Name: Membrane Transport processos analisados por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a analisar proteínas de membrana em nível molecular usando chips de nanoporo altamente paralelos. Este método permite estudar dinâmica de transporte e condutividade de canais individuais com resolução de proteína única.

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Agradecemos a Barbara Windschiegl por sua ajuda no estabelecimento de SOPs; Dennis Remme por seu trabalho no software NanoCalcFX e Alina Kollmannsperger, Markus Braner e Milan Gerovac por sugestões úteis sobre o manuscrito. A Cooperação de Projetos Alemão-Israelense (DIP) fornecida pela DFG e pelo Ministério Federal de Educação e Pesquisa à RT, bem como o Ministério Federal de Economia e Tecnologia (Projeto ZIM R&D) à RT e à Nanospot GmbH apoiaram este trabalho.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A técnica apresentada aqui permite uma análise altamente paralela de transporte de proteínas de membrana. sistemas de proteína da membrana reconstituídas pode ser directamente aplicado ao biochip, fazer a adaptação de cada teoricamente transportador de membrana ou canalizar possível. análise de Transporte só é limitado pelo estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescente, quer através de mudança direta de fluorescência (translocação de fluoróforos ou substratos marcados com fluorescência) ou a mudança indireta ...

A análise das proteínas da membrana tornou-se de crescente interesse para a pesquisa básica e farmacêutica nos últimos 20 anos. O desenvolvimento de novos medicamentos depende da identificação e caracterização de novos alvos detalhada, actualmente ser um dos factores limitantes. O facto de que cerca de 60% ​​de todos os alvos de drogas são proteínas de membrana 1, faz com que o desenvolvimento de técnicas para elucidar a sua função mais importante. No passado, as técnicas para o estudo de canais electrogénico e transportadores têm sido desenvolvidos na multiplicidade 2-4. substratos não eletrogênica em contrário apresentar uma tarefa mais desafiadora. Eles são no entanto, de especial interesse como alvos de drogas de primeira linha, uma vez que controlam o fluxo de solutos e nutrientes através da membrana celular e como função de receptores principais em cascatas de sinalização 5. Um esforço considerável foi colocado no desenvolvimento de techniques para estudar a função das proteínas transportadoras de membrana 6, 7. Os sistemas que utilizam membranas sólidas apoiado surgiram como ferramentas mais promissoras neste campo 8-10, incluindo bicamadas lipídicas suportados sólidos, bicamadas tethered 11, 12, membranas lipídicas microblack 13, 14 e nativas vesícula matrizes 15, 16 para citar alguns. Alguns deles estão ainda disponíveis como instalações comerciais 17, 18. Alguns exemplos foram publicados combinando a capacidade de estudar as proteínas de membrana individuais de uma maneira altamente paralela 14, 19, um pré-requisito para as aplicações de rastreio. No entanto, estes métodos raramente ponte de pesquisa básica ao ambiente industrial. As dificuldades muitas vezes encontram-se na capacidade do sistema para ser automatizável, a produção de custo elevado e / ou preparação laboriosa. Uma abordagem overcoming todos os obstáculos acima mencionados é o objetivo final. A técnica aqui apresentada foi desenvolvido para o estudo de canais de membrana e transportadores in vitro num ambiente controlado no nível de proteína única 20-22. Reconstituição de proteínas de membrana purificadas em LUV é muito mais estabelecida do que as abordagens comparáveis ​​para GUVs 23 - 26 ou lipídios preto membranas 27. Eles podem ser directamente aplicadas à superfície do chip, em que a formação de duas camadas tem lugar através de um processo de auto-montagem. O desenho com fundo de vidro nanoporoso do chip (Fig. 1) permite a microscopia de ar, que permite a automatização simples do sistema. Em combinação com uma platina motorizada múltiplos chips podem ser medidos ao mesmo tempo, com cada campo de visão contendo milhares de cavidades seladas para análise. Figura 1. Projeto de biochips nanopore multiplexados. A) A silício sobre isolante (SOI) wafer é estruturado por ataque reativa-ion. Cerca de 1.150 fichas individuais são fabricados a partir de cada wafer com propriedades idênticas e qualidade. B) Cada chip inclui 250.000 microcavidades individuais com aberturas nano. Barra de escala:. 200 mm C) Cada cavidade é endereçável através de fluorescência multi-espectral de leitura. Um não transparentes superiores blocos da camada os sinais fluorescentes a partir do reservatório tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertido. D) microscopia de força atómica (AFM), imagiologia revela uniformemente dispostas aberturas dos poros e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício de 3,6 nm (n = 40) ideal para a fusão das vesículas. Barra de escala:. 5 m E) mic eletrônica de varreduraroscopy imagem (SEM) mostra uma secção transversal através da nano-poros que permite o acesso às cavidades femtoliter dentro do chip de silício. Este valor foi reutilizado com permissão de 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Toda a análise dos dados é feita usando freeware para garantir o acesso irrestrito para os usuários finais. séries temporais são analisados ​​utilizando software de processamento de imagem gratuito e um processamento em lote que permite o software de análise personalizada curva de construção e correlação direta de grandes conjuntos de dados com múltiplos canais fluorescentes e milhares de curvas. A proteína modelo utilizado neste protocolo é o canal mechanosensitive de proteína grande condutância (MsCl) canal derivado de E. coli. Ele funciona como uma válvula para libertar choque osmótico na natureza, mas foi modificado de tal maneira que racionalmente concebidos Synthetic funcionalidades pode ser covalentemente ligado ao lado de canais de constrição. Via-carga de repulsão do activador ligado covalentemente (MTSET) do canal é accionado para abrir, a criação de um nano-válvula. Pequenas moléculas como os íons, água, pequenas proteínas, mas também pequenas fluoróforos pode permear através do canal. Aqui, a proteína é utilizada como um modelo para demonstrar a capacidade do sistema para detectar a translocação mediada pela proteína.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimetilamônio)etil] metantiossulfonato</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hidrolisado por água. Conservar como alíquota seca a -80 °C. Utilizar imediatamente (30 minutos) após solubilização em tampão.</td></tr><tr><td>Seringa estanque a gás de 1 ml</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Balão redondo de 10 ml</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm grânulos de vidro</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extensão Luer-Lock de 30 cm</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 O adsorvente</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>precisa ser ativado antes do primeiro uso</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>armazenar escuro a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Produtos químicos de clorofórmio de grau</td><td>reagente VWR</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>armazenar escuro a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Seringa descartável</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Seringa descartável Injekt-F</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck clipes</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilcolina, 20% (Soja)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>armazenar sob gás inerte a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5% a.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mainz/Alemanha)</td><td></td> <td>disponível a pedido</td></tr><tr><td>Membrana Nucleopore Track-Etch 0.4 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td> <td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>loja escura a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster/Alemanha)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>loja escura a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Filtração por seringa de rotilabo, não estéril, tamanho de poro 0,22 &micro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>material de coluna para cromatografia de exclusão de tamanho</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>agente de cura para fixação de cavacos no suporte de vidro de cobertura</td></tr><tr><td>pegajoso-Slide 80828</td> câmara multi-poço <td>ibidi</td><td>80828</td> de 8 <td>poços para montagem em lâminas de vidro (porta-cavacos)</td></tr> <tr><td>Torneira de três vias azul</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; m filtro de membrana de nitrato de celulose</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 banho-maria</td><td>B&uuml; chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; Espectrotômetro</td> de Fluorescência Eclipse chi <td></td><td></td></tr><tr><td>Cary&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extrusora</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de membrana&nbsp;</td>Microscópio de rastreamento de nanopartículas <td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanosight Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>NyONE Synentec</td><td></td><td>disponível a pedido</td></tr><tr><td>Controle de bomba</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator banho Sonorex RK100H</td><td>Brandelin</td><td>31200001107477</td><td></td>eletrônico</tr><tr><td>Bomba de vácuo RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Software de <td>processamento de imagem</td><td>científica http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>de código aberto</td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ Software</td> de análise/avaliação de dados <td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ freeware</td><td></td> <td>para conjuntos de dados cinéticos de transporte massivo</td></tr><tr><td>Software analítico NTA 2.3 Software de</td> aquisição e análise de dados <td>Nanosight</td><td></td><td>para rastreamento de nanopartículas software do controle</td></tr><tr><td>da temperatura de Nanosight</td><td></td><td></td> das comunicações da temperatura de NTA 2,3 do microscópio <td>para o microscópio de seguimento do nanoparticle</td></tr></tbody></table>

membrane transport processos analisados ​​por um sistema nanopore chip altamente paralelos na resolução protein individual

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

transporte de proteínas de membrana no nível de proteína único ainda escapa análise detalhada, se o substrato translocado é não-electrogenic. Esforços consideráveis ​​têm sido feitas neste campo, mas as técnicas que permitem a análise automatizada de transporte de alto rendimento, em combinação com técnicas de bicamada lipídica livre de solvente necessária para a análise dos transportadores de membrana são raras. Esta classe de transportadores, porém, é crucial na homeostase celular e, portanto, um alvo chave no desenvolvimento de medicamentos e metodologias para ganhar novos conhecimentos precisava desesperadamente. O manuscrito apresentado aqui descreve a criação e gestão de um romance biochip para a análise dos processos de transporte de proteínas mediada membrana em resolução transporter única. O biochip é composto de microcavidades fechados por nanoporos, que é altamente paralelo na sua concepção e pode ser produzido em quantidade e de qualidade industrial. lipossomas proteína-abrigando pode ser directamente aplicada aa superfície do chip formar bicamadas lipídicas-medindo poros auto-montadas usando SSM-técnicas (sólido suportado membranas lipídicas). Pore-abrangendo partes da membrana são independentes, proporcionando a interface para a translocação de substrato para dentro ou para fora do espaço da cavidade, o que pode ser seguido por leitura fluorescente multi-espectral em tempo real. O estabelecimento de procedimentos operacionais padronizados (POPs) permite a criação simples de bicamadas lipídicas-abrigando proteína na superfície do chip de proteína de membrana praticamente todos os que podem ser reconstituídos funcionalmente. O único pré-requisito é o estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescência para substratos de transporte não eletrogênica. aplicações de alto teor de triagem são realizáveis ​​pelo uso de automatizados microscópios fluorescentes invertidos gravação múltiplos chips em paralelo. Grandes conjuntos de dados podem ser analisados ​​usando o software de análise de design personalizado disponível gratuitamente. Três cores de multi espectral fluorescenteleia-out, além disso, permite a discriminação de dados imparcial em diferentes classes de eventos, eliminando falsos resultados positivos. A tecnologia de chip é atualmente baseado em SiO2 superfícies, mas ainda funcionalização usando superfícies de fichas revestidas de ouro também é possível.

membranas que atravessa a poro pode ser facilmente criado na superfície do chip nanoestruturada de uma maneira auto-montadas. No entanto, o processo subjacente ainda é delicado e influenciado por muitos parâmetros como o tamanho de lipossomas, monodispersity da população de lipossomas, lamelaridade, lipídios e as propriedades do sal de concentração e de superfície química. A maioria destes parâmetros foram cuidadosamente caracterizado e padronizado no protocolo acima. Outros parâmetros n...

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

O objetivo geral dessa plataforma baseada em chip de nanoestrutura é analisar a função de proteínas de membrana no nível molecular individual de maneira altamente paralela. Por meio de sua capacidade de detectar proteínas individuais, obtêm-se novos conhecimentos sobre o transporte e o fluxo em membranas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das proteínas de membrana, como a condutividade ou o comportamento de transporte de canais ou transportadores individuais, especialmente aqueles que transportam cargas não eletrogênicas.A principal vantagem desta técnica é seu alto grau de paralelismo derivado do design do chip com nanoestrutura, que possui centenas de milhares de nanoporos e a leitura fluorescente dos eventos de transporte. As implicações desta técnica estendem-se à criação dos melhores ensaios para bibliotecas eficazes de proteínas de membrana. Porque a plataforma baseada em chip permite o registro altamente paralelo e automático de transportes.Em geral, indivíduos novos neste método aprenderão rapidamente como manipular a técnica apresentada. O foco sempre foi criar um ensaio fácil de usar, para que todos os interessados possam adotá-lo. Este e

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Biology

Biologia

Microscopia única molécula approch forneceu introspecções romance em transporte nuclear.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira...

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

A metodologia para a elaboração nanoporos de estado sólido em solução para experimentos de translocação biomoleculares é apresentado. Através da aplicação de pulsos curtos de altos campos elétricos, o diâmetro nanopore pode ser controlada com precisão subnanometer ampliado e suas características de ruído elétrico melhorado significativamente. Este procedimento é realizado in situ, utilizando equipamento de laboratório, em condições experimentais.

Ajustar o tamanho e minimizando o ruído de Solid-state Nanoporos

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar clusters de oxigênio de metal discretos, polioxometalatos (POMs), no limite de molécula única usando uma plataforma eletrônica baseada em nanoporos biológica. O método fornece uma aproximação complementar às ferramentas analíticas tradicionais da química usadas no estudo destas moléculas.

Caracterização física de alta resolução de nanopartículas metálicas únicas

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3  como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

O sequenciamento de nanopore é uma nova tecnologia que permite o sequenciamento econômico em locais remotos e configurações pobres em recursos. Aqui, nós apresentamos um protocolo para arranjar em seqüência dos mRNAs do sangue inteiro que é compatível com tais circunstâncias.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Aprenda a analisar proteínas de membrana em nível molecular usando chips de nanoporo altamente paralelos. Este método permite estudar dinâmica de transporte e condutividade de canais individuais com resolução de proteína única.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

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