Name: Membrane Transport processos analisados por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a analisar proteínas de membrana em nível molecular usando chips de nanoporo altamente paralelos. Este método permite estudar dinâmica de transporte e condutividade de canais individuais com resolução de proteína única.

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Agradecemos a Barbara Windschiegl por sua ajuda no estabelecimento de SOPs; Dennis Remme por seu trabalho no software NanoCalcFX e Alina Kollmannsperger, Markus Braner e Milan Gerovac por sugestões úteis sobre o manuscrito. A Cooperação de Projetos Alemão-Israelense (DIP) fornecida pela DFG e pelo Ministério Federal de Educação e Pesquisa à RT, bem como o Ministério Federal de Economia e Tecnologia (Projeto ZIM R&D) à RT e à Nanospot GmbH apoiaram este trabalho.

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A técnica apresentada aqui permite uma análise altamente paralela de transporte de proteínas de membrana. sistemas de proteína da membrana reconstituídas pode ser directamente aplicado ao biochip, fazer a adaptação de cada teoricamente transportador de membrana ou canalizar possível. análise de Transporte só é limitado pelo estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescente, quer através de mudança direta de fluorescência (translocação de fluoróforos ou substratos marcados com fluorescência) ou a mudança indireta ...

A análise das proteínas da membrana tornou-se de crescente interesse para a pesquisa básica e farmacêutica nos últimos 20 anos. O desenvolvimento de novos medicamentos depende da identificação e caracterização de novos alvos detalhada, actualmente ser um dos factores limitantes. O facto de que cerca de 60% ​​de todos os alvos de drogas são proteínas de membrana 1, faz com que o desenvolvimento de técnicas para elucidar a sua função mais importante. No passado, as técnicas para o estudo de canais electrogénico e transportadores têm sido desenvolvidos na multiplicidade 2-4. substratos não eletrogênica em contrário apresentar uma tarefa mais desafiadora. Eles são no entanto, de especial interesse como alvos de drogas de primeira linha, uma vez que controlam o fluxo de solutos e nutrientes através da membrana celular e como função de receptores principais em cascatas de sinalização 5. Um esforço considerável foi colocado no desenvolvimento de techniques para estudar a função das proteínas transportadoras de membrana 6, 7. Os sistemas que utilizam membranas sólidas apoiado surgiram como ferramentas mais promissoras neste campo 8-10, incluindo bicamadas lipídicas suportados sólidos, bicamadas tethered 11, 12, membranas lipídicas microblack 13, 14 e nativas vesícula matrizes 15, 16 para citar alguns. Alguns deles estão ainda disponíveis como instalações comerciais 17, 18. Alguns exemplos foram publicados combinando a capacidade de estudar as proteínas de membrana individuais de uma maneira altamente paralela 14, 19, um pré-requisito para as aplicações de rastreio. No entanto, estes métodos raramente ponte de pesquisa básica ao ambiente industrial. As dificuldades muitas vezes encontram-se na capacidade do sistema para ser automatizável, a produção de custo elevado e / ou preparação laboriosa. Uma abordagem overcoming todos os obstáculos acima mencionados é o objetivo final. A técnica aqui apresentada foi desenvolvido para o estudo de canais de membrana e transportadores in vitro num ambiente controlado no nível de proteína única 20-22. Reconstituição de proteínas de membrana purificadas em LUV é muito mais estabelecida do que as abordagens comparáveis ​​para GUVs 23 - 26 ou lipídios preto membranas 27. Eles podem ser directamente aplicadas à superfície do chip, em que a formação de duas camadas tem lugar através de um processo de auto-montagem. O desenho com fundo de vidro nanoporoso do chip (Fig. 1) permite a microscopia de ar, que permite a automatização simples do sistema. Em combinação com uma platina motorizada múltiplos chips podem ser medidos ao mesmo tempo, com cada campo de visão contendo milhares de cavidades seladas para análise. Figura 1. Projeto de biochips nanopore multiplexados. A) A silício sobre isolante (SOI) wafer é estruturado por ataque reativa-ion. Cerca de 1.150 fichas individuais são fabricados a partir de cada wafer com propriedades idênticas e qualidade. B) Cada chip inclui 250.000 microcavidades individuais com aberturas nano. Barra de escala:. 200 mm C) Cada cavidade é endereçável através de fluorescência multi-espectral de leitura. Um não transparentes superiores blocos da camada os sinais fluorescentes a partir do reservatório tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertido. D) microscopia de força atómica (AFM), imagiologia revela uniformemente dispostas aberturas dos poros e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício de 3,6 nm (n = 40) ideal para a fusão das vesículas. Barra de escala:. 5 m E) mic eletrônica de varreduraroscopy imagem (SEM) mostra uma secção transversal através da nano-poros que permite o acesso às cavidades femtoliter dentro do chip de silício. Este valor foi reutilizado com permissão de 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Toda a análise dos dados é feita usando freeware para garantir o acesso irrestrito para os usuários finais. séries temporais são analisados ​​utilizando software de processamento de imagem gratuito e um processamento em lote que permite o software de análise personalizada curva de construção e correlação direta de grandes conjuntos de dados com múltiplos canais fluorescentes e milhares de curvas. A proteína modelo utilizado neste protocolo é o canal mechanosensitive de proteína grande condutância (MsCl) canal derivado de E. coli. Ele funciona como uma válvula para libertar choque osmótico na natureza, mas foi modificado de tal maneira que racionalmente concebidos Synthetic funcionalidades pode ser covalentemente ligado ao lado de canais de constrição. Via-carga de repulsão do activador ligado covalentemente (MTSET) do canal é accionado para abrir, a criação de um nano-válvula. Pequenas moléculas como os íons, água, pequenas proteínas, mas também pequenas fluoróforos pode permear através do canal. Aqui, a proteína é utilizada como um modelo para demonstrar a capacidade do sistema para detectar a translocação mediada pela proteína.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimetilamônio)etil] metantiossulfonato</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hidrolisado por água. Conservar como alíquota seca a -80 °C. Utilizar imediatamente (30 minutos) após solubilização em tampão.</td></tr><tr><td>Seringa estanque a gás de 1 ml</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Balão redondo de 10 ml</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm grânulos de vidro</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extensão Luer-Lock de 30 cm</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 O adsorvente</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>precisa ser ativado antes do primeiro uso</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>armazenar escuro a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Produtos químicos de clorofórmio de grau</td><td>reagente VWR</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>armazenar escuro a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Seringa descartável</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Seringa descartável Injekt-F</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck clipes</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilcolina, 20% (Soja)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>armazenar sob gás inerte a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5% a.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mainz/Alemanha)</td><td></td> <td>disponível a pedido</td></tr><tr><td>Membrana Nucleopore Track-Etch 0.4 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td> <td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>loja escura a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster/Alemanha)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>loja escura a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Filtração por seringa de rotilabo, não estéril, tamanho de poro 0,22 &micro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>material de coluna para cromatografia de exclusão de tamanho</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>agente de cura para fixação de cavacos no suporte de vidro de cobertura</td></tr><tr><td>pegajoso-Slide 80828</td> câmara multi-poço <td>ibidi</td><td>80828</td> de 8 <td>poços para montagem em lâminas de vidro (porta-cavacos)</td></tr> <tr><td>Torneira de três vias azul</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; m filtro de membrana de nitrato de celulose</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 banho-maria</td><td>B&uuml; chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; Espectrotômetro</td> de Fluorescência Eclipse chi <td></td><td></td></tr><tr><td>Cary&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extrusora</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de membrana&nbsp;</td>Microscópio de rastreamento de nanopartículas <td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanosight Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>NyONE Synentec</td><td></td><td>disponível a pedido</td></tr><tr><td>Controle de bomba</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator banho Sonorex RK100H</td><td>Brandelin</td><td>31200001107477</td><td></td>eletrônico</tr><tr><td>Bomba de vácuo RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Software de <td>processamento de imagem</td><td>científica http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>de código aberto</td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ Software</td> de análise/avaliação de dados <td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ freeware</td><td></td> <td>para conjuntos de dados cinéticos de transporte massivo</td></tr><tr><td>Software analítico NTA 2.3 Software de</td> aquisição e análise de dados <td>Nanosight</td><td></td><td>para rastreamento de nanopartículas software do controle</td></tr><tr><td>da temperatura de Nanosight</td><td></td><td></td> das comunicações da temperatura de NTA 2,3 do microscópio <td>para o microscópio de seguimento do nanoparticle</td></tr></tbody></table>

membrane transport processos analisados ​​por um sistema nanopore chip altamente paralelos na resolução protein individual

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

transporte de proteínas de membrana no nível de proteína único ainda escapa análise detalhada, se o substrato translocado é não-electrogenic. Esforços consideráveis ​​têm sido feitas neste campo, mas as técnicas que permitem a análise automatizada de transporte de alto rendimento, em combinação com técnicas de bicamada lipídica livre de solvente necessária para a análise dos transportadores de membrana são raras. Esta classe de transportadores, porém, é crucial na homeostase celular e, portanto, um alvo chave no desenvolvimento de medicamentos e metodologias para ganhar novos conhecimentos precisava desesperadamente. O manuscrito apresentado aqui descreve a criação e gestão de um romance biochip para a análise dos processos de transporte de proteínas mediada membrana em resolução transporter única. O biochip é composto de microcavidades fechados por nanoporos, que é altamente paralelo na sua concepção e pode ser produzido em quantidade e de qualidade industrial. lipossomas proteína-abrigando pode ser directamente aplicada aa superfície do chip formar bicamadas lipídicas-medindo poros auto-montadas usando SSM-técnicas (sólido suportado membranas lipídicas). Pore-abrangendo partes da membrana são independentes, proporcionando a interface para a translocação de substrato para dentro ou para fora do espaço da cavidade, o que pode ser seguido por leitura fluorescente multi-espectral em tempo real. O estabelecimento de procedimentos operacionais padronizados (POPs) permite a criação simples de bicamadas lipídicas-abrigando proteína na superfície do chip de proteína de membrana praticamente todos os que podem ser reconstituídos funcionalmente. O único pré-requisito é o estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescência para substratos de transporte não eletrogênica. aplicações de alto teor de triagem são realizáveis ​​pelo uso de automatizados microscópios fluorescentes invertidos gravação múltiplos chips em paralelo. Grandes conjuntos de dados podem ser analisados ​​usando o software de análise de design personalizado disponível gratuitamente. Três cores de multi espectral fluorescenteleia-out, além disso, permite a discriminação de dados imparcial em diferentes classes de eventos, eliminando falsos resultados positivos. A tecnologia de chip é atualmente baseado em SiO2 superfícies, mas ainda funcionalização usando superfícies de fichas revestidas de ouro também é possível.

membranas que atravessa a poro pode ser facilmente criado na superfície do chip nanoestruturada de uma maneira auto-montadas. No entanto, o processo subjacente ainda é delicado e influenciado por muitos parâmetros como o tamanho de lipossomas, monodispersity da população de lipossomas, lamelaridade, lipídios e as propriedades do sal de concentração e de superfície química. A maioria destes parâmetros foram cuidadosamente caracterizado e padronizado no protocolo acima. Outros parâmetros n...

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

O objetivo geral dessa plataforma baseada em chip de nanoestrutura é analisar a função de proteínas de membrana no nível molecular individual de maneira altamente paralela. Por meio de sua capacidade de detectar proteínas individuais, obtêm-se novos conhecimentos sobre o transporte e o fluxo em membranas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das proteínas de membrana, como a condutividade ou o comportamento de transporte de canais ou transportadores individuais, especialmente aqueles que transportam cargas não eletrogênicas.A principal vantagem desta técnica é seu alto grau de paralelismo derivado do design do chip com nanoestrutura, que possui centenas de milhares de nanoporos e a leitura fluorescente dos eventos de transporte. As implicações desta técnica estendem-se à criação dos melhores ensaios para bibliotecas eficazes de proteínas de membrana. Porque a plataforma baseada em chip permite o registro altamente paralelo e automático de transportes.Em geral, indivíduos novos neste método aprenderão rapidamente como manipular a técnica apresentada. O foco sempre foi criar um ensaio fácil de usar, para que todos os interessados possam adotá-lo. Este ensaio de transporte de membrana utiliza uma pastilha de silício sobre isolante, fabricada por meio de ataque iônico reativo.Aproximadamente 1.000 chips de ensaio são fabricados a partir de cada pastilha. Cada chip contém 250.000 microcavidades. Essas cavidades são seladas por bicamadas lipídicas contendo as proteínas transportadoras de interesse.A membrana constitui a interface do sensor. Inicialmente, os materiais fluorescentes estão contidos em um lado da bicamada lipídica, correspondendo ao interior dos lipossomos dos quais são compostos. Cada cavidade é acessível por meio de uma leitura fluorescente multiespectral.Uma camada superior opaca bloqueia os sinais fluorescentes do reservatório de tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertidos. Utilizando microscopia de força atômica, as aberturas dos poros uniformemente dispostas e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício foram medidas em 3,6 nanômetros, ideal para fusão de vesículas. A microscopia eletrônica de varredura mostra uma seção transversal através de um nanoporo, que acessa as cavidades de fentolitros no interior do chip de silício.Este vídeo mostra a preparação dos proteolipossomos, a preparação das lâminas para o ensaio e a execução básica do ensaio. Conecte um frasco de fundo redondo lavado com etanol a um evaporador rotativo. Seque o filme lipídico por 40 minutos a 300 milibares, temperatura do banho de água de 30 graus Celsius e velocidade máxima de rotação para formar um filme lipídico homogêneo na parede de vidro do frasco.Em seguida, utilizando uma bomba de vácuo alto, seque o filme lipídico por mais 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, adicione cinco mililitros de tampão e oito esferas de vidro lavadas com etanol ao frasco para formar vesículas multilamelares. Conecte o frasco ao evaporador rotativo e gire sem vácuo a 50 graus Celsius na velocidade máxima.Após 45 minutos, a solução apresentará uma aparência esbranquiçada, sem filme lipídico residual nas paredes. Transfira o frasco sob uma atmosfera de gás inerte para um banho ultrassônico e sonique por quatro minutos à temperatura ambiente. A sonicação rompe os lipossomos, tornando-os unilamelares.Agora, divida a solução de LUV em alíquotas de um mililitro e realize cinco ciclos de congelamento-descongelamento usando nitrogênio líquido e um banho de água a 40 graus Celsius. Isso leva à ruptura, rearranjo e crescimento dos lipossomos. No último passo de congelamento, armazene todas as amostras a menos 80 graus Celsius.Antes de reconstituir uma alíquota de LUV, extrude os lipossomos passando a alíquota através de uma membrana de filtro de policarbonato de 400 nanômetros 17 vezes, utilizando um extrusor mini. Em seguida, desestabilize os LUVs adicionando Triton X-100 4% para obter 0,25% na solução. Incube a mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.Agora, misture uma parte de MscL purificado e modificado em 20 partes de lipossomos saturados com detergente e continue a incubação por 30 minutos. Após a incubação, retire uma alíquota de 100 microlitros e adicione um volume igual de calcine a 30 milimolares. Incube esta mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.Agora, remova o detergente das amostras tratadas e não tratadas com calcine. Adicione bioesferas úmidas em tampão Tris a cada uma e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa rotatória.Para começar, misture a base do elastômero com o agente de cura e desseque completamente a mistura para que fique isenta de umidade. O adesivo deve ser usado dentro de 30 minutos após ficar pronto. Enquanto isso, tomando precauções, limpe uma lamínula usando cinco mililitros de clorofórmio, aplicados com uma seringa de vidro, e deixe a lamínula secar.Agora, utilizando uma pipeta de 10 microlitros, deposite o adesivo preparado sobre o lamínula. Em seguida, remova cuidadosamente um chip da placa de wafer usando pinças finas. Com o lado revestido do chip voltado para cima, posicione-o sobre o adesivo e pressione suavemente contra a lâmina para distribuir uniformemente o adesivo.Não permita que bolhas de ar fiquem presas abaixo, nem que adesivo ultrapasse para cima no chip. Além disso, monte o conjunto de forma que se encaixe no suporte de oito câmaras. Agora, desseque os conjuntos por duas horas a 65 graus Celsius em uma estufa.Posteriormente, remova a camada protetora dos chips com algumas lavagens com solvente a 54 graus Celsius. Primeiro, coloque os chips montados em um porta-lâminas. Em seguida, incube-os em três banhos de solvente por 10 minutos cada.Isopropanol, acetona e isopropanol. Em seguida, lave cuidadosa e completamente os chips com água ultrapura. Conclua o processo secando os chips sob um fluxo suave de gás nitrogênio.Agora, prepare um lâmina adesiva de oito poços e coloque-a virada ao contrário sobre a bancada. Em seguida, levante cuidadosamente as lamínulas e pressione-as sobre a lâmina adesiva com os chips voltados para os poços. Deixe o conjunto repousar por alguns minutos antes de prosseguir.Antes de prosseguir com o ensaio de translocação, lave cuidadosamente a montagem do chip, conforme descrito no protocolo textual, finalizando com uma imersão em tampão Tris. Em seguida, substitua a solução do banho por tampão Tris DOPEd, contendo cloreto de cálcio cinco milimolar e corante Oy647 um micromolar. A seguir, adicione proteolipossomos à câmara do chip para uma concentração final de um miligrama por mililitro e aguarde uma hora.Após uma hora, enxágue as lâminas quatro vezes com 400 microlitros de tampão Tris livre de cálcio. Agora, adicione o corante controlado a cada poço até cinco micromolar e prossiga com o ensaio. Em seguida, acople o suporte da lâmina ao microscópio de epifluorescência e foque na borda da lâmina de nanoporos para localizar as microcavidades.Uma vez que as microcavidades estejam em foco, varra a matriz de nanoporos em busca de uma região que exiba a maior proporção de teto. Detalhes são fornecidos no protocolo descrito no texto. Os lipossomos foram preparados e verificados quanto à sua distribuição de tamanho e dispersão.Os lipossomos preparados eram maiores que o diâmetro dos poros para o ensaio, o que é essencial. Lipossomos monodispersos também são desejáveis. Antes do experimento, a proteína MscL modificada na preparação dos lipossomos foi verificada utilizando um ensaio de dessensibilização fluorescente.A proporção de lipossomos que continham MscL modificada ativa foi adequada para prosseguir com o experimento de translocação. No biochip, observou-se a translocação de um soluto marcado com fluorescência através do canal MscL modificado. O modulador químio, MTSET, foi utilizado para abrir os canais MscL modificados por meio de repulsão eletrostática.A diminuição subsequente da fluorescência dentro do espaço da cavidade foi monitorada. Esse processo revelou-se altamente reprodutível, com eventos de efluxo muito consistentes. As curvas de efluxo resultantes agruparam-se em duas populações distintas, correspondentes a eventos de translocação por canal único ou por múltiplos canais.O sistema foi capaz de acompanhar até três corantes com fluorescência distinta mediante análise em tempo real. Isso facilita a discriminação precisa de resultados positivos, eventos de efluxo monoexponenciais, cinéticas complexas, intrusões lipídicas e rupturas de membrana. Uma vez dominada, esta técnica pode ser executada em etapas consecutivas, nomeadamente preparação do chip, preparação da amostra, aquisição de imagens e análise, tornando todo o protocolo modular.

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