Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é detectar a quantidade de um MRNA específico de células tumorais no pulmão, como um método para analisar metástases. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma medida quantitativa de metástase. Para realizar uma dissecção de tumor pulmonar, após a eutanásia de um camundongo usando uma dose letal de isofluorina de acordo com o protocolo de texto, coloque o camundongo em uma placa de espuma de costas com os membros abertos e use pinos de dissecção para prendê-lo à placa.

Depois de usar etanol para pulverizar o camundongo, use uma pinça para agarrar a parte inferior do animal no centro e, com uma tesoura, corte para cima em direção ao pescoço através da pele, tomando cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal do camundongo. Agora, segure o peritônio na extremidade inferior do animal e comece a cortar para cima em direção à base do pescoço. Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar nenhum vaso sanguíneo que possa sangrar para a cavidade torácica.

Remova as costelas cortando para a esquerda e para a direita, através do diafragma e das porções superiores da caixa torácica. Em seguida, usando uma pinça, segure a traqueia do camundongo e puxe para frente, e use uma tesoura de dissecção para cortar a traqueia antes de remover os pulmões do camundongo. Use PBS para lavar suavemente o tecido pulmonar.

Então, após avaliação macroscópica do tecido pulmonar de acordo com o protocolo de texto, se os pulmões forem analisados imediatamente, prossiga para o isolamento de RNA. Para isolar o RNA do tecido, comece homogeneizando o tecido usando um dos métodos listados no protocolo de texto. Prepare o tampão de lise a partir de um kit de isolamento de RNA e adicione 20 microlitros de captoetanol tumoral a cada mililitro de tampão de lise.

Ressuspenda a cada 30 gramas de tecido em 300 microlitros de tampão de lise e, com um sonicador ajustado para 30% de amplitude, sonice o tecido por 10 segundos. Adicione 10 microlitros de protinase K a 590 microlitros de tampão TE e adicione 600 microlitros do tampão a 300 microlitros de tecido sonicado. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue as amostras a mais ou igual a 13.000 vezes G por 10 minutos para remover os detritos. Em seguida, transfira o sobrenadante para novos tubos. Adicione 450 microlitros de etanol a cada 900 microlitros de sobrenadante para precipitar o RNA.

Em seguida, transfira 700 microlitros da mistura de etanol lisado para uma coluna de RNA. Gire novamente em maior ou igual a 13.000 vezes G por um minuto para ligar o RNA à coluna. Em seguida, descarte os resíduos líquidos e adicione o sobrenadante restante à coluna e gire novamente.

Em seguida, adicione 350 microlitros de tampão de lavagem um à parte superior da coluna e centrifugue as amostras por 30 segundos. Descarte os resíduos líquidos e recoloque a coluna no tubo. Prepare DNase misturando cinco unidades de DNase uma enzima com cinco microlitros de tampão DNase 10X e 40 microlitros de água livre de DNase RNase para cada amostra.

Adicione 50 microlitros de mistura de DNase a cada coluna e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, adicione 350 microlitros de tampão de lavagem um às colunas e centrifugue as amostras por 30 segundos. Depois de descartar a solução residual, adicione 600 microlitros de tampão de lavagem dois e gire por mais 30 segundos.

Descarte o líquido antes de adicionar 250 microlitros de tampão de lavagem dois e centrifugue por dois minutos. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione 50 a 100 microlitros de água livre de RNase DNase à coluna. Depois de incubar por um minuto, gire por um minuto.

Execute novamente o eluato coletado através da coluna para aumentar o rendimento do RNA. Para uso imediato, mantenha as amostras no gelo. Para uso posterior, congele em gelo seco ou nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário.

Usando um espectrofotômetro, quantifique o RNA. Em seguida, em tubos ou placas de PCR livres de RNase DNase estéreis, use 0,5 a 2 microgramas de RNA total para preparar a mistura de reação para a primeira transsíntese, conforme mostrado nesta tabela. Misture e centrifugue suavemente e programe uma máquina de PCR padrão usando o programa mostrado aqui.

Quando a reação estiver completa, use água estéril e livre de nuclease para diluir a reação finalizada no volume desejado. Para realizar a PCR em tempo real, use um DNA C de controle positivo, como o HER2 humano, para configurar uma curva padrão para cada conjunto de primers, preparando de uma a quatro diluições seriais do DNA C para gerar cinco padrões. Em seguida, calcule o número de amostras totais, que deve incluir a curva padrão e as amostras experimentais.

Em seguida, em tubos livres de RNase DNase estéreis, prepare uma mistura mestre para cada gene experimental de interesse, bem como um controle interno, como o gapdh. Preparar uma placa de ensaio contendo um microlitro de C DNase para cada amostra-padrão ou experimental. Aloque pelo menos uma amostra de DNA C por poço, para cada sonda de primer.

Adicione 19 microlitros de mastermix por poço, para cada sonda de primer. Este experimento de bioluminescência demonstra que os pulmões de camundongos tratados com ACT1, que tem como alvo a proteína da junção comunicante Conexina 43, parecem negativos para a atividade da luciferase, sugerindo a ausência de células tumorais no tecido. No entanto, a análise de seções de H & E do tecido pulmonar mostra micrometástases que não foram iluminadas pela luciferase, sugerindo que a imagem da luciferase não é sensível o suficiente para detectar um baixo número de células tumorais.

Aqui estão os resultados de um experimento qRT-PCR, usando uma sonda específica para HER2, para detectar células tumorais humanas HER2 mais JIMT1 no tecido pulmonar de células originalmente transplantadas para a almofada de gordura de memória de camundongo. Embora não tenham sido observadas metástases macroscopicamente visíveis em nenhum dos pulmões, em duas das 11 amostras, a qRT-PCR detectou metástases. Nesta figura, uma análise de curva padrão foi preparada para determinar os níveis relativos de HER2 normalizados para gapdh pulmonar de camundongo em uma série de números de células.

Os resultados indicam que o qRT-PCR, usando a sonda HER2, foi sensível o suficiente para detectar níveis de HER2 em apenas 10 células. Finalmente, esta análise de regressão mostra o número relativo de células em cada amostra de pulmão, incluindo os controles positivo e negativo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis a oito horas, se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado para manter a integridade do RNA durante o isolamento do RNA e a reação da transcriptase reversa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar metástases em todo o tecido pulmonar, por PCR quantitativo em tempo real.