Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é medir a ligação e a internalização da gripe. Um vírus se manifesta em 5 49 células epiteliais pulmonares. Isso é feito pela primeira ligação a frio por um vírus da gripe a 5 49 células, o que permite a ligação, mas impede a absorção de partículas virais.

Em seguida, o vírus pode se internalizar mudando a temperatura para 37 graus Celsius. Em seguida, uma etapa de bloqueio na qual o strp Aden não rotulado está ligado à superfície da célula. Os vírus anexados são realizados para discriminar entre partículas virais anexadas e internalizadas.

Finalmente, o vírus biotinilado associado à célula é incubado com estreptavidina marcada com CY três e a citometria de fluxo é usada para detectar os vírus corados. Por fim, a quantidade relativa de vírus anexados e internalizados é calculada. Embora esse método possa fornecer informações sobre a quantidade relativa de influenza, um vírus que se liga e se internaliza em 5 0 9 células.

Também pode ser aplicado a outros sistemas usando diferentes linhagens celulares ou outros vírus Depois de gerar o vírus biotinilado e determinar as quantidades necessárias do vírus marcado estreptococo din e SI três estreptococos marcados de acordo com o protocolo de texto, prepare quatro tubos de poços profundos, cada um contendo 200.000, A 5 49 células rotuladas como zero minutos. Zero minutos, mais STV, 30 minutos e 30 minutos mais STV. Em seguida, gire os tubos.

Remova o sobrenadante e use 200 microlitros de PBS para ressuspender os pellets. Em seguida, depois de girar os tubos novamente, use 200 microlitros de um meio de crescimento padrão 5 49 para ressuspender as células, incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos após a incubação, centrifugar as amostras e ressuspender os pellets em 200 microlitros de PBS Depois de repetir a lavagem mais uma vez, resfrie os tubos no gelo por 10 minutos. Quando os tubos esfriarem, gire novamente e use 100 microlitros de vírus biotinilado diluído em PBS de infecção para ressuspender os pellets após incubação em gelo por uma hora, repita a centrifugação e lave com PBS duas vezes, processando as seguintes amostras em paralelo tanto quanto possível para as amostras de zero minuto.

Após a centrifugação, use 100 microlitros de aldeído paraforme a 3,7% ou PFA para ressuspender o pellet celular. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos antes de girar e usar PBS para lavar as células duas vezes após a fixação. Armazene a quatro graus Celsius até que todas as amostras tenham sido processadas.

Para tratar as amostras de zero minuto mais STV, gire os tubos, remova o sobrenadante e use 15 microlitros de STV 2% BSA e 0,1% de azi de sódio em PBS para ressuspender a incubação do pellet celular no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue e use PBS para lavar as células duas vezes após a fixação com PFA, como acabamos de demonstrar nas amostras a quatro graus Celsius para as amostras de 30 minutos. Depois de girar e remover o supernat, use PBS 2% BSA para dissolver as amostras.

Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos antes de lavar com PBS e fixar com PFA. Em seguida, armazene as amostras a quatro graus Celsius por 30 minutos mais amostras STV. Após a peletização, suspendemos as amostras em 200 microlitros de PBS 2%BSA, após uma incubação a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Gire e ressuspenda as células em 50 microlitros de STV 2% BSA 0,1% Sodium azi em PBS incube em ICE por 30 minutos antes de lavar e fixar. Em seguida, após permeável e coloração de todas as amostras com STV SI três, seguindo os detalhes do protocolo de texto, armazenou as amostras a quatro graus Celsius. Por fim, analise as amostras por citometria de fluxo.

Determinar a percentagem de células positivas CY três em cada amostra. Calcule a porcentagem de vírus anexado e a quantidade relativa de vírus internalizado. De acordo com o protocolo de texto, conforme mostrado aqui na amostra de zero minutos, o vírus ated está ligado a frio às células-alvo, conforme visualizado pela coloração St.V.SI três.

Quando o STV é aplicado como uma etapa de bloqueio, o vírus na superfície celular não pode mais ser detectado pela coloração S St.V.SI três, reduzindo fortemente o sinal. Quando a temperatura é elevada para 37 graus Celsius, o vírus ligado é absorvido pelas células. O vírus internalizado não é sensível ao bloqueio com STV não rotulado, resultando em uma queda menos dramática na intensidade do sinal nos 30 minutos mais amostras de STV mostradas.

Aqui estão as porcentagens de três células SI positivas para todas as condições experimentais descritas neste vídeo. As células infectadas simuladas fornecem a intensidade do sinal de fundo para o experimento e atuam como um controle negativo para a ligação do vírus. Outra neuraminidase de controle revoga fortemente a ligação do IAV em 90% em comparação com as células não tratadas.

O azi de sódio, que esgota um TP, inibindo assim a endocitose, inibiu a internalização das partículas virais durante e após a infecção, como mostrado aqui após o tratamento com azi de sódio As células incubadas por 30 minutos a 37 graus Celsius mostraram uma queda dramática na internalização em comparação com as células não tratadas incubadas nas mesmas condições. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a ligação e a internalização da gripe, um vírus em 5 0 9 células. Este protocolo permite uma leitura conveniente por citometria de fluxo e pode ser facilmente adaptado a outros ambientes experimentais.