Name: Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a rotular neurônios e projeções axonais com precisão aumentada em explantes de cérebro de camundongo usando equipamento óptico básico. Este método permite genotipagem não invasiva e mapeamento de circuitos neurais.

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Financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC 011582. experimentos de imagem foram realizados na Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus Avançado Microscopia de Luz Núcleo apoiado em parte pelo NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Número UL1 RR025780 e os Transtornos Rocky Mountain Neurlogical Núcleo Centro Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac, do Instituto Salk nos forneceu os ratos GLYT2-GFP.

1. A genotipagem Optical 1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro <ol><li> Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser. </li></ol> 2. Optical genotipagem de animais mais velhos <ol><li> Profundamente anestesiar o rato (p14 envelhecido ao p138 nas experiências descritas aqui) com uma overdose de pentobarbital através de uma injecção intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme anestesia adequada, verificando os reflexos do animal (apertar brevemente a ponta do the orelha ou uma das patas traseiras para o reflexo de retração da orelha ou na perna). </li><li> Nota: Apesar do uso de uma overdose de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos ao procedimento de injeção como &quot;anestesia profunda&quot; em vez de eutanásia, porque o animal é idealmente ainda vivo (ou seja, seu coração ainda está batendo), quando o cirurgia e começar a perfusão. Isto assegura uma perfusão mais eficiente dos órgãos internos incluindo o cérebro. </li><li> Uma vez que o animal não mostram quaisquer reflexos, remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio (Figura 2A), fazendo uma incisão na pele que cobre a parte traseira da cabeça de corte e para o meio do crânio. Expor o crânio expostos a luz laser e observar a fluorescência através dos óculos de filtro, conforme descrito acima. Se um sinal de GFP positiva é observada, vá para a etapa 2, se não, sacrificar o animal através de decapitação (segunda / garantindo forma de eutanásia seguindo a nossaRegulamentos IACUC). </li></ol> Nota: Nos ratos mais velhos mesmo (&gt; 1 mês) a fluorescência podem ser observados através dos olhos do animal. 2. transcardial perfusão e Preparação Cérebro <ol><li> Perfundir transcardialmente com gelada salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4, 10 mM) utilizando uma agulha de seringa de 30 L para remover em grande parte do sangue a partir de o animal. <ol><li> Primeiro, abra cuidadosamente a caixa torácica com uma tesoura afiada e, em seguida, empurre a agulha para o ventrículo esquerdo do coração. Começar a bombear a PBS para o coração e a aorta e imediatamente após este passo abrir o átrio direito do coração com a tesoura para permitir que o sangue saia do corpo. Nota: Perfusão leva de 5 - 10 minutos, dependendo do tamanho do animal. </li></ol></li><li> Após sangria por meio de perfusão, decapitar o animal, garantir a sua cabeça com o pino needles (ou 30 g) por agulhas de seringa perfurar-los através dos soquetes de olho em um prato preparação e remover o cérebro do crânio. <ol><li> Em primeiro lugar, utilizar uma tesoura afiada para cortar a pele que cobre o crânio: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça, em seguida, cortada ao longo da linha média do lado dorsal da cabeça, cortada aos lados apenas caudal de os olhos do animal e por último corte na direcção caudal, para remover completamente os retalhos de pele na parte de trás da cabeça. </li><li> Em seguida, repetir o mesmo padrão de corte para o próprio crânio, certifique-se de remover ambas as cócleas no processo, porque isso irá simplificar significativamente a remoção do tronco cerebral no final. Após este procedimento, a metade caudal do cérebro deve situar-se completamente exposta. </li><li> No passo seguinte, utilizar uma lâmina de barbear afiada ou um bisturi para cortar através de todo o cérebro anterior com um ângulo de cerca de 45 ° e cerca de 2 mm rostral do cerebelo. Retire a metade da frente separados do cérebro com abespátula ent. </li><li> Usar uma espátula para elevar a metade caudal do cérebro na sua extremidade rostral e subsequentemente cortar os nervos cranianos que ainda estão ligados ao tronco cerebral no seu lado ventral. Como resultado final, a metade caudal do cérebro, incluindo o tronco cerebral devem cair livremente fora do resto da cabeça preparados para animais. </li><li> Vire a metade caudal removido do cérebro para expor seu lado ventral e corte ao longo do plano coronal apenas rostral (para as injeções anterógradas) ou apenas caudal (para as injeções retrógradas) das &quot;lâmpadas&quot; ventrally localizados contendo o corpo trapézio (veja o passo 2.3). <ol><li> Utilize sempre uma lâmina afiada ou um bisturi para o procedimento de corte para minimizar a morte celular causada por estresse mecânico excessivo sobre o tecido. Como resultado final, um explante cérebro que mede cerca de 1 cm de comprimento e contendo o complexo olivar superior completa ao longo de outras regiões do cérebro deve ter sido obtida. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Este protocolo demonstra o processo de injecção de um traçador no corpo trapezoidal localizado no tronco cerebral auditivo. Adaptar a localização e a orientação dos planos de corte e dos locais de injecção, conforme necessário. Se as regiões do cérebro fluorescentes de interesse estão muito próximas o suficiente para a superfície do cérebro, de modo que eles podem ser identificados e injectados sem cortar o cérebro (ver Figura 2B), então o passo de corte coronal pode ser omitido. <ol start="3"><li> Identificar o corpo trapézio como dois ventrais proeminentes &quot;lâmpadas&quot; contendo o núcleo ventral do corpo trapézio (VNTB). </li></ol> Nota: Para mais referência anatômica em relação à localização estereotáxica aproximada desses planos de corte, consulte Franklin &amp; Paxinos de 2008. Panel 78 dos atlas, Bregma ~ -5,7 mm mostra o núcleo medial do corpo trapezóide (= MNTB) rotulados como &quot;Tz &quot;. Painel 69 mostra o núcleo ventral do bo trapezoidaldy (VNTB) rotulados como &quot;MVPO&quot; (núcleo periolivary medioventral) 19. 3. anterógrada / retrógrada Tracing Nota: Execute todos os procedimentos a seguir em RT (25 ° C). <ol><li> Após o corte, colocar o explante do tronco cerebral em um prato de preparação contendo oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) dissecando solução (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glicose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), prendendo-o com 30 g de agulhas de seringa. Assegure-se que a área de injecção está virada para cima. </li><li> Puxar pipetas de injecção de vidro de borosilicato e enchê-los com uma das três soluções seguintes: a) um / ml, solução 1,0 mg de subunidade choleratoxin-b conjugado com um fluoróforo Alexa 555 em PBS 12-13 (usado principalmente para transporte retrógrado), b ) um -d 1%ilution em 0,9% de solução salina de tetramethylrhodamine dextrano 555 (3.000 MW, usado principalmente para transporte retrógrado) ou c) um -dilution 1% em solução salina 0,9% de 10.000 MW dextrano-TRITC 555 (usado principalmente para o transporte anterógrado). <ol><li> Assegure-se que as resistências das pipetas de injecção gama 2,5-3,5 MOhm e que eles são fabricados em 3 - 4 ciclos de tracção. Para as experiências aqui descritas, conseguir isto seleccionando um algoritmo pré-programado puxando o puxador na pipeta. </li></ol></li><li> Iluminar o explante cérebro usando um ponteiro laser montado estaticamente do comprimento de onda apropriado (produto n ° 2 na Figura 3A; comprimento de onda de 405 nm, nas experiências descritas aqui). Use o ponteiro laser como um guia para as preparações injectáveis, e tem como objectivo o feixe de laser no núcleo cérebro marcado fluorescentemente ou células de interesse que será injectada. </li><li> Encontrar e observar a área alvo iluminado através de um microscópio binocular enquanto usava os óculos de filtragem compatíveis (450 - 700 nm, filtro passa-banda, nas experiências descritas aqui). Inserir o eléctrodo de injecção através do micromanipulador para a área de interesse. </li><li> Injectar a substância marcadora. As injecções de composto de 2 - 10 impulsos de pressão a 15 psi durante 50 ms cada, utilizando um dispositivo de injecção à pressão, dirigido perpendicularmente para a região de interesse (ROI) no interior da secção de cérebro. Administrar cada impulso de pressão em intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que o corante se espalhar. </li><li> No caso das injecções de tetrametilrodamina (TRITC), adicionalmente estimular electricamente para melhorar a absorção do corante através de electroporação com o eléctrodo colocado na área do cérebro de interesse (MNTB e VNTB nas experiências descritas aqui). <ol><li> Use 8 pulsos TTL de 8 Volts por 50 ms com 50 ms de intervalo entre intervalos, impulsionado por um estimulador e amplificados a 55 V com uma unidade de isolamento, a estimulação (itens No. 7 e 9 na Figura 3B). Use 10 - 20 repetições deste protocolo, administered durante vários minutos 7,8. Certifique-se para aterrar o eletrodo corretamente - o fio terra deve ser conectado à solução do banho! </li></ol></li><li> Entrada para o sucesso da injecção. Uma vez que um marcador fluorescente com um comprimento de onda de emissão também já está a emitir um sinal de fluorescência após excitação laser com comprimentos de onda mais curtos, para verificar visualmente a absorção do corante / espalhar na área alvo injectado enquanto iluminando a área com o laser e observando através dos filtros de óculos. </li></ol> 4. Incubação <ol><li> Após a injecção, incubar o tronco cerebral em oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, fez-se borbulhar 95% de O2 - 5% de CO2) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, enquantoo corante está a ser transportado. Bolha da solução durante todo o período de incubação. </li><li> Subsequentemente, transferir os tronco cerebral em 4% de paraformaldeído (PFA) dissolvido em PBS (aproximadamente 100 mL;. PH 7 para a mistura de PFA / PBS) e incuba-se-lhes a 4 ° C para permitir a pós-fixação durante a noite (O / N). </li></ol> 5. Tissue corte e montagem <ol><li> No dia seguinte, o tronco cerebral lavar três vezes em PBS (5 min para cada passo de lavagem), cobri-lo em 4% de agar e, em seguida, cortada em 50 - 80 pm de espessura fatias em um vibratome. Fatias de montagem utilizando um meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, e lamela. </li><li> Opcionalmente, rotular as secções com Nissl fluorescente durante 25 min (por exemplo, azul de Nissl em uma diluição de 1: 100 em meio AB). <ol><li> Para preparar meios AB, misturar 250 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB; KH 51 mM 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml de 10% de Triton-X, de 220 ​​ml ddH2O e 5 g de albumina de soro bovino. </li><li> Precede e sucede à rotulagem passo Nissl por 3 etapas de lavagem em PBS (10 min cada). </li></ol></li></ol> Nota: Nos casos em secções mais espessas necessitam de ser montadas e analisadas (em experiências aqui descritas tais fatias foram 100 - 500 mícrons de espessura para preservar ligações axonais ao longo de distâncias maiores), a técnica pode ser combinada com a limpeza dos tecidos. Nós encontramos o ClearT2 12 para ser bem sucedido 20. Quando um passo de compensação tecido está incluído, realizá-la antes da montagem das seções.

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<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235(2007).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sobre a utilização de...

A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem 2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para a fonte de uma determinada projeção, ou seja. O somata de neurónios que se projectam para a referida área) e anterógrada activo (a partir do injectados área para o destino de uma determinada projeção, ie. as projeções axonal e os terminais axonais dos neurônios marcados) de transporte. Além disso, em alguns casos tramaterial de CER é injectada em animais vivos que, em seguida, sobrevivem a injecção por vários dias ou semanas (em injecções vivo tracer), enquanto que em outros casos cérebros explantados são injectados e incubar durante várias horas após a injecção no líquido cerebrospinal artificial (in vitro injecções tracer) . Neste protocolo, modificou um já existente na técnica de eletroporação vitro 7-8 para rotular somata e processos neuronais em anterógradas e rastreamento retrógrado experimentos usando choleratoxin subunidade-b e tetramethylrhodamine dextrano como as substâncias de rastreamento. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar neurocientistas com uma ferramenta eficiente para traçar padrões de conectividade neuronal entre diferentes núcleos cerebrais, enquanto aproveita as vantagens das linhas de camundongo transgênico disponíveis e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão do alvo durante injeções traçadores. Embora o método de anterógrada e retrógrada usando o rastreamentocholeratoxin e amina de dextrano e os seus respectivos conjugados marcados com fluorescência não é nova 9-13 (como é o método de electroporação, por exemplo. Haas et ai. 14), a combinação de marcador com injecções electroporação numa preparação in vitro envolvendo blocos de tecido cerebral é um desenvolvimento mais recente 7. A sua principal vantagem sobre as técnicas de rastreio neuronais utilizando o mesmo tipo de corantes marcador nos animais vivos é o aumento da intensidade de marcação, em virtude da maior eficiência com que o corante é a electroporação podem ser tomados por neurónios. Uma vantagem adicional é o período de incubação encurtado (necessário para o transporte de corante) e da sua maior precisão o alvo durante a injecção do traçador, porque o experimentador tem o controlo visual sobre a área alvo da injecção. Este último também significa que nenhum equipamento caro estereotáxica é necessário para encontrar núcleo ou o cérebro área de interesse. Para addicionalmente aumentar a precisão da focalização, que se aproveitou de uma linha de camundongo transgênico, que expressa GFP na sua subpopulação glicinérgica de neurônios 15 e equipamentos ópticos de base constituídos por um ponteiro laser de mão de 405 nm óculos de filtragem comprimento de onda e correspondência passa-banda (450 - 700 nm). Assim, conseguimos uma aumento significativo no direccionamento precisão, identificando a área de injecção através do seu sinal de fluorescência e ao proporcionar uma forma mais fina para controlar a difusão do corante dentro da área de injecção através da observação da interacção entre o sinal de GFP nativa e o traçador fluorescência. A nossa técnica também permite descobrir a funcionalidade de um circuito, juntamente com a sua conectividade por identificar neurónios inibitórios GFP positivas (ou excitatório em outras linhas de rato) que foram preenchidos com o traçador. Em resumo, ainda mais reforçada uma poderosa ferramenta para estudar o neuroscientific conectoma do cérebro de vertebrados e avaliar tEle características diferentes neuroanatomical de um determinado neurocircuit. Ao usar camundongos transgênicos, juntamente com equipamentos ópticos barata e amplamente disponível, fomos capazes de aumentar significativamente a precisão da focalização dos nossos injeções. Além disso, os ratinhos transgénicos nos permitiu identificar o tipo das ligações rastreadas, que ajudaram a descobrir a funcionalidade de um microcircuito inibitório no tronco encefálico.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Todos os produtos químicos são da Sigma-Aldrich, salvo indicação em contrário.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio di-básico</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td></td> de magnésio <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td></td> de cálcio <td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td> de sódio <td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td> ascórbico <td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Mio-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>P2256</td><td></td>Albumina <td></td></tr><tr><td></td><td>de soro bovino</td><td>A2153</td><td>opcional, para (imuno)histoquímica adicional</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>opcional, para (imuno)histoquímica adicional</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>opcional, para limpeza</td></tr><tr><td>cerebral Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>opcional, para limpeza cerebral</td></tr><tr><td>Cólera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td> <td>Dextrano tetrametil-rodamina</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (azul)</td><td></td></tr><tr><td>opcional Paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Zeitz Instruments, Alemanha</td><td>Extrator</td><td></td>Universal DMZ</tr><tr><td>Configuração de perfusão</td><td>Ponteiro laser personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filtro/óculos de segurança</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (passagem de banda 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio bionocular&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Suíça</td><td>Wild M3</td><td>Equipado com iluminador de alta intensidade (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC com software MC Stimulus instalado</td><td>Sistemas multicanais, Alemanha (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de 2 canais</td><td>Sistemas multicanais, Alemanha</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de isolamento de estimulação</td><td>A.M.P.I., Israel</td><td>Micromanipulador Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige, Japão</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Alemanha</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.

As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados ​​de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-natal 3 (Fig...

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

O objetivo geral deste método é rotular neurônios e suas projeções axonais para rastrear suas conexões com núcleos cerebrais de interesse, sejam eles alvos ou origens. Este método auxilia na resposta de questões fundamentais em neurociência, como os padrões de conectividade entre diferentes áreas ou subpopulações neuronais do cérebro, bem como sua significância funcional para um determinado circuito neural. A principal vantagem desta técnica é a maior precisão no alvo durante as injeções do marcador.Isso é conseguido utilizando equipamento óptico básico para visualizar núcleos cerebrais marcados com fluorescência. Outra vantagem deste método é que ele permite o genotipagem não invasiva de ninhadas de camundongos que expressam proteínas fluorescentes sob o controle de promotores neuronais. Ao genotipar as ninhadas, verifique a expressão dos respectivos marcadores fluorescentes utilizando um ponteiro laser com o comprimento de onda de excitação apropriado.Ao mesmo tempo, use óculos de filtro que bloqueiam o comprimento de onda de excitação, mas permitem a passagem do comprimento de onda de emissão. Direcione o laser para a parte posterior da cabeça ou para a medula espinhal da ninhad

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve a manipulação de neurônios cultivados usando laser pinças in vitro.

Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'&gt;Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018) Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de...

Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Células neuroprogenitoras Humanos (NPCs) foram expandidas em condições de proliferação. NPCs foram diferenciadas em culturas ricas em neurônios na presença de uma combinação de neurotrofinas. Marcadores neuronais foram detectadas pela técnica de imunofluorescência. Para isolar uma população pura de neurônios, NPCs foram diferenciadas em PEN lâminas de membrana e captura de microdissecção a laser foi realizada.

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

Imagem de dois fótons, acoplado a nanodissection laser, são ferramentas úteis para estudar processos degenerativos e regenerativos no sistema nervoso central, com resolução subcelular. Este protocolo mostra como rotular, imagem e dissecar fibras escalada individuais no córtex cerebelar in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Aprenda a rotular neurônios e projeções axonais com precisão aumentada em explantes de cérebro de camundongo usando equipamento óptico básico. Este método permite genotipagem não invasiva e mapeamento de circuitos neurais.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

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