Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é detectar a quantidade de um mRNA específico proveniente de células tumorais no pulmão, como um método para analisar metástase. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma medida quantitativa da metástase. Para realizar a dissecação do tumor pulmonar, após a eutanásia de um camundongo utilizando uma dose letal de isofluorano de acordo com o protocolo descrito, posicione o camundongo sobre uma placa de espuma com o dorso voltado para cima e as patas estendidas, utilizando pinos de dissecação para fixá-lo à placa.

Após usar etanol para pulverizar o camundongo, utilize uma pinça para segurar a porção inferior do animal no centro e, com uma tesoura, corte em direção ao pescoço através da pele, tomando cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal do camundongo. Agora, segure o peritônio na extremidade inferior do animal e comece a cortar em direção à base do pescoço. Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica, tomando cuidado para não seccionar quaisquer vasos sanguíneos que possam sangrar na cavidade torácica.

Remova os ossos das costelas cortando à esquerda e à direita, através do diafragma e das porções superiores da caixa torácica. Em seguida, utilizando pinça, segure a traqueia do camundongo e puxe para frente, e use tesoura de dissecação para seccionar a traqueia antes de remover os pulmões do animal. Use PBS para lavar suavemente o tecido pulmonar.

Em seguida, após a avaliação macroscópica do tecido pulmonar de acordo com o protocolo descrito no texto, se os pulmões devem ser analisados imediatamente, prossiga para o isolamento de RNA. Para isolar RNA do tecido, inicie homogeneizando o tecido utilizando um dos métodos listados no protocolo descrito no texto. Prepare o tampão de lise a partir de um kit de isolamento de RNA e adicione 20 microlitros de captoetanol por mililitro de tampão de lise.

Resuspenda cada 30 gramas de tecido em 300 microlitros de tampão de lise e, com um sonicador ajustado em 30% de amplitude, sonique o tecido por 10 segundos. Adicione 10 microlitros de proteinase K a 590 microlitros de tampão TE e adicione 600 microlitros do tampão a 300 microlitros de tecido sonicado. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue as amostras a mais de ou igual a 13.000 ×g por 10 minutos para remover os resíduos. Então, transfira o sobrenadante para novos tubos. Adicione 450 microlitros de etanol a cada 900 microlitros de sobrenadante para precipitar o RNA.

Em seguida, transfira 700 microlitros da mistura de lisado com etanol para uma coluna de RNA. Centrifugue novamente a maior ou igual a 13.000 ×g por um minuto para ligar o RNA à coluna. Em seguida, descarte o resíduo líquido e adicione o sobrenadante restante à coluna, e centrifugue novamente.

Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão de lavagem um à porção superior da coluna e centrifugue as amostras por 30 segundos. Descarte o resíduo líquido e recoloque a coluna no tubo. Prepare a DNase misturando cinco unidades da enzima DNase um com cinco microlitros do tampão 10X para DNase e 40 microlitros de água livre de DNase e RNase para cada amostra.

Adicione 50 microlitros da mistura de DNase a cada coluna e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão de lavagem um às colunas e centrifugue as amostras por 30 segundos. Após descartar a solução residual, adicione 600 microlitros do tampão de lavagem dois e centrifugue por mais 30 segundos.

Descarte o líquido antes de adicionar 250 microlitros do tampão de lavagem dois e, em seguida, centrifugue por dois minutos. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione de 50 a 100 microlitros de água livre de RNase e DNase à coluna. Após uma incubação de um minuto, centrifugue por um minuto.

Reaplique o eluato coletado na coluna para aumentar o rendimento de RNA. Para uso imediato, mantenha as amostras sobre gelo. Para uso posterior, congele rapidamente em gelo seco ou nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento do uso.

Utilizando um espectrofotômetro, quantifique o RNA. Em seguida, em tubos ou placas PCR estéreis, livres de RNase e DNase, use de 0,5 a 2 microgramas de RNA total para preparar a mistura de reação para a primeira transsíntese, conforme mostrado nesta tabela. Misture e centrifugue suavemente, e programe uma termocicladora padrão utilizando o programa mostrado aqui.

Quando a reação estiver concluída, utilize água estéril e livre de nucleases para diluir a reação finalizado ao volume desejado. Para realizar a PCR em tempo real, use um controle positivo de DNAc, como o HER2 humano, para montar uma curva padrão para cada conjunto de primers, preparando de uma a quatro diluições seriadas do DNAc a fim de gerar cinco padrões. Em seguida, calcule o número total de amostras, que deve incluir a curva padrão e as amostras experimentais.

Em seguida, em tubos estéreis livres de RNase e DNase, prepare uma mistura-mestre para cada gene experimental de interesse, bem como um controle interno, como o gapdh. Prepare uma placa de teste contendo um microlitro de C DNase para cada amostra padrão ou experimental. Atribua pelo menos uma amostra de cDNA por poço, para cada par de iniciadores e sonda.

Adicione 19 microlitros de mastermix por poço, para cada par de iniciador e sonda. Este experimento de bioluminescência demonstra que pulmões de camundongos tratados com ACT1, que tem como alvo a proteína da junção comunicante Connexina 43, parecem negativos para atividade de luciferase, sugerindo a ausência de células tumorais no tecido. No entanto, a análise de cortes corados com H&E do tecido pulmonar revela micrometástases que não foram iluminadas pela luciferase, indicando que a imagem de luciferase não é sensível o suficiente para detectar pequenos números de células tumorais.

Mostrados aqui estão os resultados de um experimento de qRT-PCR, utilizando uma sonda específica para HER2, para detectar células tumorais humanas HER2 e JIMT1 em tecido pulmonar de células originalmente transplantadas na gordura mamária do camundongo. Embora nenhuma metástase visivelmente evidente tenha sido observada em nenhum dos pulmões, em duas das 11 amostras, a qRT-PCR detectou metástases. Nesta figura, foi realizada uma análise de curva padrão para determinar os níveis relativos de HER2 normalizados em relação ao gapdh do pulmão de camundongo em uma série de número de células.

Os resultados indicam que a qRT-PCR, utilizando a sonda HER2, foi sensível o suficiente para detectar níveis de HER2 em apenas 10 células. Por fim, esta análise de regressão mostra o número relativo de células em cada amostra pulmonar, incluindo os controles positivo e negativo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis a oito horas, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de tomar precauções para manter a integridade do RNA durante o isolamento do RNA e a reação de transcriptase reversa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar metástase em tecido pulmonar inteiro, por meio de PCR quantitativa em tempo real.