Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

O objetivo geral deste método é rotular neurônios e suas projeções axonais para rastrear suas conexões com núcleos cerebrais alvo ou fonte de interesse. Este método ajuda a responder a questões-chave em neurociência, como padrões de conectividade entre diferentes áreas ou subpopulações neuronais do cérebro, bem como seu significado funcional para um determinado circuito neurológico. A principal vantagem desta técnica é o aumento da precisão do alvo durante as injeções de traçadores.

Isso é conseguido usando equipamentos ópticos básicos para visualizar núcleos cerebrais marcados com fluorescência. Outra vantagem desse método é que ele permite a genotipagem não invasiva de pops de camundongos que expressam proteínas fluorescentes sob o controle de promotores neuronais. Ao genotipar, os filhotes verificam a expressão dos respectivos marcadores fluorescentes usando um ponteiro laser com o comprimento de onda de excitação apropriado.

Ao mesmo tempo, use óculos de filtro que bloqueiam o comprimento de onda de excitação, mas passam o comprimento de onda de emissão. Aponte o laser para a parte de trás da cabeça ou para a medula espinhal do filhote em questão. Tenha cuidado para não brilhar o laser nos olhos do P e mantenha a exposição ao laser curta.

Os marcadores fluorescentes excitados devem ser visíveis através da pele. Quando o camundongo é mais velho, neurônios individuais de tecidos colhidos podem ser identificados. Depois de anestesiar o camundongo e verificar a ausência de reflexo, remova a pele sobre o crânio, corte a pele ao longo da parte de trás da cabeça até o meio do crânio.

Em camundongos ainda mais velhos com mais de um mês, a fluorescência pode ser observada através dos olhos do animal. Em seguida, usando PBS trans Cardi gelado, perfunda o animal marcador positivo usando uma agulha de calibre 30, após cinco a 10 minutos, a maior parte do sangue será removida. Em seguida, remova o cérebro e disseque a região de interesse.

Aqui, o corpo trapezoidal, que são dois bulbos proeminentes na região ventral do cérebro, contém a região de interesse. Os núcleos ventrais dos corpos trapezoidais ou VNTB começam com a transferência da região cerebral explantada de interesse para um prato de solução de dissecação oxigenada. Ali. Fixe a explanação com agulhas de seringa de calibre 30 para que a área injetável seja acessível na parte superior.

Para a injeção, use pipetas de injeção puxadas por vidro de silicato Bo que são fabricadas em três ou quatro ciclos de tração. Carregue a pipeta com a seguinte solução. Subunidade B da toxina da cólera conjugada a Alexa FLUORA 4 5 55, que é principalmente para transporte retrógrado.

Com o ponteiro laser e as pipetas de injeção, todos montados e prontos para uso, prossigam com o direcionamento do feixe para a região cerebral marcada ou células a serem injetadas. Observe o campo através dos óculos de filtro passa-banda para ver quais neurônios atingir com a pipeta de injeção. Use o micro manipulador para posicionar a pipeta na área de interesse.

Em seguida, usando um injetor de pressão ajustado para fornecer pulsos de 50 milissegundos a 15 PS, injeto a substância traçadora em dois a 10 pulsos. Aguarde de 10 a 15 segundos entre os pulsos para que o corante injetado possa se espalhar. Ao injetar tetraetila rumina eletricamente estimular a região com o eletrodo de estimulação que fornece pulsos TTL.

Certifique-se de que o eletrodo esteja aterrado na solução do banho. Forneça oito pulsos TTL a oito volts cada um com 50 milissegundos de duração com intervalos de 50 milissegundos. Estimule a região com 10 a 20 repetições de pulso ao longo de vários minutos.

Os núcleos cerebrais variam em tamanho, densidade neuronal e tipos de células. Isso significa que a duração e o número de pressão e/ou pulsos elétricos podem precisar ser ajustados para obter resultados de rotulagem ideais para uma determinada região do cérebro. Usando o laser e os óculos de proteção, verifique o sinal do traçador fluorescente.

O corante deve ser absorvido pelas células e espalhado pela área injetada. Após a injeção, incube os troncos cerebrais no líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado à temperatura ambiente por uma a quatro horas. Mantenha a oxigenação durante a incubação e, em seguida, fixe o tecido em 4% de aldeído paraforme.

Em PBS durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte, o tecido pode ser fatiado e montado em uma injeção intergrada no núcleo ventral do corpo trapezoidal ou VNTB. O uso da dextrina tetraetil rodina mostra que as projeções do VNTB se estendem ao núcleo medial do corpo trapezoidal, ou MNTB. Em seguida, o MNTB foi injetado com chole toin, subunidade B, que retro rotulou muito o VNTB.

Em maior detalhe, o somata das células VNTB entéricas glic parecia ser rotulado a seguir. O MNTB foi injetado com o rótulo retrógrado dextrina tri. Ao contrário do padrão pontilhado da marcação CTB, a marcação da dextrina foi densa e semelhante a GOGI.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular neurônios e seus processos com maior precisão. A técnica demonstrada ajuda a identificar áreas cerebrais e subpopulações neuronais que participam de um determinado circuito neurológico, uma vez dominado, o procedimento de injeção pode ser feito em cerca de 30 minutos se realizado corretamente. Este procedimento pode ser facilmente combinado com outros métodos, como imunoquímica ou limpeza cerebral, para responder a perguntas adicionais sobre a morfologia, direcionalidade ou funcionalidade das projeções neuronais e outras estruturas neuronais.