Name: Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca 2+ Aged em neurônios do hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Aprenda a investigar o remodelamento do cálcio em neurônios hipocampais de ratos envelhecidos usando imagens de fluorescência e bioluminescência. Este método permite analisar dinâmicas de cálcio citoplasmático e mitocondrial em culturas de longo prazo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) e pela Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 e BIO/VA33/13), Espanha. O MCR foi apoiado pela Junta de Castilla y Leòn (Espanha) e pelo Fundo Social Europeu. Agradecemos ao falecido Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) pelo plasmídeo mitocondrial GFP Aequorin.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais tenham sido manipuladas em protocolos aprovados pela instalação de alojamento dos animais Universidade Valladolid de acordo com a Convenção Europeia 123 / Conselho da Europa ea Directiva 86/609 / CEE. 1. Curto e Longo prazo Cultura de Rat neurônios do hipocampo <ol><li> Preparação de poli-D-lisina revestido, de 12 mm de lamelas de vidro. <ol><li> Esterilizar 12 mm de diâmetro lamelas de vidro em etanol durante pelo menos 24 horas. Deixe secar em condições estéreis. </li><li> Distribuir as lamelas sobre uma tira de parafilm numa placa de Petri. Cobrir a superfície de cada lamela com 200 ul de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir que o tratamento S / N. </li><li> No dia seguinte, lavar as lamelas com água estéril duplamente destilada a cada 15 min durante 90 min sob condições estéreis. </li><li> Encha uma placa de quatro bem multidish com 500 ul de meio de cultura Neurobasal por poço. Neurobasal Meio de Cultura deve ser complementada com10% de soro fetal bovino, 2% B27, 1 ug / ml de gentamicina e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Coloque as lamelas na placa multidish. Mantê-los numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 até à sua utilização. </li></ol></li><li> Isolamento de neurónios do hipocampo de ratos recém-nascidos. <ol><li> Prepare a 1,8 ml de solução de papaína (adquiridas directamente) num frasco (20 ul / ml) sob condições estéreis: Para se obter uma concentração final de 20 ul / ml de adicionar cerca de 40 ul de papaína em 1,8 ml de Hank mais 0,6% de BSA (ul deve ser calculada dependendo das condições do fornecedor). 0,6% de BSA de Hank é preparado por mistura de 85 mL de meio HBSS com 15 ml de 4% de albumina de soro bovino (BSA, preparado solução 4 g de BSA em 100 mL de HBSS). Prepare-lo em um capuz estéril. </li><li> Incubar a papaína em Hank mais 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ° C antes da utilização. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Prepare meio F-12 de Ham, acrescentando DulbeccoPó de Meio de Eagle (13,5 g por L) de modificação em 900 ml de água estéril duplamente destilada. Em seguida, adicionar 6 g de HEPES e 336 mg de NaHCO3 e ajustar o pH a 7,42 com NaOH 4 N. Adicionar água estéril para se obter uma solução de 1 L e filtrá-la usando uma polietersulfona 0.20 uM (PES) Frasco filtro superior. Leve este processo em uma capa estéril. Finalmente saturar a solução com CO2 em condições estéreis antes da utilização. Soluções armazenar a 4 ºC e usá-los refrigerados. </li><li> Euthanize recém-nascido (P0) filhotes de ratos por decapitação e lavar a cabeça em meio HBS estéril. Abra o crânio com a ajuda de uma tesoura esterilizada. Extrair o cérebro com uma espátula e lavá-lo rapidamente em meio F-12 de Ham. </li><li> Fazer um corte diagonal com o auxílio de um bisturi em cada hemisfério (Figura 1B), e transportá-lo para uma placa de Petri contendo meio F-12 de Ham. </li><li> Meninges Descartar cuidadosamente com a ajuda de uma pinça de dissecção e sob uma lupa. </li> &lt;li&gt; Identificar o hipocampo em um local côncava característica sobre o córtex utilizando lupa. Em seguida, separar o hipocampo a partir do córtex puxando cuidadosamente a partir de uma fronteira e removê-lo da sua posição usando uma tesoura olho. </li><li> Transferir o tecido do hipocampo a uma placa de 4 bem cheio com meio estéril de Hank sem Ca 2+ e Mg 2+, mais 0,6% de BSA e lavar o tecido do hipocampo. Sem retirar os meios cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 x 2 mm), utilizando as mesmas tesouras olho. </li><li> Transferir peças do hipocampo para um frasco contendo 1,8 ml de solução de papaína pré-filtrado. Em seguida, incubar-los a 37 ºC com ocasional, agitação suave. 15 min depois, adicionar 90 ul de ADNase I (solução 50 ug / ml final) e incubar durante 15 min adicionais. </li><li> Transferir o tecido para um tubo de centrífuga de 10 ml e lava-se os fragmentos com Neurobasal fresco Meio de Cultura. Obter suspensão celular por passagem do tecido através de fragmentos de 5 ml de semente de plásticoette. </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células 160 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico estéril e suspender sedimento cuidadosamente com uma pipeta de 1 mL automatizados em 1 ml de meio de cultura Neurobasal. </li><li> Medir a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Coloque a lamela de vidro através da câmara de Neubauer. Adicionar 10 ul de suspensão de células. Certifique-se a suspensão de células entra de maneira uniforme e sem fazer bolhas na câmara. Contar o número de células ao microscópio e executar cálculos correspondentes para obter uma gota de 40-80 ul adequado contendo 30 x 10 3 células. O número total de células irá depender do número de animais utilizados. </li></ol></li><li> A curto prazo e a cultura de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato. <ol><li> Sobre a placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de meio de cultura Neurobasal preparado antes e mantido na incubadora, placa de cerca de 30 x 10 3 em células de uma gota de cerca de 50 ul de cadapoço da placa de multidish contendo um poli-D-lisina-revestidas, 12 mm de diâmetro lamela de vidro. </li><li> Manter as células primárias de hipocampo numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 durante 2-5 dias in vitro (DIV, a curto prazo, as culturas jovens) ou&gt; 15 DIV (de longo prazo, as culturas envelhecidas) antes de experiências sem alterar a cultura mídia. </li></ol></li></ol> 2. imagens de fluorescência de Ca2 + citosólico Concentração <ol><li> Preparação de soluções de teste para imagens de fluorescência. <ol><li> Prepara-se uma solução salina externa tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 145, KCl 5 mM, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10, HEPES de sódio-10 (pH 7,42). </li><li> Prepara-se uma solução externa -livre, Mg 2+, solução salina tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 146, KCl 5 mM, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Resolver soro fisiológico NMDA em Mg 2 + livre, HEPES (HBS) a uma final concentração de 100 mM e completá-lo com 10 mM de glicina. </li><li> Prepara-se uma solução de HBS contendo KCl em vez de NaCl através da resolução de (em mM): KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> Carregando de células do hipocampo com sonda fluorescente cálcio fura2 / AM. <ol><li> Pegue a cultura de células contendo lamelas de fora da incubadora e lave-os com meio HBS à RT, transferindo-os para uma nova placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de HBS por poço. </li><li> Incubar as células com fura2 / AM 4 uM (preparados no mesmo meio HBS) durante 60 min à temperatura ambiente (25 ° C) em um local escuro. </li><li> Após 60 minutos, lave lamelas com meio HBS fresco. </li></ol></li><li> Gravação de imagens de fluorescência de cytosolic [Ca 2+] em células cultivadas. <ol><li> Acender a luz, microscópio, sistema de perfusão, câmera de fluorescência e computador. </li><li> Coloque as lamelas em uma plataforma com termostato paraabertas 12 mm lamelas de vidro sobre a fase de microscópio invertido e seleccionar um campo microscópico usando uma objectiva de 40x (óleo, NA: 1,3). Perfundir continuamente com células pré-aquecido (37 ° C) forma HBS na ausência ou na presença das substâncias de ensaio. Manter o fluxo a uma velocidade de cerca de 5-10 ml / min. Nota: sistema de perfusão celular para células vivas é montado em uma plataforma com termostato para abrir 12 mm lamelas de vidro. 8-linhas do sistema de perfusão conduzido por gravidade equipado com um controlador de válvula é utilizado para perfundir as soluções. Uma bomba de vácuo é responsável pela remoção de qualquer excesso de meio. As soluções são aquecidas usando um sistema de aquecimento no tubo. </li><li> Capturar uma imagem de fundo com o obturador fechado em ambos os comprimentos de onda de excitação. </li><li> Epi-iluminarem células alternadamente a 340 e 380 nm. Luz da ficha emitida a 520 nm a cada 5-10 segundos com uma câmara de fluorescência, que é filtrado por um espelho dicróico Fura-2. </li><li> Quando o período de gravação terminar, guarde a sequência completa oimagens de f emitida a 520 nm no computador para análise posterior. </li></ol></li><li> A análise das imagens gravadas fluorescentes. <ol><li> Abra o arquivo experimento. Usando o software aquacosmos, clique em &#39;Razão&#39; e selecione o intervalo proporção desejada. Calcula-se a relação pixel por pixel das imagens resultantes, a fim de se obter uma sequência de imagens de relação. </li><li> Subtrair fundo, ajustando a &quot;eliminação de fundo&quot;. Prima &#39;cálculo start&#39;. </li><li> Prima &#39;todas as vezes sequência de&#39; botão e apagar as antigas regiões de interesse (ROI). Para a análise quantitativa das células individuais, estabelecer novas regiões de interesse ou ROIs correspondentes aos neurônios individuais. Média de todos os valores de relação em cada pixel correspondente a cada ROI e cada imagem para obter uma gravação dos valores de fluorescência relação para ROIs individuais (células). </li><li> Para representar graficamente as gravações individuais exportar os valores proporção de fluorescência correspondentes a cada ROI a um progr gráficasou. </li><li> Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na razão de fluorescências em resposta a cada estimulação usando uma análise de dados e gráficos de software adequado. </li></ol></li></ol> 3. Bioluminescência imagem das mitocondrial concentração de Ca2 + <ol><li> A transfecção de neurónios do hipocampo em cultura com o plasmídeo mitGAmut. NOTA: As células são primeiro transfectadas com o plasmídeo contendo uma sequência mitGAmut segmentada por mitocôndrias e aequorina uma mutação sem um local de ligação ao Ca2 + fundida à proteína fluorescente verde (GFP). Esta construção detecta grandes aumentos de Ca2 + mitocondrial na absorção e permite a identificação de células transfectadas pela fluorescência de GFP. O plasmídeo foi desenvolvido e gentilmente fornecida por P. brulet e colegas de trabalho 18 (CNRS, Paris). <ol><li> Prepare Neurobasal TF, contendo meio de cultura Neurobasal, sem soro fetal de bovino, B27, gentamice 2 mM de L-glutamina. </li><li> Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 2,5 mL de reagente de transfecção num frasco (solução A). Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 4 ^ g de plasmídeo mitGAmut num frasco (Solução B). Adicionar suavemente solução B durante solução A. Permitir a mistura, durante 20 min, sem agitação. </li><li> Transferir as lamelas contendo neurônios do hipocampo para novas placas multidish contendo 200 mL de TF Neurobasal fresco. </li><li> Adicionar gota a gota 100 ml de solução de A + B sobre cada lamela. Incubar durante 30 min. Remover o meio. Lavar uma vez com células TF Neurobasal fresco. Retorne as lamelas ao original Neurobasal Meio de Cultura. </li><li> Neurónios de cultura durante mais 24 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2 ap a transfeco para permitir a expressão eficiente e segmentação da sonda. </li></ol></li><li> Preparação de soluções de teste para imagem de bioluminescência. <ol><li> Preparar soluções de HBS contendo 100 | iM de NMDA ou KCl 145 mM comoacima (Passo 2.1). Preparar a solução de HBS contendo 10 mM Ca 2+ mais digitonina 100 uM. </li></ol></li><li> Reconstituição de aequorin segmentada por mitocôndrias com coelenterazina n. <ol><li> Lamelas de transferência contendo neurónios do hipocampo transfectadas para uma placa de quatro poços contendo 200 ul de HBS. </li><li> Adicionar 4 ul de coelenterazina N (200 uM) para 200 ul de HBS para uma concentração final de 4 | iM e misturar suavemente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente (25 ° C) e no escuro. </li></ol></li><li> A gravação de imagens bioluminescência de mitocondrial [Ca 2+]. <ol><li> Ligue o microscópio, a lâmpada, o sistema de perfusão, a bioluminescência e a câmara de computador. </li><li> Transferir para um lamelas reconstituídos (37 ºC) câmara de perfusão termostatado e perfundir continuamente com uma solução pré-aquecida de HBS a uma taxa de 5-10 ml / min. </li><li> Utilizando uma objectiva de 40X (óleo, NA: 1,3), seleccionar um campo do microscópio que contém células que expressam o umpoaequorins como mostrado pela emissão de fluorescência associada com a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) usando os filtros FITC. Um campo típico pode conter 1-2 células transfectadas. Capturar a imagem GFP fluorescência, usando uma câmera CCD. </li><li> Desligue a luz do microscópio. Retire a caixa contendo o dicróicas localizado na via de luz. Desligue a luz de excitação e fechar o dark-caixa para completa escuridão. </li><li> Perfundir células a 5-10 ml / min com meio de HBS com ou sem soluções de ensaio pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Capturar imagens de emissão fotônica a cada 10 segundos com uma câmera de fóton-contagem manuseados com um processador de imagem. </li><li> No final de cada experiência, permeabilizar as células com digitonina 0,1 mM em 10 mM de CaCl2 em HBS, a fim de libertar todos os restantes emissões fotónicas. Nota: Estas emissões fotônicas, devem ser adicionadas a fim de estimar o total de emissões fotônicas, um valor necessário para a calibração em concentrações de Ca2 + &lt;./ li&gt; <li> Imagens bioluminescência loja no computador a imagem de fluorescência da GFP associado com a imagem capturada antes de contagem de fótons. </li></ol></li><li> Análise de imagens bioluminescência reflectindo mitocondrial [Ca 2+]. <ol><li> Quantificar as emissões fotônicas usando software específico. Emissões fotónicas pode ser convertida em Ca 2+ concentração livre mitocondrial ([Ca 2+] MIT) utilizando o algoritmo descrito por Brini et al. 15. </li><li> Abra a imagem fluorescência da GFP e experiência. Seleccionarem regiões de interesse (ROI) com a ajuda de um software específico por o desenho da forma das células transfectadas de acordo com as imagens de fluorescência capturados no início da experiência. </li><li> Cole os mesmos ROIs em cada imagem. As emissões totais de fotônicos em cada ROI são calculadas com software específico para obter o valor de emissão de luminescência (L) para cada célula em cada ponto no tempo. </li><li> Adicione-se toda a Emiss fotônicoiões nas imagens bioluminescência, incluindo os obtidos após permeabilização digitonina, utilizando o software específico, para obter uma imagem de bioluminescência contendo todas as emissões fotónicas. </li><li> Os valores das exportações de emissões fotônicas para todas as regiões de interesse para um software específico para cálculos. Para fazer isso, clique em &#39;Gráfico&#39;, a fim de calcular os valores bioluminescência para cada ROI em cada momento. Selecione &quot;valor total&quot; e &quot;usar ROI atual para todas as imagens. Pressione &quot;calcular&quot;. Salve o &#39;txt.file&#39; e exportar dados para uma planilha. Para cada ROI [Ca 2+] mit é calculado usando o seguinte algoritmo: [Ca 2+] (m) = [I + (R · K TR) - 1] / [K R - (R K · R)]; Onde, R = [G / (G λ total)] 1 / n L é o luminescência emitida no momento da medição em cada região de interesse. L no total éa luminescência total restante após a adição das contagens presentes no tecido em que o tempo na altura da medição para cada região de interesse. λ, TR K, K R e n são constantes cujos valores dependem da combinação de aequorina (tipo selvagem ou mutado) e coelenterazin utilizado (do tipo selvagem ou de tipo n), bem como a temperatura de 16 gravação. Para a combinação usada aqui (mutado AEQ e coelenterzine n), a 37 ºC, foram utilizados os seguintes valores: R K = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0138. </li></ol></li><li> Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na bioluminescência em resposta a cada estímulo usando uma análise de dados e gráficos de software adequado. </li></ol>

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Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes.

A remodelação de Ca2 + intracelular homeostase no cérebro de envelhecimento tem sido relacionada à perda cognitiva, aumento da susceptibilidade à lesão isquêmica, excitotoxicidade e neurodegeneração. Para investigar esta hipótese in vitro, procedimentos de imagem Ca 2+ estão disponíveis. Infelizmente, culturas viáveis ​​de neurônios do hipocampo antigos não são confiáveis. Recentemente, tem-se observado que as culturas de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato apresentam muitas das ...

A excitotoxicidade é um dos mecanismos mais importantes que contribuem para o dano neuronal e morte celular em insultos neurológicos tais como a isquémia, e em algumas doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidade é mediada principalmente pela glutamato atuação no Ca 2+ -permeable, receptores NMDA (NMDAR ionotrópica) 2. A exposição de culturas de neurónios ao glutamato pode levar a excitotoxicidade 3, o que provoca a apoptose neuronal 4. Nós e outros autores relataram anteriormente que a vulnerabilidade neuronal para a apoptose induzida por NMDA podem mudar com o desenvolvimento in vitro e envelhecimento 5-8. É amplamente aceito que um aumento do free-citosólico concentração de Ca2 + ([Ca2 +] cit) leva à ativação de células. No entanto, se este aumento é muito elevada e / ou sustentada suficiente, pode desencadear a morte celular 9. Além disso, foi propostoexcitotoxicity que requer Ca 2+ mitocondrial captação de 10, uma vez que o tratamento de neurônios com um neurônios desacoplador mitocondrial protegidas contra a morte celular induzida pelo glutamato 11. Se mitocôndrias ocupam muito Ca2 +, a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial pode ocorrer, conduzindo à libertação de citocromo c e outros factores pró-apoptóticos, e induzindo a apoptose. Mostrámos recentemente que esta absorção de Ca2 + mitocondrial está directamente relacionado com a sensibilidade dependente da idade à excitotoxicidade, medindo directamente induzida por NMDA mitocondrial absorção Ca2 + nos neurónios do hipocampo individuais 5, um método que é relatado neste artigo. O hipocampo, envolvida em processos fisiológicos, tais como aprendizagem, memória e outros processos cognitivos 12, é altamente vulnerável ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas 13. Tem sido proposto que, após várias semanas in vitro, em culturaneurônios do hipocampo mostrar uma série de características típicas de neurônios com 14. Assim, a longo prazo neurônios do hipocampo em cultura pode fornecer um modelo abrangente para investigar Ca2 + mecanismos mediados do reforço da excitotoxicidade no envelhecimento. O objectivo geral do presente método é, por conseguinte, para investigar mudanças substanciais na homeostase intracelular de Ca2 + ou Ca2 + remodelação envelhecimento no cérebro incluindo o diferencial de Ca 2+ induzidos por agonistas de respostas de receptor de NMDA em um longo prazo neurónios do hipocampo em cultura . O método inclui uma descrição detalhada da cultura de neurónios de hipocampo de rato e a monitorização das concentrações citosólicas e mitocondriais Ca 2+ por fluorescência e imagem de bioluminescência em neurónios individuais, respectivamente. Imagiologia de fluorescência de Ca2 + citosólico em culturas de neurónios é um procedimento padrão. No entanto, este método é menos fiável para a subcelular de Ca2 + mitocondrial incluindo medições de Ca 2+. As razões para isso incluem a falta de direcionamento adequado de sondas sintéticas e afinidade inadequado para as concentrações de Ca2 + que podem mudar na mitocôndria do nível mM baixa, mesmo com o nível mM. O uso de sondas de Ca 2+ com base em proteínas como por exemplo a aequorina, tem permitido o direccionamento para organelos subcelulares e a utilização de derivados diferentes afinidades de Ca2 + utilizando diferentes sondas coelenterazines ou mutadas falta Ca 2+ sítios de ligação específica 15. Desta forma, a bioluminescência de imagem de células que expressam aequorin segmentada por mitocôndrias pode permitir o controlo das concentrações de Ca2 + mitocondrial em neurônios individuais. No entanto, este procedimento pode exigir o uso de câmeras de contagem de fótons ou câmeras CCD ultra-sensíveis para a bioluminescência de imagem 16-18. Este método pode produzir novos resultados que devem ser confirmados em mais established modelos de envelhecimento do cérebro como, por exemplo, fatias de cérebro de animais velhos.

<table><tbody><tr><td>Meio de Cultura Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS médio</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Presunto's F-12 médio</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (do pâncreas bovino)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bobine</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de vidro de 12 mm</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>placas multiprato de 4 poços</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placas Petry</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazina n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 microscópio de TV</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminação Xcite</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER câmera de fluorescência</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM câmera CCD de contagem de fótons</td> Controlador de válvula <td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8</td> Sistema de aquecimento <td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B&nbsp;</td><td>Software Aquacosmos da Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fotônica</td><td></td><td></td> de Hamamatsu</tr></tbody></table>

fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular ca<sup&gt; 2+</sup&gt; aged em neurônios do hipocampo

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Suscetibilidade a morte celular neuronal associada a neurodegeneração e isquemia são extremamente aumentada no cérebro envelhecido mas os mecanismos responsáveis ​​são mal conhecidos. A excitotoxicidade, um processo que se acredita contribuir para a lesão neuronal induzida por ambos os insultos, é mediada pela activação de receptores de glutamato que promove influxo de Ca2 + mitocondrial e sobrecarga de Ca2 +. Uma mudança substancial na homeostase intracelular de Ca2 + ou remodelação de Ca2 + intracelular homeostase pode favorecer danos aos neurônios nos neurônios velhos. Para investigar Ca 2+ remodelação no envelhecimento temos usado imagens de células vivas em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos que se assemelham em alguns aspectos neurônios in vivo com idade. Para este fim, as células do hipocampo são, em primeiro lugar, recém-dispersa de novas hipocampo de ratos recém nascidos e semeadas em lamelas revestido, vidro poli-D-lisina. Em seguida, as culturas são mantidas em meios controlada durante vários dias ou vários weeks para investigar jovens e velhos neurônios, respectivamente. Em segundo lugar, os neurónios em cultura são carregados com fura2 e submetido à medição da concentração citosólica de Ca2 + utilizando imagiologia digital de relação de fluorescência. Em terceiro lugar, neurônios cultivados são transfectadas com plasmídeos que expressam um conjunto de aequorin baixa afinidade e GFP alvejado a mitocôndria. Após 24 horas, aequorin dentro das células é reconstituído com coelenterazina e neurônios são sujeitas a imagem de bioluminescência para monitorização da concentração de Ca2 + mitocondrial. Este processo de três passos permite a monitorização de citosólica e respostas de Ca 2+ mitocondriais a estímulos relevantes como, por exemplo, o agonista do receptor de glutamato NMDA e comparar se estas e outras respostas são influenciadas pelo envelhecimento. Este processo pode produzir novos conhecimentos sobre a forma como o envelhecimento e influência citosólica de Ca2 + mitocondrial respostas a estímulos seleccionados, bem como o teste de fármacos seleccionados que visam prevenir células neuronaismorte em doenças relacionadas à idade.

Aqui, descrevemos um método simples para avaliar Ca2 + remodelação e os efeitos de NMDA no citosol e mitocondrial [Ca2 +], em neurónios envelhecidos. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do processo para o isolamento e a cultura de neurónios de hipocampo de ratos recém-nascidos. Antes de começar, precisamos preparar estéreis, revestidos, lamelas de vidro poli-D lisina e localizá-los em um 4-bem prato. Então, ratos recém-nascidos são mortos eo cérebro removido. Após o isolamento...

A remodelação intracelular de Ca2+ no envelhecimento pode contribuir para a excitotoxicidade e danos aos neurônios, processos mediados pela sobrecarga de Ca2+. Nosso objetivo foi investigar a remodelação de Ca2+ no cérebro envelhecido usando imagens de fluorescência e bioluminescência de Ca2+ citosólico e mitocondrial em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos, um modelo de envelhecimento neuronal.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a remodelação do cálcio no cérebro envelhecido por meio da imagem de fluorescência e bioluminescência do cálcio citosólico e mitocondrial em culturas de longa duração de neurônios hipocampais de rata, considerado um modelo de envelhecimento neuronal. Este método pode ajudar a compreender questões fundamentais no campo do envelhecimento, como a forma pela qual a remodelação do cálcio intracelular contribui para a excitotoxicidade e o dano neuronal, ambos relacionados à sobrecarga de cálcio. A principal vantagem desta técnica é que é possível acompanhar de perto a remodelação do cálcio em neurônios individuais utilizando culturas em diferentes DYS in vitro a partir do mesmo espécime, sendo a duplicação desta técnica fundamental para terapias contra acidente vascular cerebral ou doenças celulares, devido ao seu alvo inovador relacionado à sobrecarga de cálcio nessas doenças associadas ao envelhecimento.Após assistir a este vídeo, Jesus terá um bom entendimento de como realizar imagens de fluorescência e reminiscência de cálcio citosólico e mitocondrial em culturas de curto e longo prazo de neurônios do hipocampo de rato. Para iniciar este procedimento, distribua as lamínulas sobre uma tira de parafina em uma placa de Petri. Em seguida, aplique 200 microlitros de poli-D-lisina a um miligrama por mililitro sobre cada lamínula e deixe em tratamento durante a noite.No dia seguinte, lave as lamínulas com água estéril duplamente destilada a cada 15 minutos durante 90 minutos em condições estéreis. Coloque as lamínulas na placa multi e mantenha-as em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ até o uso. Para isolar os neurônios do hipocampo, abra o crânio das ratinhas recém-nascidas com tesoura estéril, extraia o cérebro com uma espátula e lave-o rapidamente em meio Ham's F12.Em seguida, faça um corte diagonal com o bisturi em cada hemisfério e transfira-o para a placa de Petri contendo meio hams F 12 sob o microscópio. Descarte as meninges. Identifique cuidadosamente o hipocampo em uma localização característica côncava sobre o córtex.Em seguida, separe o hipocampo do córtex puxando-o cuidadosamente e removendo-o com tesoura de olho. A seguir, transfira os fragmentos do hipocampo para um frasco contendo 1,8 mL de solução de pepanase pré-filtrada. Incube a 37 °C com agitação suave ocasional por 15 minutos.Em seguida, adicione 90 microlitros da solução um de DNA. Adicione 50 microgramas por mililitro e incube por mais 15 minutos. Após isso, transfira o tecido para um tubo cônico de 10 mililitros e lave os fragmentos com meio de cultura neurobasal fresco.Obtenha uma suspensão celular passando os fragmentos de tecido através de uma pipeta plástica de cinco mililitros. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 160 G durante cinco minutos. Posteriormente, remova o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur plástica estéril e suspenda cuidadosamente o pellet em um mililitro de meio de cultura neurobasal, usando uma pipeta automática de um mililitro.Em seguida, meça a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Adicione 10 microlitros de suspensão celular e conte o número de células ao microscópio. Em seguida, realize os cálculos correspondentes para obter de 40 a 80 microlitros de suspensão celular, contendo cerca de 30.000 células.No placa de quatro poços contendo 500 microlitros de meio neurobasal, semear cerca de 30.000 células em cada poço contendo lamínulas de vidro. Mantenha-as no incubador por dois a cinco dias in vitro para neurônios jovens ou por mais de 15 dias in vitro para neurônios envelhecidos. Neste procedimento, incubar as células com menos 2:00 AM por 60 minutos à temperatura ambiente e no escuro.Em seguida, transfira as lamínulas para a câmara de perfusão. Depois disso, coloque a câmara de perfusão com a lamínula no suporte do microscópio invertido. Selecione o campo microscópico e perfunda as células continuamente com HBS pré-aquecido.Posteriormente, ilumine as células em 340 e 380 nanômetros. Alternadamente, então registre a luz emitida em 520 nanômetros a cada cinco a 10 segundos com uma câmera fluorescente, que é filtrada por um espelho dicromático fira dois. Para analisar as imagens fluorescentes registradas, abra primeiro o arquivo do experimento utilizando o software Aqua Cosmos, clique em razão e selecione a faixa de razão desejada.Calcule a razão pixel a pixel nas imagens resultantes para obter uma sequência de imagens de razão. Em seguida, subtraia o fundo ajustando o botão de eliminação de fundo. Depois disso, pressione iniciar o cálculo.Em seguida, pressione o botão de toda a sequência temporal e apague as ROI antigas para análise quantitativa de células individuais. Estabeleça novas ROI ou as ROI correspondentes aos neurônios individuais. Para gerar gráficos dos registros individuais, exporte os valores de fluorescência em razão correspondentes a cada ROI para o programa Origin Lab clicando em gráfico.Em seguida, clique em calcular e salve o arquivo TXT. Depois disso, faça o cálculo correspondente para estimar o tamanho do aumento na razão de fluorescência em resposta a cada estimulação para transfectar neurônios cultivados com o plasmídeo mutante MIT. Primeiro, prepare 50 microlitros da solução A contendo o reagente de transfeção em um frasco.Em seguida, prepare 50 microlitros da solução B contendo plasmídeo MIT ute em um tubo. Adicione a solução B à solução A e incube por 20 minutos. Após isso, transfira as lamínulas contendo neurônios do hipocampo para novas placas multi contendo 200 microlitros de neuro basal TF fresco. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução A e B gota a gota sobre cada lamínula e incube por 30 minutos.Após 30 minutos, remova o meio. Lave as células com neuro basal tf fresco. Em seguida, devolva as lamínulas ao meio de cultura neuro basal original e cultive as células por 24 horas após a transfeção para permitir expressão eficiente e direcionamento da sonda.Em seguida, adicione quatro microlitros do selante TEREZIN N a 200 microlitros de HBS para obter uma concentração final de quatro micromolar. Misture suavemente e incube por duas horas à temperatura ambiente, no escuro. Após duas horas, transfira as lamínulas para a câmara de perfusão e perfunda continuamente com solução de HBS pré-aquecida.Para registrar as imagens de bioluminescência da concentração de cálcio mitocondrial, selecione o campo microscópico contendo as células que expressam APO corin, conforme indicado pela emissão de fluorescência. Em seguida, desligue a luz do microscópio. Remova a caixa contendo o dicróico localizada no trajeto da luz.Em seguida, desligue a luz de excitação e feche a caixa escura para obter escuridão total. Perfuse as células com meio HBS, com ou sem soluções-teste pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Em seguida, capture as imagens de emissão fotônica a cada 10 segundos usando uma câmera de contagem de fótons operada com um processador de imagens.Em seguida, adicione dig para liberar todos os fótons restantes para analisar imagens bioluminescentes que reflitam o cálcio mitocondrial. Abra a imagem de fluorescência GFP. Selecione ROIs individuais desenhando ao redor das células transfectadas.Em seguida, copie e cole as mesmas ROI em todas as imagens da sequência. Capturas de tela. Depois disso, exporte os valores de emissão fotônica para cada ROI para o software específico para cálculo — clique em gráfico.Para calcular os valores de cada ROI, selecione então o valor total e use a ROI atual em todas as imagens. Posteriormente, pressione calcular, salve o arquivo de texto e exporte os dados. Em seguida, realize os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos no cálcio mitocondrial em resposta a cada estímulo mostrado.Aqui estão imagens representativas em campo claro e cores pseudocoloridas de culturas de neurônios hipocampais de curto e longo prazo, antes e após estimulação com 100 micromolar e MDA; cores mais quentes refletem aumento na concentração citoplasmática de cálcio. Esses traçados mostram gravações representativas de célula única da concentração citoplasmática de cálcio em resposta a 100 micromolar e MDA em culturas de curto e longo prazo de neurônios hipocampais. Observe que os aumentos na concentração citoplasmática de cálcio são muito maiores em neurônios cultivados por longo prazo do que em culturas de curto prazo.Neste experimento, neurônios hipocampais cultivados foram transfectados com a korina de baixa afinidade direcionada às mitocôndrias, fundida à GFP, e incubados com quatro micromolares de selante terezina, sendo então submetidos à imagem de bioluminescência da concentração de cálcio mitocondrial. Aqui, as gravações mostram a liberação de emissões luminosas que refletem o cálcio mitocondrial em neurônios hipocampais cultivados a curto e longo prazo. Uma concentração de 100 micromolares de MDA aumentou a concentração de cálcio mitocondrial em neurônios envelhecidos, mas não em neurônios hipocampais jovens cultivados, após este procedimento.Outros métodos, como a avaliação de lesão hepática, podem ser combinados com imagens de fluorescência e bioluminescência nas mesmas células para responder perguntas adicionais, como a suscetibilidade à morte celular neuronal, ligada à neurodegeneração associada ao envelhecimento e à isquemia.

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem...

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imagem longitudinal de dois fótons do hipocampo dorsal CA1 em camundongos vivos. J. Vis. Exp. (2019) Este vídeo demonstra imagens longitudinais de dois fótons de neurônios piramidais marcados com fluorescência em um camundongo vivo,  apresentando a preparação, alinhamento da cânula e imagem de dendritos e espinhas dendríticas para estudar a estrutura neuronal na região CA1 do hipocampo.

Imagem longitudinal de dois fótons de neurônios marcados com fluorescência em um hipocampo de camundongo vivo 

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/53330/ imagem de fluorescência e bioluminescência de ca2 subcelular em neurônios do hipocampo envelhecidos '&gt;Calvo-Rodríguez, et al. Imagem de fluorescência e bioluminescência de Ca style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;2+ em neurônios do...

Imagem de cálcio in vitro em culturas de hipocampo de rato de curto e longo prazo

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra imagens de cálcio em tempo real para monitorar a atividade sináptica em neurônios mutantes de ALS que expressam um biossensor de cálcio geneticamente codificado. Ele descreve as etapas para preparar os neurônios para imagens, estimular a dinâmica do cálcio e registrar a fluorescência para medir as mudanças em tempo real nos...

Imagem de fluorescência da dinâmica sináptica do cálcio em um modelo in vitro de esclerose lateral amiotrófica

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aprenda a investigar o remodelamento do cálcio em neurônios hipocampais de ratos envelhecidos usando imagens de fluorescência e bioluminescência. Este método permite analisar dinâmicas de cálcio citoplasmático e mitocondrial em culturas de longo prazo.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca

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