2.9: Pluripotência induzida

As células-tronco pluripotentes induzidas, como as células-tronco embrionárias humanas, podem se diferenciar em quase qualquer célula do corpo e, portanto, são muito promissoras no campo da medicina regenerativa.

As células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, são obtidas de embriões pré-implantação, enquanto as células somáticas totalmente diferenciadas são usadas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas, também conhecidas como iPSCs.

Neste vídeo, você aprenderá sobre os princípios básicos por trás da geração de iPSCs, um protocolo passo a passo para induzir a pluripotência em células diferenciadas e algumas das muitas aplicações e modificações downstream desse protocolo.

Vamos começar discutindo os princípios por trás da geração de iPSCs a partir de tipos de células somáticas.

Células diferenciadas, como células da pele ou neurônios, são aquelas cujo destino é decidido. Eles estão comprometidos em desempenhar uma função específica. Por outro lado, as células-tronco pluripotentes são aquelas cujo destino está indeciso e podem se diferenciar em qualquer tipo de célula.

O processo de mudança da identidade de uma célula já diferenciada para um estado pluripotente é denominado reprogramação celular. Isso envolve a mudança do padrão de expressão gênica na célula, porque o número e os tipos de proteínas produzidas por uma célula desempenham um papel importante na definição da identidade de uma célula.

Uma das formas de induzir a reprogramação celular é induzindo a expressão de certos fatores de transcrição. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam a sequências regulatórias dentro de um gene. Algumas dessas sequências são chamadas de "promotores" e, portanto, promovem a transcrição de um gene. Alguns fatores de transcrição podem influenciar a expressão de vários genes, o que tem um enorme impacto na identidade celular.

Os quatro fatores de transcrição clássicos que demonstraram induzir a pluripotência são Oct4, Sox2, cMyc e Klf4. Esses fatores também são conhecidos como fatores Yamanaka, em homenagem ao pesquisador que descobriu seus efeitos de reprogramação.

Vários métodos podem ser usados para induzir a expressão desses fatores de transcrição. O método mais comum e eficiente é o uso de um vírus modificado para entregar os genes do fator de transcrição no núcleo, onde eles se integrarão ao genoma.

Nesse método, os genes que codificam os quatro fatores de Yamanaka são embalados individualmente em diferentes retrovírus e adicionados a células diferenciadas. Quando as células são expostas a vírus modificados, uma pequena fração de células diferenciadas é infectada com todos os quatro vírus portadores de fatores de transcrição. Eles começam a se desdiferenciar até que grandes aglomerados esféricos de células-tronco pluripotentes sejam formados. A formação de clusters ajuda as iPSCs a criar um microambiente semelhante às células-tronco in vivo e, portanto, auxiliá-las a manter sua pluripotência.

Como agora você entende os princípios básicos por trás da geração de iPSCs, vamos passar por um protocolo geral para induzir pluripotência em fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs, usando um sistema de transdução viral.

Antes de iniciar este procedimento, observe que os vírus podem infectar as células do seu corpo, portanto, seguir as diretrizes de segurança é extremamente importante.

Para iniciar o processo de transfecção, o meio de cultura é removido de uma placa contendo uma alta densidade de MEFs e as células são lavadas com solução tampão. Em seguida, uma solução contendo uma enzima degradadora de proteínas, como a tripsina, é adicionada para levantar as células do fundo do prato. O meio de cultura é então adicionado à placa e as células destacadas são transferidas para um tubo de centrífuga.

Após a centrifugação, o pellet é ressuspenso no meio de cultura. Em seguida, as células são contadas e a concentração é ajustada para que um número ideal de células possa ser infectado com o vírus no dia seguinte. Incube as células durante a noite.

Depois que as células se acomodam em seu novo prato, a mídia antiga é substituída por mídia nova e os vírus modificados contendo os fatores de transcrição desejados são adicionados à placa. As células são então incubadas com os vírus por tempo suficiente para permitir que a infecção ocorra. Após a incubação, o meio contendo vírus livres é removido e substituído por meio de células-tronco embrionárias frescas.

Por 2-3 semanas após a transformação, as células devem ser cultivadas em 37? em uma incubadora, e os meios de cultura devem ser substituídos diariamente.

Após esse período, as colônias de iPSC que se parecem com as colônias de células-tronco embrionárias devem se tornar grandes o suficiente para serem captadas. As colônias podem ser transferidas para uma placa fresca contendo meio com fatores de crescimento apropriados e deixadas crescer ainda mais. Para confirmar a pluripotência, uma parte da população celular é corada com marcadores de pluripotência.

Agora que você viu como gerar iPSCs a partir de células diferenciadas, vamos examinar algumas aplicações downstream e modificações desse método altamente útil.

Uma característica importante das iPSCs é que elas podem ser usadas para gerar quase qualquer célula do corpo. Este exemplo mostra a geração de células do músculo cardíaco, chamadas cardiomiócitos, a partir de iPSCs. Para isso, as iPSCs são transferidas para placas não aderentes que lhes permitem formar corpos embrióides, que são agregados de células-tronco pluripotentes. Os corpos embrióides são cultivados em meio especializado contendo soro e ácido ascórbico, o que aumenta a diferenciação cardíaca. A diferenciação bem-sucedida pode ser facilmente observada quando algumas células começam a bater.

Como as iPSCs podem potencialmente se diferenciar em qualquer tipo de célula, elas também podem formar um organismo inteiro, como um camundongo. Isso pode ser feito usando um ensaio chamado complementação tetraplóide. Primeiro, um embrião tetraplóide, um embrião contendo quatro conjuntos de cromossomos, é formado pela fusão de duas células de um embrião inicial usando um campo elétrico. O embrião tetraplóide pode se desenvolver até o estágio de blastocisto. As iPSCs são então injetadas no blastocisto, que é então transplantado para uma fêmea receptora para gestação. As células tetraplóides só são capazes de formar estruturas extraembrionárias como a placenta, de modo que os animais resultantes desse método são derivados inteiramente de iPSCs.

Alguns pesquisadores modificam o procedimento de reprogramação para tornar mais eficiente o processo de identificação de células reprogramadas com sucesso. Por exemplo, neste experimento, MEFs com a capacidade de expressar proteína fluorescente verde sob a influência do promotor Oct4 ajudaram os pesquisadores a identificar facilmente células que adquiriram pluripotência.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre a geração de células-tronco pluripotentes induzidas. Este vídeo revisou os princípios por trás desse procedimento e um protocolo passo a passo para gerar iPSCs a partir de células diferenciadas. Também revisamos como esse método poderia ser aplicado ou modificado para experimentos em laboratório.

A descoberta das iPSCs teve um enorme impacto no campo da biologia de células-tronco, uma vez que tem um enorme potencial para o desenvolvimento de terapias que podem ser empregadas no tratamento de doenças degenerativas. Embora muito progresso tenha sido feito com as iPSCs, o obstáculo que ainda precisa ser superado é o risco associado de câncer. Os procedimentos de reprogramação atuais têm o potencial de resultar em crescimento celular desregulado que pode resultar em câncer. Portanto, mais pesquisas são necessárias para realmente usar iPSCs clinicamente. Como sempre, obrigado por assistir!