Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca ²⁺ Aged em neurônios do hipocampo

O objetivo geral deste procedimento é investigar a remodelação do cálcio no cérebro envelhecido usando imagens de fluorescência e bioluminescência de cálcio citosólico e mitocondrial em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de fraternidade, que é considerado um modelo de envelhecimento neuronal. Este método pode ajudar a entender questões-chave no campo do envelhecimento, como como a remodelação do cálcio intracelular contribui para a excitotoxicidade e danos aos neurônios, ambos relacionados à sobrecarga de cálcio. A principal vantagem desta técnica é que é possível acompanhar de perto a remodelação do cálcio em neurônios individuais usando culturas em diferentes DYS in vitro a partir da mesma duplicação de espécimes desta técnica através de ou terapia de um acidente vascular cerebral ou doença celular porque varia um novo alvo relacionado à sobrecarga de cálcio neste agente doenças relacionadas.

Depois de assistir a este vídeo, Jesus tem uma boa compreensão de como realizar imagens de fluorescência e reminiscência de cálcio citosólico e mitocondrial em culturas de curto e longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos. Para iniciar este procedimento, distribua as lamínulas em uma tira de paraforme em uma placa de Petri. Em seguida, aplique 200 microlitros de poli D licina a um miligrama por mililitro em cada lamínula e trate durante a noite.

No dia seguinte, lave as lamínulas com água estéril duplamente destilada a cada 15 minutos por 90 minutos em condições estéreis. Coloque as lamínulas no multi e mantenha-as em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2 até o uso. Para isolar os neurônios do hipocampo, abra o crânio dos filhotes de ratos recém-nascidos com uma tesoura estéril, extraia o cérebro com uma espátula e lave-o rapidamente em meio F 12 de presunto.

Em seguida, fazer um corte diagonal com o bisturi em cada hemisfério e transferi-lo para a placa de Petri contendo presuntos F 12 médio ao microscópio. Descarte as meninges. Identifique cuidadosamente o hipocampo em um local côncavo característico sobre o córtex.

Em seguida, separe o hipocampo do córtex, puxando-o com cuidado e removendo-o com uma tesoura para os olhos. Em seguida, transfira os pedaços do hipocampo para um frasco contendo 1,8 mililitros de solução de pepano pré-filtrada. Incube-os a 37 graus Celsius com agitação suave ocasional por 15 minutos.

Em seguida, adicione 90 microlitros de uma solução de DNA. Adicione 50 microgramas por mililitro e incube-os por mais 15 minutos. Em seguida, transferir o tecido para um tubo de centrifugação de 10 mililitros e lavar os fragmentos com meio de cultura neurobasal fresco.

Obtenha uma suspensão celular passando os fragmentos de tecido por uma pipeta de plástico de cinco mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 160 G durante cinco minutos. Em seguida, remova o supinato usando uma pipeta de pastagem estéril de plástico e suspenda o pellet cuidadosamente em um mililitro de meio de cultura neurobasal com uma pipeta automatizada de um mililitro.

Em seguida, meça a densidade celular usando uma câmara de contagem de neubauer. Adicione 10 microlitros de suspensão celular e conte o número de células ao microscópio. Em seguida, execute os cálculos correspondentes para obter 40 a 80 microlitros de suspensão celular, que contém cerca de 30.000 células.

Na placa de quatro poços contendo 500 microlitros de meio neurobasal, jogaram cerca de 30.000 células para cada poço contendo lamínulas de vidro. Mantenha-os na incubadora por dois a cinco dias in vitro para neurônios jovens ou mais de 15 dias in vitro para neurônios idosos. Neste procedimento, incube as células com menos de 2:00 AM por 60 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Em seguida, transfira as lamínulas para a câmara de profusão. Depois disso, coloque a câmara de profusão com a lamínula no suporte no microscópio invertido. Selecione o campo microscópico e perfunda as células continuamente com HBS pré-aquecido.

Posteriormente, epi ilumina as células em 340 e 380 nanômetros. Alternativamente, registre a luz emitida a 520 nanômetros a cada cinco a 10 segundos com uma câmera fluorescente, que é filtrada por um espelho fira two diic. Para analisar as imagens fluorescentes gravadas, primeiro abra o experimento file usando o software Aqua Cosmos, clique em proporção e selecione a faixa de proporção desejada.

Calcule a proporção pixel a pixel nas imagens resultantes para obter uma sequência de imagens de proporção. Em seguida, subtraia o plano de fundo ajustando o botão de eliminação do plano de fundo. Depois disso, pressione iniciar o cálculo.

Em seguida, pressione o botão de sequência de tempo total e apague os ROIs antigos para análise quantitativa de células individuais. Estabeleça novos ROIs ou os ROIs correspondentes aos neurônios individuais. Para representar graficamente as gravações individuais, exporte os valores de fluorescência da proporção correspondentes a cada ROI para o programa de laboratório Origin clicando em gráfico.

Em seguida, clique em calcular e salve o arquivo TXT. Depois disso, faça o cálculo correspondente para estimar o tamanho do aumento na taxa de fluorescência em resposta a cada estimulação para transfectar neurônios cultivados com o plasmídeo mutante do MIT. Primeiro, prepare 50 microlitros de solução A contendo reagente de transfecção em um frasco.

Em seguida, prepare 50 microlitros da solução B contendo o plasmídeo MIT ute em um frasco. Adicione a solução B à solução A e incube por 20 minutos. Depois disso, transfira as lamínulas contendo neurônios do hipocampo para novas placas múltiplas contendo 200 microlitros de TF neurobasal fresco. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução A e B gota a gota sobre cada lamínula e incube por 30 minutos.

Após 30 minutos, remova o meio. Lave as células com fresco neuro basal tf. Uma vez devolvidas, as lamínulas de cobertura ao meio de cultura neurobasal original e cultivam as células por 24 horas após a transfecção para permitir a expressão eficiente e o direcionamento da sonda.

Em seguida, adicione quatro microlitros de selante TEREZIN N a 200 microlitros de HBS para obter uma concentração final de quatro micromolares. Misture delicadamente e incubado por duas horas em temperatura ambiente no escuro. Após duas horas, transfira as lamelas para a câmara de perfusão e leia continuamente com a solução HBS pré-aquecida.

Para registrar as imagens de bioluminescência da concentração de cálcio mitocondrial, selecione o campo microscópico contendo as células que expressam APO corina conforme mostrado pela emissão de fluorescência. Em seguida, desligue a luz do microscópio. Remova a caixa de contenção dicróica localizada no caminho da luz.

Em seguida, desligue a luz de excitação e feche a caixa escura para escuridão total. Perfundir as células com meio HBS, com ou sem soluções de teste pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Em seguida, capture as imagens de emissão fotônica a cada 10 segundos com uma câmera de contagem de fótons manipulada com um processador de imagem.

Em seguida, adicione cavar toin para liberar todos os fótons restantes Para analisar imagens bioluminescentes refletindo o cálcio mitocondrial. Abra a imagem de fluorescência GFP. Selecione ROIs individuais desenhando ao redor das células transfectadas.

Em seguida, copie e cole os mesmos ROIs em todas as imagens da sequência. Capturas de tela. Depois disso, exporte os valores de emissão fotônica para cada ROI para o software específico para cálculo do gráfico de cliques.

Para calcular os valores de cada ROI, selecione o valor total e use o ROI atual para todas as imagens. Em seguida, pressione calcular, salve o arquivo de texto e exporte os dados. Em seguida, faça os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos no cálcio mitocondrial em resposta a cada estímulo mostrado.

Aqui estão as imagens representativas de campo claro e pseudo coloridas de culturas de curto e longo prazo de neurônios do hipocampo antes e depois da estimulação com 100 micromolares e cores mais quentes de MDA refletem a concentração elevada de cálcio citosólico. Esses traços mostram os registros representativos de células únicas da concentração citosólica de cálcio em resposta a 100 micromolares e MDA em culturas de curto e longo prazo de neurônios do hipocampo. Observe que os aumentos da concentração citosólica de cálcio são muito maiores em neurônios cultivados a longo prazo do que em neurônios cultivados a curto prazo.

Neste experimento, neurônios do hipocampo cultivados foram transfectados com a korina direcionada a mitocôndrias de baixa afinidade fundida à GFP, incubada com quatro selantes micromolares terezin e submetidos a imagens de bioluminescência da concentração de cálcio mitocondrial. Aqui, as gravações que mostram a liberação de emissões fotográficas refletindo o cálcio mitocondrial em neurônios do hipocampo cultivados a curto e longo prazo. Um micromolar MDA 100 aumentou a concentração de cálcio mitocondrial em neurônios envelhecidos, mas não em neurônios jovens do hipocampo cultivados após este procedimento.

Outros métodos, como avaliação justa à esquerda, podem ser combinados com imagens de fluorescência e bioluminescência nas mesmas células, a fim de responder a perguntas adicionais, como suscetibilidade às células neuronais, chumbo associado ao envelhecimento, neurodegeneração e isquemia.