Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

O objetivo geral dessa plataforma baseada em chip de nanoestrutura é analisar a função de proteínas de membrana no nível molecular individual de maneira altamente paralela. Por meio de sua capacidade de detectar proteínas individuais, obtêm-se novos conhecimentos sobre o transporte e o fluxo em membranas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das proteínas de membrana, como a condutividade ou o comportamento de transporte de canais ou transportadores individuais, especialmente aqueles que transportam cargas não eletrogênicas.

A principal vantagem desta técnica é seu alto grau de paralelismo derivado do design do chip com nanoestrutura, que possui centenas de milhares de nanoporos e a leitura fluorescente dos eventos de transporte. As implicações desta técnica estendem-se à criação dos melhores ensaios para bibliotecas eficazes de proteínas de membrana. Porque a plataforma baseada em chip permite o registro altamente paralelo e automático de transportes.

Em geral, indivíduos novos neste método aprenderão rapidamente como manipular a técnica apresentada. O foco sempre foi criar um ensaio fácil de usar, para que todos os interessados possam adotá-lo. Este ensaio de transporte de membrana utiliza uma pastilha de silício sobre isolante, fabricada por meio de ataque iônico reativo.

Aproximadamente 1.000 chips de ensaio são fabricados a partir de cada pastilha. Cada chip contém 250.000 microcavidades. Essas cavidades são seladas por bicamadas lipídicas contendo as proteínas transportadoras de interesse.

A membrana constitui a interface do sensor. Inicialmente, os materiais fluorescentes estão contidos em um lado da bicamada lipídica, correspondendo ao interior dos lipossomos dos quais são compostos. Cada cavidade é acessível por meio de uma leitura fluorescente multiespectral.

Uma camada superior opaca bloqueia os sinais fluorescentes do reservatório de tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertidos. Utilizando microscopia de força atômica, as aberturas dos poros uniformemente dispostas e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício foram medidas em 3,6 nanômetros, ideal para fusão de vesículas. A microscopia eletrônica de varredura mostra uma seção transversal através de um nanoporo, que acessa as cavidades de fentolitros no interior do chip de silício.

Este vídeo mostra a preparação dos proteolipossomos, a preparação das lâminas para o ensaio e a execução básica do ensaio. Conecte um frasco de fundo redondo lavado com etanol a um evaporador rotativo. Seque o filme lipídico por 40 minutos a 300 milibares, temperatura do banho de água de 30 graus Celsius e velocidade máxima de rotação para formar um filme lipídico homogêneo na parede de vidro do frasco.

Em seguida, utilizando uma bomba de vácuo alto, seque o filme lipídico por mais 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, adicione cinco mililitros de tampão e oito esferas de vidro lavadas com etanol ao frasco para formar vesículas multilamelares. Conecte o frasco ao evaporador rotativo e gire sem vácuo a 50 graus Celsius na velocidade máxima.

Após 45 minutos, a solução apresentará uma aparência esbranquiçada, sem filme lipídico residual nas paredes. Transfira o frasco sob uma atmosfera de gás inerte para um banho ultrassônico e sonique por quatro minutos à temperatura ambiente. A sonicação rompe os lipossomos, tornando-os unilamelares.

Agora, divida a solução de LUV em alíquotas de um mililitro e realize cinco ciclos de congelamento-descongelamento usando nitrogênio líquido e um banho de água a 40 graus Celsius. Isso leva à ruptura, rearranjo e crescimento dos lipossomos. No último passo de congelamento, armazene todas as amostras a menos 80 graus Celsius.

Antes de reconstituir uma alíquota de LUV, extrude os lipossomos passando a alíquota através de uma membrana de filtro de policarbonato de 400 nanômetros 17 vezes, utilizando um extrusor mini. Em seguida, desestabilize os LUVs adicionando Triton X-100 4% para obter 0,25% na solução. Incube a mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.

Agora, misture uma parte de MscL purificado e modificado em 20 partes de lipossomos saturados com detergente e continue a incubação por 30 minutos. Após a incubação, retire uma alíquota de 100 microlitros e adicione um volume igual de calcine a 30 milimolares. Incube esta mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.

Agora, remova o detergente das amostras tratadas e não tratadas com calcine. Adicione bioesferas úmidas em tampão Tris a cada uma e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa rotatória.

Para começar, misture a base do elastômero com o agente de cura e desseque completamente a mistura para que fique isenta de umidade. O adesivo deve ser usado dentro de 30 minutos após ficar pronto. Enquanto isso, tomando precauções, limpe uma lamínula usando cinco mililitros de clorofórmio, aplicados com uma seringa de vidro, e deixe a lamínula secar.

Agora, utilizando uma pipeta de 10 microlitros, deposite o adesivo preparado sobre o lamínula. Em seguida, remova cuidadosamente um chip da placa de wafer usando pinças finas. Com o lado revestido do chip voltado para cima, posicione-o sobre o adesivo e pressione suavemente contra a lâmina para distribuir uniformemente o adesivo.

Não permita que bolhas de ar fiquem presas abaixo, nem que adesivo ultrapasse para cima no chip. Além disso, monte o conjunto de forma que se encaixe no suporte de oito câmaras. Agora, desseque os conjuntos por duas horas a 65 graus Celsius em uma estufa.

Posteriormente, remova a camada protetora dos chips com algumas lavagens com solvente a 54 graus Celsius. Primeiro, coloque os chips montados em um porta-lâminas. Em seguida, incube-os em três banhos de solvente por 10 minutos cada.

Isopropanol, acetona e isopropanol. Em seguida, lave cuidadosa e completamente os chips com água ultrapura. Conclua o processo secando os chips sob um fluxo suave de gás nitrogênio.

Agora, prepare um lâmina adesiva de oito poços e coloque-a virada ao contrário sobre a bancada. Em seguida, levante cuidadosamente as lamínulas e pressione-as sobre a lâmina adesiva com os chips voltados para os poços. Deixe o conjunto repousar por alguns minutos antes de prosseguir.

Antes de prosseguir com o ensaio de translocação, lave cuidadosamente a montagem do chip, conforme descrito no protocolo textual, finalizando com uma imersão em tampão Tris. Em seguida, substitua a solução do banho por tampão Tris DOPEd, contendo cloreto de cálcio cinco milimolar e corante Oy647 um micromolar. A seguir, adicione proteolipossomos à câmara do chip para uma concentração final de um miligrama por mililitro e aguarde uma hora.

Após uma hora, enxágue as lâminas quatro vezes com 400 microlitros de tampão Tris livre de cálcio. Agora, adicione o corante controlado a cada poço até cinco micromolar e prossiga com o ensaio. Em seguida, acople o suporte da lâmina ao microscópio de epifluorescência e foque na borda da lâmina de nanoporos para localizar as microcavidades.

Uma vez que as microcavidades estejam em foco, varra a matriz de nanoporos em busca de uma região que exiba a maior proporção de teto. Detalhes são fornecidos no protocolo descrito no texto. Os lipossomos foram preparados e verificados quanto à sua distribuição de tamanho e dispersão.

Os lipossomos preparados eram maiores que o diâmetro dos poros para o ensaio, o que é essencial. Lipossomos monodispersos também são desejáveis. Antes do experimento, a proteína MscL modificada na preparação dos lipossomos foi verificada utilizando um ensaio de dessensibilização fluorescente.

A proporção de lipossomos que continham MscL modificada ativa foi adequada para prosseguir com o experimento de translocação. No biochip, observou-se a translocação de um soluto marcado com fluorescência através do canal MscL modificado. O modulador químio, MTSET, foi utilizado para abrir os canais MscL modificados por meio de repulsão eletrostática.

A diminuição subsequente da fluorescência dentro do espaço da cavidade foi monitorada. Esse processo revelou-se altamente reprodutível, com eventos de efluxo muito consistentes. As curvas de efluxo resultantes agruparam-se em duas populações distintas, correspondentes a eventos de translocação por canal único ou por múltiplos canais.

O sistema foi capaz de acompanhar até três corantes com fluorescência distinta mediante análise em tempo real. Isso facilita a discriminação precisa de resultados positivos, eventos de efluxo monoexponenciais, cinéticas complexas, intrusões lipídicas e rupturas de membrana. Uma vez dominada, esta técnica pode ser executada em etapas consecutivas, nomeadamente preparação do chip, preparação da amostra, aquisição de imagens e análise, tornando todo o protocolo modular.