combinam tamanhos que são ideais para permear tumores que exibem permeabilidade aumentada e retenção e facilidade de conjugação com sondas específicas de marcadores malignas. Portanto, a sua preparação para uma injecção directa na corrente sanguínea é percebida como um sistema viável 10, 11, 12, 13. No entanto, este procedimento continua a ser problemática, com a maioria das partículas tornar-se capturado pelo sistema de fagócitos mononucleares 10, 11, 12. Além disso, outra preocupação é a estabilidade óptica e bioquímica das partículas após a circulação através do corpo 14. Quando as partículas perdem sua estabilidade coloidal e agregados, as suas características plasmonic e dinâmicas de transferência de calor pode sofrer de acoplamento plasmonic 15, </s-se&gt; 16, 17 e cross-superaquecimento 18. Mais recentemente, a noção de explorar o tropismo de macrófagos associados a tumores emergiu como uma alternativa inteligente 19, 20, 21. Estas células manter uma capacidade inata para detectar e permeiam tumores com alta especificidade. Portanto, uma das perspectivas pode ser a de isolar essas células de um paciente, carregá-los com nanobastões de ouro in vitro e depois injetá-las de volta para o paciente, com a intenção de usá-los como veículos celulares responsáveis ​​pela entrega. Outra vantagem seria a ganhar mais controle sobre a estabilidade óptica e bioquímica das partículas, por causa de sua interface biológica seria construída in vitro. Ainda assim, os desempenhos destes veículos celulares como agentes de contraste óptico precisa de uma análise crítica. Neste trabalho, nós descrevemos a preparação e questões críticas de Cellulveículos AR contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer. Nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos de amónio quaternário 22, a fim de obter um perfil de catiónico que é esperado para promover as suas interacções com membranas plasmáticas 23, 24. Estas partículas passam por absorção eficiente e inespecífica da maioria dos tipos celulares, esperançosamente sem interferir muito com as suas funções biológicas. macrófagos murinos são carregados com até um máximo de 200, 000 nanobastões de ouro catiônicos por célula, que se tornam situam no interior de vesículas de endocitose apertados. Esta configuração deve surgir preocupação, por causa da ameaça de acoplamento plasmonic e cross-sobreaquecimento dentro destas vesículas. Portanto, os macrófagos são incorporados em hidrogéis biopolimêricos que imitam tecidos biológicos, a fim de verificar que a maior parte da estabilidade do PA conversão das partículas é retido na transferência do meio de crescimento para as vesículas endocíticas. effectivcritérios de medição e são trabalhados, a fim de medir a estabilidade da conversão PA em condições de interesse imediato para a imagem latente PA. Um limiar remodelar está configurado bem no início da instabilidade óptica após um trem de 50 pulsos de laser com a taxa de repetição típico de 10 Hz. Estamos confiantes de que estes resultados podem dar um impulso para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

<table><tbody><tr><td>Brometo de hexadeciltrimetilamônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Para sintetizar nanobastões de ouro</td></tr><tr><td>Cloreto de ouro (III) trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Para sintetizar nanobastões de</td></tr><tr><td>ouro Nitrato de prata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Para sintetizar nanobastões de ouro</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Para sintetizar nanobastões de ouro</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para sintetizar nanosementes de ouro</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>Para PEGylate nanobastões de ouro. Peso molecular de cerca de 5.000 Da.</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Para PEGilato nanobastões de ouro e solubilize quitosana</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Para PEGilato nanobastões</td></tr> <tr><td>de ouro (11-Mercaptoundecil) -N, N, N brometo de trimetilamônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>Para modificar nanobastões de ouro com compostos de amônio quaternário</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich</td><td></td><td>276855</td><td>Para solubilizar (11-mercaptoundecil) -N, N, N-trimetilamônio brometo</td></tr><tr><td>Polissorbato 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Para centrifugar nanobastões de ouro PEGulado</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Para suspender nanobastões de ouro antes da incubação com células e para tratar pellets de células</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Linha celular murina de monócitos / macrófagos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Para ser adicionado ao meio de cultura celular</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Para ser adicionado ao meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Para ser adicionado ao meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Cultura celular prato</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Para separar células</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Para fixar células</td></tr><tr><td>Quitosana, baixo peso molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% desacetilado. Peso molecular de cerca de 120.000 Da.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Para insolubilizar a quitosana e gerar o hidrogel</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de poliestireno</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Usado como moldes para fabricar hidrogéis de quitosana</td></tr><tr><td>Oscilador paramétrico óptico bombeado pelo terceiro harmônico de um laser Q-switched Nd:YAG</td><td>Continuum, Santa Clara, EUA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Fonte de excitação óptica para testes fotoacústicos</td></tr><tr><td>Detector piroelétrico</td><td>Gentec, Quebec, Canadá</td><td>QE8SP</td><td>Para monitorar a fluência óptica para testes fotoacústicos</td></tr><tr><td>Hidrofone de agulha pré-amplificado</td><td>Precision Acoustic, Dorset, Reino Unido</td><td>Modelo com diâmetro de sensor de 1 mm e faixa de frequência de 1-20 MHz</td><td>Para medir sinais fotoacústicos</td></tr></tbody></table>

preparação e fotoacústica análise de veículos celulares contendo ouro nanobastões

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

nanorods ouro são atraentes para uma variedade de aplicações biomédicas, tais como a ablação fototérmico e a imagiologia de cancro fotoacústica, graças à sua intensa absorvância óptica na janela de infravermelho próximo, de baixa toxicidade e potencial de repouso em tumores. No entanto, a sua entrega aos tumores continua a ser um problema. Uma abordagem inovadora consiste no aproveitamento do tropismo de macrófagos associados a tumores que podem ser carregados com ouro nanorods in vitro. Aqui, descrevemos a preparação ea inspeção fotoacústica de veículos celulares contendo nanobastões de ouro. nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos quaternários de amónio, a fim de alcançar um perfil catiónico. Em contacto com macrófagos murinos em pratos de Petri normais, estas partículas encontram-se submeter a absorção maciça em vesículas endocíticas. Em seguida, estas células são incorporadas em hidrogéis biopolimêricos, que são usadas para verificar que a estabilidade da conversão fotoacústicadas partículas é retido na sua inclusão em veículos celulares. Estamos confiantes de que estes resultados podem fornecer uma nova inspiração para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

Aqui, a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer é mostrado juntamente com resultados típicos de protocolo. As imagens por MET da Figura 1 mostram o aspecto habitual das partículas após o passo 1 e os seus veículos celulares após o passo 2. A preparação das partículas e das células para imagiologia MET é descrita na literatura 17. nanobastõ...

Mostramos a preparação e abordamos a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem fotoacústica do câncer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar veículos celulares contendo nanobastões de ouro como uma estratégia inovadora para entregar partículas plasmônicas em tumores. Nosso protocolo pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o desenvolvimento de abordagens fotoacústicas e fototérmicas para imageamento e tratamento do câncer mediante o uso de agentes de contraste exógenos. Este método baseia-se no tropismo de macrófagos associados a tumores para entregar partículas plasmônicas aos tumores.A ideia é isolar essas células de um paciente, carregá-las com partículas plasmônicas in vitro e, em seguida, injetá-las de volta em seu hospedeiro com a intenção de utilizá-las como reservatórios de estrogênio. Uma das vantagens dessa abordagem é a possibilidade de obter maior controle sobre a estabilidade óptica e bioquímica das partículas, pois sua interface biológica é totalmente construída in vitro. Para começar, purifique seis mililitros de nanobastões de ouro revestidos com cetrimonio a uma concentração de ouro de 450 micromolar, utilizando duas centrifugações, seguidas de decantação e lavagem em brometo de cetrimonio aquoso 500 micromolar.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão acetato 100 milimolar com brometo de cetrimônio e polissorbato 20 no recipiente contendo o pellet de partículas de ouro. Depois, adicione 7,5 microlitros de alfa-Metoxi-ômega-mercapto polietilenoglicol 10 milimolar em água e deixe reagir por 30 minutos a 37 graus Celsius. A seguir, adicione 7,5 microlitros de brometo de mercaptoundecil trimetilamônio 100 milimolar em dimetil sulfoxido.Em seguida, deixe a reação repousar por 24 horas a 37 graus Celsius. Após 24 horas, adicione 4,5 mililitros de 0,005% de polysorbato 20 em água. Agora, utilizando essa solução leve de polysorbato 20, purifique as partículas usando quatro ciclos de centrifugação e decantação.Por fim, transfira as partículas para 600 microlitros de solução salina tamponada com fosfato estéril. A concentração nominal de ouro deve ser agora de 4,5 milimolar. Para preparar as células, plaque dois discos de 60 milímetros com meio milhão de células monócitos macrofágicas em meio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado e cultive-as por 24 horas.Após 24 horas, substitua o meio celular por meio fresco, suplementado com as nanobastões catiônicos de ouro preparados, para uma concentração final de 100 micromolar de ouro em cada placa de Petri. Em seguida, continue a incubação por mais 24 horas. No dia seguinte, examine as células sob um microscópio.Eles devem apresentar morfologia normal e muitas vesículas intracelulares escuras. Se as células apresentarem boa aparência, lave-as com meio fresco, desprenda-as utilizando um raspador e combine as células de dois frascos para obter pelo menos dois milhões de células em uma única coleta. Em seguida, centrifugue as coletas a 120 Gs por 6 minutos para remover qualquer excesso de nanobastões catiônicos de ouro.Descarte os sobrenadantes. Os pellets celulares devem apresentar aspecto quase negro. Suspenda os pellets em dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato e conte as células utilizando uma câmara de Neubauer.Em seguida, misture as suspensões contendo dois milhões de células e centrifugue-as a 120 Gs durante seis minutos. Resuspenda os pellets em dois mililitros de formaldeído 3,6% em solução salina tamponada com fosfato e deixe as células fixarem por 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, remova o fixador com três lavagens com solução salina tamponada com fosfato.No dia anterior ao início deste procedimento, prepare 500 microlitros de uma solução de quitosana de baixo peso molecular, acidificada e a 3% em peso por volume. Ajuste o pH para 4,5 mediante a adição de ácido acético. Para misturar completamente a solução, deixe-a homogenizar por 24 horas a 40 graus Celsius.No dia seguinte, misture os macrófagos murinos preparados com nanobastões de ouro com todos os 500 microlitros da solução de quitosana. Para obter fantomas com espessura de 50 mícrons, adicione 250 miligramas da mistura em moldes de poliestireno de 1,9 centímetro quadrado. Deixe as amostras repousarem sob capela durante 24 horas.No dia seguinte, trate as amostras com 500 microlitros de hidróxido de sódio aquoso 1 molar, a fim de induzir a reticulação, e enxágue-as com 10 mililitros de água ultra-pura. Analise a estabilidade da conversão fotoacústica utilizando um microscópio fotoacústico personalizado, que possui um oscilador paramétrico óptico, um atenuador para ajustar o fluência óptica e um transdutor de ultrassom. Comece suspendendo a película de quitosana contendo os macrófagos em água desionizada usando um suporte plástico imerso em um tanque de água.Determine uma fluência de sonda que não danifique a amostra e que transmita uma emissão fotoacústica com relação sinal-ruído suficiente. Estabeleça uma fluência experimental e parâmetros de aquisição. Para cada pulso do laser, adquira o sinal fotoacústico correspondente do transdutor de ultrassom.Calcule a razão entre a intensidade fotoacústica e o fluência do laser para cada pulso. Analise sua tendência em função do número de pulso e verifique sua estabilidade ao longo do tempo. Em caso de instabilidade, repita esta medição com uma fluência de teste mais baixa.No caso de estabilidade, a fluência de ensaio pode ser usada como fluência de sonda, desde que sua emissão fotoacústica exiba uma relação sinal-ruído adequada. Em seguida, meça uma fluência limiar de remodelagem. Escolha um ponto aleatório da amostra, ajuste o laser na fluência de sonda e meça uma intensidade fotoacústica média, A, ao longo de 500 pulsos.Em seguida, aumente a fluência nominal acima da fluência de sonda e aplique 50 pulsos. Denomine a fluência média como F excitação. Reajuste o laser para a fluência de sonda e repita a medição, obtendo a intensidade média do sinal fotoacústico, B, ao longo de 500 pulsos.Agora, calcule a razão R entre B e A. Um valor de R abaixo da unidade indica que uma alteração irreversível ocorreu nas propriedades ópticas da amostra. Em seguida, utilize o estágio micrométrico para mover o filme e mudar aleatoriamente o ponto de medição da amostra. Depois, repita a medição de R para diferentes valores de F de excitação, de modo a obter alguns valores de R ao redor e abaixo da unidade.Uma coleta de cerca de 15 pontos de R é razoável. Em seguida, trace R em função da excitação F e identifique o limiar de remodelação como a fluência na qual R se desvia da unidade sem incerteza. Normalmente, nanobastões catiônicos de ouro sofrem uma acumulação maciça em macrófagos, que mantêm sua morfologia normal.Observa-se que as partículas estão confinadas dentro de vesículas endocíticas estreitas. Mais tarde no processo, a inclusão no hidrogel de quitosana não parece afetar a morfologia celular. As células estão bem dispersas por toda a amostra, conforme visto em uma micrografia.Os controles de filmes de quitosana contendo nanobast&otilde;es de ouro sem c&eacute;lulas s&atilde;o homog&ecirc;neos. As bandas plasm&ocirc;nicas dos nanobast&otilde;es de ouro s&atilde;o preservadas em seus ve&iacute;culos celulares. Efeitos como acoplamento plasm&ocirc;nico ou uma capta&ccedil;&atilde;o diferente de part&iacute;culas com tamanhos e formas distintos n&atilde;o desempenharam um papel substancial nestes protocolos.Após a coleta dos dados, a tendência de R como uma função da excitação de F fornece uma ideia dos dados e da análise necessária para determinar o limiar de F. Aqui, o limiar de F foi encontrado como sendo cerca de 11 milijoules por centímetro quadrado. As medições fotoacústicas foram altamente precisas, com uma relação sinal-ruído superior a 20 ao longo de 500 pulsos.Nosso protocolo é inovador em relação aos métodos existentes no que diz respeito ao design das partículas e à investigação de sua fotostabilidade. A modificação de nanobastões de ouro pegilados com cátions de amônio quaternário proporciona alta eficiência de captação celular mantendo a estabilidade coloidal. A medição da estabilidade da conversão fotoacústica mediante a definição do limiar de remodelação é quantitativa e reprodutível.Como essas partículas são destinadas a ser agentes de contraste para imagem fotoacústica, uma sonda fotoacústica é ideal para testar suas características funcionais. Veículos celulares de partículas plasmônicas são visíveis como agentes de contraste para imagem fotoacústica. Sua fotostabilidade é a mesma daquela de partículas plasmônicas livres.O foco do nosso trabalho atual está na fisiologia dessas células, com atenção especial para sua viabilidade e atividade quimiotática.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Sintetizamos nanostars em forma de estrela de ouro usando um método de crescimento de sementes de prata mediada. O diâmetro do nanostars varia de 200 a 300 nm eo número de dicas variam de 7 a 10. As nanopartículas têm uma ampla ressonância de plasmons de superfície de modo centrado no infravermelho próximo.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de campo escuro (DFM) combinada com análise de rastreamento de partícula única (SPT) para monitorar a interação de nanobastões de ouro plasmônicos com a membrana celular de uma linha celular específica de interesse. A análise combinada de DFM e SPT permite a visualização do movimento do nanobastão através da membrana celular com alta resolução espaço-temporal.

Microscopia de campo escuro para visualizar a dinâmica difusional de nanobastões na membrana celular

Nós relatamos em técnicas para micropattern nanoporous filmes finos de ouro através de impressão stencil e fotolitografia, bem como métodos para cultura de células sobre os padrões microfabricados. Além disso, descrevemos métodos de análise de imagem para caracterizar a morfologia do material e as células cultivadas utilizando electrónica de varrimento e técnicas de microscopia de fluorescência.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Este protocolo descreve como usar o aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro para estimular a diferenciação e a atividade intracelular de cálcio em células neuronais. Esses resultados potencialmente abrem novas aplicações em próteses neurais e estudos fundamentais em neurociência.

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Descreve-se um método simples para a produção de aglomerados oligoméricos altamente estáveis ​​de nanopartículas de ouro através da redução do ácido cloroáurico (HAuCl 4) com tiocianato de sódio (NaSCN). Os oligoclusters têm uma distribuição de tamanho estreita e podem ser produzidos com uma ampla gama de tamanhos e revestimentos de superfície.

Um método simples para o tamanho Síntese controlada de estáveis ​​Oligoméricas Clusters de nanopartículas em condições ambientais

Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Este documento descreve um protocolo para a síntese de ouro nanorods, baseado no uso de hidroquinona como agente de redução, mais os diferentes mecanismos para controlar o tamanho e a relação de aspecto.

Hidroquinona baseada Síntese de ouro Nanorods

Nós descrevemos um método de síntese de nanopartículas de ouro 10 nm biocompatíveis, acrescidas por revestimento Poli-etileno glicol para a superfície. Estas partículas podem ser usados em vitro e em vivo para distribuir terapêutica a nanoescala celular e extracelular espaços que são difíceis de acesso com tamanhos convencionais de nanopartículas.

Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

Plasmônico nanorods ouro pode ser preso em líquidos e girado em frequências kHz usando Pinça óptica circularmente polarizada. Introdução de ferramentas de análise dinâmica Brownian e scatteringspectroscopy luz leva a um poderoso sistema para pesquisa e aplicação em inúmeros campos da ciência.

Construção e operação de um sistema de Motor controlado por luz ouro Nanorod Rotary

Um método confiável e facilmente reprodutível para a preparação de nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes funcionais e quase infravermelhos e sua detecção direta dentro das células HeLa por citometria de fluxo e microscopia de varredura a laser confocal é descrito.

Síntese de nanoaglomerados de ouro emissor próximos para aplicações biológicas

Aqui, mostramos o uso da microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular. A localização e orientação de AuNRs únicos são detectadas usando ImageJ e MATLAB, e os estados difusivos de AuNRs são caracterizados por uma análise de rastreamento de partículas únicas.

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Aprenda a preparar veículos celulares com nanobastões de ouro para imagem fotoacústica de tumores usando macrófagos. Este método inovador melhora a estabilidade óptica dos agentes de contraste plasmônicos.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

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