Name: Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a técnica de enxerto de beads em embriões de galinha para estudar fatores de crescimento e inibidores na expressão gênica durante o desenvolvimento de membros. Este método permite testar diretamente moléculas sinalizadoras in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi parcialmente financiado por um prêmio de início de carreira da Universidade de Nottingham para DS. O RM é financiado pelo Comitê Superior para o Desenvolvimento da Educação do Iraque.

Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham. 1. Preparação de heparina Beads para enxertia <ol><li> Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS. <ol><li> Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar uma micropipeta ajustado para 2 ul de transferência de contas em uma gota de 20 ul de PBS numa placa de petri de 3 cm. Escolha grânulos com base no tamanho e, usando um aparelho de som microscópio de dissecação, transferir grânulos selecionados com uma ponteira P2; aqueles em torno de 100 mm de diâmetro são ideais. </li></ol></li><li> Remover o PBS a partir dos grânulos. Remover a maior parte do líquido, com uma pipeta de 20 uL e o líquido residual por acção capilar com fórceps de relojoeiro finas. Nota: É importante remover tanto quanto possível de modo que o crescimento factoR não é diluído quando é adicionado aos grânulos. </li><li> Pipetar o factor de crescimento directamente sobre as esferas. Para FGF18 adicionar 0,5 mL de FGF18 recombinante reconstituído a 0,5 mg / ml em 0,1% de BSA em PBS. Coloque várias gotas de água em torno das bordas do recipiente para evitar que o líquido se evapore. </li><li> Incubar os grânulos durante 1 h à TA. Retirar as gotas de água do prato com uma pipeta Pasteur e colocar em gelo pronto para enxertia. </li><li> Se necessário (para contas transparente) a transferência de contas de 4-5 a 2% de fenol vermelho antes de enxertia para ajudar a visualizar-los. Enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. </li></ol> 2. Preparação de grânulos AG 1-X2 para enxertia <ol><li> Antes de usar derivatizar os grânulos com 0,2 N de ácido fórmico. <ol><li> Para fazer isso uso de uma espátula para transferir esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 mL de 0,2 N de ácido fórmico e lavar numa plataforma de agitação durante 1 h. </li><li> Em seguida, retire o ácido fórmico com uma pipeta P1000 e substituir por umml de água. Lavar durante 1 hora e repetir seis vezes para remover o restante ácido fórmico. </li><li> Remover o líquido remanescente com uma pipeta P1000 e armazenar as pérolas a 4 ° C. Nota: Não é necessária para remover a água residual todos nesta fase. </li></ol></li><li> Retirar uma pequena pastilha de grânulos de cerca de 5-10 ul de volume a partir do estoque usando uma pequena espátula numa placa de petri de 3 cm e adicionar 1 ml de DMSO (ou qualquer outro solvente, o fármaco é dissolvido em). Nota: Isso deve fornecer várias centenas de grânulos a partir da qual para selecionar aqueles do tamanho certo. </li><li> Em seguida, utilizar uma pipeta P2 definido para 2 ul para transferir os grânulos de cerca de 100 um de diâmetro para uma gota de 20 ul de solvente na outra placa de Petri de 3 cm. </li><li> Remover o solvente com uma pipeta de 20 uL e qualquer solvente residual com uma pipeta de 2 ul. Substituir com 20 ul de fármaco a ser aplicado. NOTA: Para consistência dissolver o medicamento a uma concentração de 100 uM em DMSO (ou que nunca é utilizado solvente),aliquota em 20 ul e armazenar a -80 ° C, tal como algumas pequenas moléculas inibidoras são instáveis ​​e é melhor para evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação. Se necessário, em seguida diluir a droga para a concentração desejada antes de embeber os grânulos. As concentrações eficazes podem necessitar de ser determinada empiricamente para cada fármaco. </li><li> Incubar durante 1 h. Proteger da luz como muitas destas moléculas são sensíveis à luz. </li><li> Antes de enxerto de transferência 4-5 grânulos com uma pipeta P2 definido para 2 mL em 20 mL de 2% de fenol vermelho dissolvidos em água. Execute esta etapa utilizando um microscópio de dissecação estéreo para visualizar as esferas. Remover um único talão com relojoeiros pinça fina ou um laço de arame e enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. Não deixe grânulos em 2% de fenol vermelho por mais de 15 min antes do uso, pois isso pode causar perda de atividade. </li></ol> 3. Preparação de tungstênio Needles <ol><li> Corte fino fio de tungstênio em 3-4 comprimentos cm. Inserir um pedaço de fio para dentro da extremidade deuma pipeta de Pasteur de vidro e derreter em um bico de Bunsen para fixar na posição. Prepare-se para 10 agulhas para garantir que não há peças de reposição se eles estiverem danificados durante a utilização. </li><li> Coloque a extremidade do fio em uma chama maçarico e mantê-lo lá até que o tungstênio brilha branco e na ponta é afiada (cerca de 2-3 min). Nota: Durante a utilização a agulha pode ser limpo e re-afiada no maçarico, conforme necessário. NOTA: Estes agulhas também pode ser usado para fazer ciclos de transferência de grânulos. Toque suavemente a agulha para o banco e que se curva para formar um laço. </li></ol> 4. Os embriões Preparando para Bead Enxertos <ol><li> Incubar os ovos com o brusco fim até que eles atinjam o estágio desejado (3-5 dias para a maioria das manipulações de bud membro). Usando uma pinça sem corte torneira no fim brusco para quebrar a casca e depois usar a pinça para remover a casca e expor o embrião. Certifique-se a membrana da casca do ovo também é removido. NOTA: 1-2 ml de PBS pode ser adicionado com uma pipeta de Pasteur para auxiliarisso se a membrana adere à gema. Pipeta suavemente o PBS sobre a superfície da gema, segure a membrana com a pinça, tomando cuidado para não danificar a gema, e puxe-o para longe do óvulo. </li><li> Remove-se a 5 ml de albumina de ovo com uma seringa de 10 ml e uma agulha 19 G. Leve somente tanto quanto necessário para assegurar o embrião não faz contato com a fita usada para selar o ovo como a remoção de volumes maiores podem reduzir as taxas de sobrevivência de embriões. </li><li> Para visualizar o embrião adicionar 5-6 gotas de tinta india artistas para 15 mL de PBS contendo 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml. Injectar 0,5-1 ml diretamente sob o embrião com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25 G. </li><li> Adicionar 2-3 ml de PBS com 1% de soro fetal de vitelo e 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml para dentro do ovo para assegurar o embrião não desidrata. Usando afiadas relojoeiros fórceps remover a membrana vitelina e abrir o amnion ao longo dos brotos de membros em desenvolvimento. Certifique-se de que o embrião não secar eSe necessário, adicione mais PBS / FCS. NOTA: Os brotos dos membros pode ser visto claramente como excrescências emparelhados sobre o flanco do embrião. Nessas etapas o embrião vai virar o lado direito é tal normalmente mais elevada. Como resultado, é normalmente mais fácil de enxertar miçangas nas extremidades direita e use os que foram deixados como controle contralateral. </li><li> Usar um fio de tungsténio afiada para fazer uma incisão no botão do membro em que o talão irá ser implantado. Evite cortar todo o caminho através do botão do membro, sempre que possível, embora em estágios mais jovens isso é difícil. NOTA: Em embriões mais velhos (HH estágio 22 e acima) é possível seleccionar regiões específicas do broto de membro para enxertia, mas em estágios mais jovens isto é mais difícil como o membro brotar em si é pequeno. É também importante recordar que o botão de membro irá crescer passado o grânulo enxertado assim, especialmente nas fases mais jovens, o rebordo irá permanecer no coto proximal. </li><li> Pegar um talão de qualquer fator de crescimento ou de drogas usando wa extra finotchmakers fórceps ou um laço feito de uma agulha de tungstênio. Se o talão foi embebido em DMSO ou vermelho de fenol, lavar em PBS antes de se aplicar ao embrião. Transferir o talão para o embrião com o ciclo de fórceps / fio. Em seguida, use o fio de tungstênio afiadas para inserir o talão na incisão. </li><li> Adicionar 1-2 ml de PBS / FCS para o ovo assegurar que o embrião é mantido hidratado mas evitar aplicar directamente sobre o próprio embrião como esta pode danificar os embriões e fazer com que o cordão de ser desalojado. Fecha-se o ovo com fita e voltar para a incubadora. </li></ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
<li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li>
<li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FLef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li>
<li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+signals+from+the+neural+tube%2C+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li>
<li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li>
<li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li>
<li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li>
<li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li>
<li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li>
<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
<li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li>
<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
<li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li>
<li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system%3A+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição. A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, geralmente liga bem...

Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos 1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de 2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento 4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento 6. Mais recentemente quimeras gerado entre hosts não marcados com enxertos de uma linha de galinha transgênica expressando GFP mostrou que a combinação de enxertia clássica e modificação genética pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento 7,8. A facilidade com que o embrião aviário pode ser manipulado fez-se um excelente modelo para o estudo do membrodesenvolvimento 9. Aplicação de fatores de crescimento específicos para membros em desenvolvimento in vivo tem sido fundamental na identificação de fatores que alteram membro padronização 10,11 e continua a fornecer insights sobre este processo 12. Essa abordagem também tem sido usado para estudar os fatores que regulam o desenvolvimento muscular e descobriu papéis para numerosos sinais como Wnts 13, BMPs 14 e 15 HGF. Recentemente, esta técnica tem sido utilizada para investigar os sinais que controlam a expressão do gene miogénica nos brotos dos membros e tem mostrado que as interacções entre o ácido retinóico e FGF18 pode controlar o tempo de expressão de 16 MyoD. Usando uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas que podem ser carregados em esferas e, em seguida, enxertadas diretamente em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento definidas dá a oportunidade de intervir em quase qualquer hora e região durante o desenvolvimento. Isto tem sido utilizado para investigate muitos processos, incluindo somite padronização 17,18, especificação neural 19, migração da crista neural 20 e 21 de extensão do eixo. Descrevemos aqui um método para o enxerto grânulos embebidos em ambos os factores de crescimento no desenvolvimento de inibidores ou membros de galinha. Este foi usado para determinar os efeitos destes sinais na miogénese, analisando a expressão do gene específico do músculo com a hibridização in situ. Nós descrevemos enxertos utilizando heparina grânulos embebidos, os quais são utilizados para factores de crescimento, ou grânulos AG 1-X2 para pequenas moléculas hidrófobas tais como o ácido retinóico ou pequenas moléculas inibidoras de vias específicas de sinalização. No entanto outros grânulos também estão disponíveis, que têm sido utilizadas para entregar ambas FGF Shh 22 e 23.

<table><tbody><tr><td>Contas de acrílico de heparina</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>As contas de acrílico-heparina usadas foram descontinuadas. No entanto, um produto de substituição está disponível, contas de agarose de heparina, cat no H6508. Estes são transparentes, então mais difíceis de trabalhar, mas podem ser manchados com vermelho de fenol da mesma maneira que as contas AG 1-X2,</td></tr> <tr><td>contas AG 1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Contas azuis Affi Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>Estas contas têm sido usadas com uma variedade de fatores de crescimento, incluindo Shh e FGFs e podem ser usadas para substituir contas de heparina</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Ressuspenda em PBS com 0/1% de BSA, prepare alíquotas de uso único de 0,5-1ul e armazene a -80 ° C. Os lotes e os fornecedores podem variar, portanto, diferentes concentrações devem ser testadas para determinar uma dose eficaz.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Sinalização</td> celular <td>9903</td><td>Faça um estoque de 20mM em DMSO e armazene alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteger da luz.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Ressuspenda em DMSO e armazene em alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteja da luz.</td></tr><tr><td>Tinta da China preta</td><td>Windsor e Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Embora alternativas a este produto estejam disponíveis, deve-se tomar cuidado, pois algumas tintas são tóxicas para embriões</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio, 0,1 mm de diâmetro. 99,95%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Diluir 100X em PBS / tinta e PBS / FCS</td></tr></tbody></table>

alongamento das beads em desenvolvimento de frango limbs embrião para identificar caminhos da transdução de sinal que afeta gene expression

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração. Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18. Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.

Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF18 MyoD (...

Ao enxertar grânulos embebidos em fatores de crescimento ou inibidores específicos de vias de sinalização em embriões em desenvolvimento, é possível testar diretamente seus efeitos in vivo. Neste protocolo, grânulos são enxertados no broto do membro para determinar os efeitos dessas moléculas na expressão gênica e na transdução de sinal.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como determinar os efeitos de fatores de crescimento e inibidores na expressão gênica de membros em desenvolvimento de embriões de galinha. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia do desenvolvimento, como a maneira pela qual moléculas sinalizadoras influenciam o crescimento e a diferenciação de células in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método para testar diretamente esses fatores no embrião.Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento dos membros, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como tecido neural, somitos ou gastrulação. O procedimento será demonstrado por Rebeea Mohammed, aluna de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, transfira um mililitro das esferas da solução estoque original para um tubo novo.Deixe as esferas sedimentarem, remova o líquido e substitua por um mililitro de PBS. Repita este passo cinco vezes e armazene as esferas lavadas a quatro graus Celsius, como uma suspensão em PBS. Selecione as esferas para enxerto, removendo-as da solução estoque lavada usando uma pipeta de 20 microlitros e colocando-as em um mililitro de PBS.Usando um estereoscópio, escolha esferas com diâmetro de aproximadamente 100 micrômetros. Transfira as esferas selecionadas em dois microlitros de líquido para um novo recipiente de Petri contendo uma gota de 20 mililitros de PBS. Em seguida, remova o PBS das esferas. Primeiro, com uma pipeta de 20 microlitros, e depois, remova o líquido residual por ação capilar usando uma pinça fina de relojoeiro.É importante remover o máximo de líquido possível para que o fator de crescimento não seja diluído quando adicionado às esferas. Pipete o fator de crescimento diretamente sobre as esferas. Para FGF18, adicione 0,5 microlitros de FGF18 recombinante, reconstituído a 0,5 miligramas por mililitro em PBS com 0,1 por cento de BSA.Em seguida, coloque várias gotas de água ao redor das bordas da placa para evitar a evaporação do líquido. Quando estiver pronto, incube as esferas por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, remova as gotas de água da placa com uma pipeta de Pasteur e coloque a placa sobre gelo.Derivatize as esferas, primeiro usando uma espátula para transferir as esferas para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de ácido fórmico 0,2 normal e incube as esferas no ácido em uma plataforma agitadora durante uma hora. Depois, deixe as esferas sedimentarem, remova o ácido fórmico e substitua por um mililitro de água.Lave as esferas durante uma hora na plataforma agitadora e repita a lavagem seis vezes para remover todo o ácido fórmico residual. Após a última lavagem, remova o líquido remanescente e armazene as esferas a quatro graus Celsius. Use uma espátula para retirar uma pequena porção de esferas com volume aproximado de cinco a dez microlitros do estoque e coloque as esferas em uma placa de Petri de 30 mililitros.Em seguida, adicione um mililitro de DMSO. Depois, utilize uma pipeta P2 ajustada para dois micro-litros para transferir esferas de aproximadamente 100 mícrons de diâmetro para uma gota de 20 micro-litros de solvente em outro recipiente de Petri de 30 mililitros. Remova a maior parte do solvente com uma pipeta de 20 micro-litros e qualquer solvente residual com uma pipeta de dois micro-litros.Em seguida, cubra as microesferas com 20 microlitros do fármaco a ser aplicado, dissolvido em DMSO. Incube as microesferas na solução de fármaco por uma hora. Proteja as microesferas da luz, pois muitas moléculas de fármacos são sensíveis à luz.Para ajudar a visualizar as esferas, transfira quatro a cinco esferas em dois microlitros de líquido para 20 microlitros de vermelho de fenol a dois por cento dissolvido em água. Remova uma única esfera com pinça fina de relojoeiro e lave a esfera em PBS. Não deixe as esferas na solução de vermelho de fenol por mais de 15 minutos antes de lavá-las, pois isso pode causar perda de atividade.Corte o fio fino de tungstênio em comprimentos de três a quatro centímetros. Em seguida, insira um pedaço do fio na extremidade de uma pipeta de vidro de Pasteur e derreta-o em um bico de Bunsen para fixá-lo no lugar. Prepare até 10 agulhas para garantir que haja peças sobressalentes caso sejam danificadas. A seguir, coloque a extremidade do fio na chama de um maçarico e mantenha-a lá até que o tungstênio brilhe em branco e a ponta fique afiada.Isso leva cerca de dois a três minutos. Adicione de cinco a seis gotas de nanquim artístico a 15 mililitros de PBS contendo 100 unidades de penicilina e 0,1 miligramas de estreptomicina por mililitro. Para preparar os embriões de galinha, incube os ovos com a extremidade romba voltada para cima até atingirem o estágio desejado para a maioria das manipulações do botão de membro, que normalmente é de três a cinco dias.Quando o ponto temporal desejado for alcançado, use pin&ccedil;as rombas para bater na extremidade romba do ovo e quebrar a casca. Em seguida, use as pin&ccedil;as para remover a casca e expor o embri&atilde;o. Certifique-se de que a membrana celular do ovo tamb&eacute;m seja removida.Para visualizar o embrião, injete PBS suplementado com algumas gotas de nanquim artístico, sob o embrião, utilizando uma seringa de um mililitro e uma agulha de 21 gauge. A membrana vitelina que recobre o embrião pode então ser removida com pinça fina. Em seguida, adicione dois a três mililitros de PBS suplementado com um por cento de soro de bezerro fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina e 0,1 miligramas por mililitro de estreptomicina dentro do ovo, para garantir que o embrião não desidrate.Usando pin&ccedil;as de relojoeiro afiadas, abra o &acirc;mnio sobre os membros em desenvolvimento. Nesses est&aacute;gios, o embri&atilde;o geralmente gira, de modo que o lado direito fique voltado para cima. Certifique-se de que o embri&atilde;o n&atilde;o seque, adicionando mais solu&ccedil;&atilde;o de PBS suplementado quando necess&aacute;rio.O âmnio que envolve o embrião pode ser aberto usando uma agulha fina de tungstênio para revelar o membro em desenvolvimento. Em seguida, utilize o fio de tungstênio afiado para fazer uma incisão no botão do membro, onde a esfera será implantada. Evite cortar completamente através do botão do membro, sempre que possível.Embora em estágios mais jovens isso seja difícil. Pegue um grânulo revestido com o fator de crescimento ou com o fármaco, utilizando pinças finíssimas de relojoeiro. Se o grânulo tiver sido imerso em DMSO ou em vermelho de fenol, certifique-se de que ele seja lavado com PBS antes de aplicá-lo ao embrião.Transfira a esfera para o embrião usando a pin&ccedil;a e, em seguida, utilize o fio de tungst&ecirc;nio afiado para inserir a esfera no local da incis&atilde;o. Adicione um a dois mililitros adicionais da solu&ccedil;&atilde;o de PBS suplementado ao ovo para garantir que o embri&atilde;o permane&ccedil;a hidratado. Evite aplicar a solu&ccedil;&atilde;o diretamente sobre o pr&oacute;prio embri&atilde;o, pois isso pode danific&aacute;-lo e causar o deslocamento da esfera.Em seguida, utilize uma seringa de dez mililitros, equipada com uma agulha de 19 gauge, para remover somente a quantidade de albúmen necessária para garantir que o embrião não entre em contato com a fita usada para selar o ovo. Certifique-se de que a agulha não danifique a gema, deslizando-a pela parte interna da casca. Por fim, feche o ovo com fita adesiva e devolva-o à incubadora.Para confirmar que o FGF18 é capaz de agir por meio da MEK para fosforilar a ERK, os embriões foram coletados uma hora após o enxerto do fragmento e imunomarcados para detectar a presença de ERK fosforilada, que pode ser observada ao redor do fragmento enxertado na imagem à direita. No estágio HH 21, o MyoD não é expresso nos mioblastos em desenvolvimento dos membros. Embora a marcação possa ser observada no miótomo dos somitos em desenvolvimento.Seis horas após o implante de uma microesfera contendo FGF18, pode-se observar a indução de MyoD em mioblastos próximos à microesfera, enquanto não há expressão no membro contralateral. Essa expressão pode ser inibida pelo co-implante de uma microesfera revestida com um inibidor de MEK, como o U0126.Da mesma forma, o enxerto de uma esfera com U0126 no Estágio HH 21 reduz a expressão endógena de MyoD após 24 horas, em comparação com o membro contralateral não tratado. Nos primórdios dos membros, no Estágio HH 19, o FGF18 não induz MyoD. No entanto, o coenxerto de esferas impregnadas com FGF18 e um antagonista do ácido retinóico pode superar isso, e MyoD ectópico é detectado.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro minutos, se for executada corretamente. O desenvolvimento desta técnica permitiu que pesquisadores da área de biologia do desenvolvimento explorassem a sinalização de fatores de crescimento no desenvolvimento embrionário. Ao tentar aplicar esta técnica, é importante lembrar-se de não deixar o embrião secar.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como enxertar microesferas em embriões em desenvolvimento para determinar como a sinalização de fatores de crescimento afeta o desenvolvimento.

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma variedade de fatores de crescimento e proteínas interagem para induzir as células a assumir os destinos diferentes de células durante o desenvolvimento. Aqui mostramos o uso de um ovo na preparação para enfrentar as possíveis interações entre diferentes proteínas no desenvolvimento, colocando contas em e2.5 embriões de galinha.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

Indução neural é o primeiro passo na formação do cérebro. É um mecanismo pelo qual o nó de Hensen (organizador), instrui tecido adjacente a adotar um destino neural, ou seja, dar origem ao sistema nervoso. Este vídeo demonstra um ensaio para a indução neural no embrião de galinha.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no...

Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

Fonte: Delalande, J., et.al. Marcação dupla de células da crista neural e vasos sanguíneos em embriões de galinha usando enxerto de tubo neuralChick GFP e injeção de corante de carbocianina DiI. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o transplante de um tubo neural de doador marcado com GFP de um embrião de galinha transgênico compatível com o estágio para um embrião receptor no nível de somitos de um a sete, seguido de marcação vascular usando um corante fluorescente lipofílico. A abordagem...

Visualização de redes neurais e vasculares em um embrião de galinha

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Aqui relatamos rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos usando enxerto de intraespécie do tubo neuralGFP combinado com injeção intra-vascular diI. Esta técnica experimental nos permite visualizar e estudar simultaneamente o desenvolvimento do sistema nervoso derivado do NCC (entérico) e do sistema vascular, durante a organogênese.

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento. O implante de contas é uma técnica valiosa de manipulação de tecidos que pode ser usada para interrogar os mecanismos de desenvolvimento, introduzindo alterações nos ambientes celulares locais. Este protocolo descreve como realizar a implantação de microesferas no embrião de peixe-zebra.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

Aprenda a técnica de enxerto de beads em embriões de galinha para estudar fatores de crescimento e inibidores na expressão gênica durante o desenvolvimento de membros. Este método permite testar diretamente moléculas sinalizadoras in vivo.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression (Vídeo) | JoVE Journal

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Explorar mais vídeos