Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

O objetivo geral deste procedimento é mostrar como determinar os efeitos de fatores de crescimento e inibidores na expressão gênica de membros embrionários de galinha em desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como a forma como as moléculas sinalizadoras influenciam o crescimento e as diferenciações das células in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método para testar esses fatores diretamente no embrião.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento do membro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como tecido neural, somitos ou gastrulação. Demonstrando o procedimento estará Rebeea Mohammed, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, transfira um mililitro das contas da solução original para um novo tubo.

Deixe as contas assentarem, remova o líquido e substitua-o por um mililitro de PBS. Repita esta etapa cinco vezes e armazene as contas lavadas a quatro graus Celsius, como uma pasta em PBS. Selecione os grânulos para enxertia, removendo-os da solução de estoque lavada usando uma pipeta de 20 microlitros e coloque-os em um mililitro de PBS.

Usando um estereoscópio, escolha contas com cerca de 100 mícrons de diâmetro. Transfira as esferas selecionadas em dois microlitros de líquido para uma nova placa de Petri contendo uma gota de 20 mililitros de PBS Em seguida, remova o PBS das contas. Primeiro, com pipeta de 20 microlitros e, em seguida, remova o líquido residual por ação capilar usando uma pinça de relojoeiro fino.

É importante remover o máximo de líquido possível para que o fator de crescimento não seja diluído quando for adicionado às contas. Pipete o fator de crescimento diretamente nas contas. Para FGF18, adicione 0,5 microlitros de FGF18 recombinante, reconstituído adicione 0,5 miligramas por mililitro em PBS com 0,1 por cento de BSA.

Em seguida, coloque várias gotas de água ao redor das bordas do prato para evitar que o líquido evapore. Quando estiver pronto, incube as contas por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, retire as gotas de água do prato com uma pipeta Pasteur e coloque o prato no gelo.

Derivatize os grânulos, usando primeiro uma espátula para transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de ácido fórmico normal 0,2 e incube as esferas no ácido em uma plataforma agitada por uma hora. Em seguida, deixe as contas assentarem, remova o ácido fórmico e substitua-o por um mililitro de água.

Lave as contas por uma hora na plataforma vibratória e repita a lavagem seis vezes para remover qualquer ácido fórmico residual. Após a última lavagem, remova o líquido restante e guarde as contas a quatro graus Celsius. Use uma espátula para remover uma pequena paleta de contas de aproximadamente cinco a dez microlitros de volume do caldo e coloque as contas em uma placa de Petri de 30 mililitros.

Em seguida, adicione um mililitro de DMSO. Em seguida, use uma pipeta P2 ajustada para dois microlitros, para transferir grânulos de aproximadamente 100 mícrons de diâmetro, para uma gota de 20 microlitros de solvente em outra placa de Petri de 30 mililitros. Remover a maior parte do solvente com uma pipeta de 20 microlitros e qualquer solvente residual com uma pipeta de dois microlitros.

Em seguida, cubra as esferas com 20 microlitros do medicamento a ser aplicado, dissolvido em DMSO. Incube as esferas na solução do medicamento por uma hora. Proteja as esferas da luz, pois muitas moléculas de medicamentos são sensíveis à luz.

Para ajudar a visualizar as contas, transfira de quatro a cinco contas em dois microlitros de líquido para 20 microlitros de vermelho de fenol a dois por cento dissolvido em água. Remova uma única conta com uma pinça de relojoeiro fino e enxágue a conta em PBS. Não deixe grânulos na solução de vermelho de fenol por mais de 15 minutos antes de enxaguá-los, pois isso pode causar perda de atividade.

Corte o fio de tungstênio fino em comprimentos de três a quatro centímetros Em seguida, insira um pedaço do fio na extremidade de uma pipeta de vidro Pasteur e derreta em um bico de Bunsen para fixá-lo na posição. Prepare até 10 agulhas para garantir que haja peças sobressalentes se estiverem danificadas. Em seguida, coloque a ponta do fio em uma chama de maçarico e segure-a até que o tungstênio brilhe em branco e a ponta fique afiada.

Isso leva cerca de dois a três minutos. Adicione cinco a seis gotas de tinta nanquim artística a 15 mililitros de PBS contendo 100 unidades de penicilina e 0,1 miligramas de estreptomicina por mililitro. Para preparar os embriões de galinha, incube os ovos com a extremidade romba até atingirem o estágio desejado para a manipulação da maioria dos botões dos membros, que normalmente leva de três a cinco dias.

Quando o ponto de tempo desejado for atingido, use uma pinça romba para bater na ponta cega do ovo e quebrar a casca. Em seguida, use a pinça para remover a casca e expor o embrião. Certifique-se de que a membrana do óvulo também seja removida.

Para visualizar o embrião, injete PBS suplementado com algumas gotas de tinta nanquim artística, sob o embrião com uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 21. A membrana vitelina que cobre o embrião pode então ser removida com uma pinça fina. Em seguida, adicione dois a três mililitros de PBS suplementado com um por cento de soro fetal de bezerro, 100 unidades por mililitro de penicilina e 0,1 miligramas por mililitro de estreptomicina, no ovo para garantir que o embrião não desidrate.

Usando uma pinça de relojoeiro afiada, abra o âmnio sobre os botões dos membros em desenvolvimento. Nesses estágios, o embrião normalmente gira, de modo que o lado direito fique mais alto. Certifique-se de que o embrião não seque adicionando mais da solução de PBS suplementada quando necessário.

O âmnio ao redor do embrião pode ser aberto usando uma agulha fina de tungstênio para revelar o membro em desenvolvimento. Em seguida, use o fio de tungstênio afiado para fazer uma incisão no botão do membro onde o cordão será implantado. Evite cortar todo o broto do membro, sempre que possível.

Embora em estágios mais jovens, isso é difícil. Pegue uma conta, revestida com o fator de crescimento ou droga, usando uma pinça de relojoeiro extra fina. Se o grânulo foi embebido em DMSO ou vermelho de fenol, certifique-se de que seja enxaguado com PBS antes de aplicá-lo no embrião.

Transfira o cordão para o embrião usando a pinça e, em seguida, use o fio de tungstênio afiado para inserir o cordão no local da incisão. Adicione mais um a dois mililitros da solução PBS suplementada ao ovo para garantir que o embrião seja mantido hidratado. Evite aplicar a solução diretamente no próprio embrião, pois isso pode danificar o embrião e fazer com que o cordão seja desalojado.

Em seguida, use uma seringa de dez mililitros, equipada com uma agulha de calibre 19 para remover apenas a quantidade de albumina necessária para garantir que o embrião não entre em contato com a fita usada para selar o ovo. Certifique-se de que a agulha não danifique a gema, deslizando-a para baixo na parte interna da casca. Por fim, sele o ovo com fita adesiva e devolva-o à incubadora.

Para confirmar que o FGF18 é capaz de atuar através do MEK para fosforilar o ERK, os embriões foram colhidos uma hora após a enxertia de grânulos e imunomarcados para a presença de ERK fosforilado, que pode ser visto ao redor do grânulo enxertado na imagem à direita. No estágio HH 21, o MyoD não é expresso no desenvolvimento de mioblastos de membros. Embora a coloração possa ser observada no miótomo dos somitos em desenvolvimento.

Seis horas após um enxerto de cordão FGF18, MyoD pode ser visto induzido em mioblasto próximo ao grânulo. Enquanto não há expressão no membro contralateral. Essa expressão pode ser inibida pelo co-enxerto de um cordão, revestido com um inibidor de MEK, como o U0126.

Da mesma forma, o enxerto de um cordão U0126 no estágio HH 21 reduz a expressão endógena de MyoD após 24 horas, em comparação com o membro contralateral não tratado. Em brotos de membros, no estágio HH 19, FGF18 não induz MyoD. No entanto, o co-enxerto de grânulos embebidos em FGF18 e um antagonista do ácido retinóico pode superar isso, e MyoD ectópico é detectado.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro minutos, se for executada corretamente. O desenvolvimento desta técnica permitiu aos investigadores da área da biologia do desenvolvimento explorar a sinalização dos fatores de crescimento no desenvolvimento embrionário. Ao tentar essa técnica, é importante lembrar de não deixar o embrião secar.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como enxertar grânulos em embriões em desenvolvimento para determinar como a sinalização dos fatores de crescimento afeta o desenvolvimento.