Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

O objetivo geral desta plataforma baseada em chip de nanoestrutura é analisar a função da proteína da membrana no nível molecular único de maneira altamente paralela. Por meio de sua capacidade de resolver proteínas individuais, novos insights sobre o transporte e o fluxo da membrana são alcançados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da proteína de membrana, como a condutividade ou o comportamento de transporte de canais únicos ou transportadores, especialmente com cargas não eletrogênicas.

A principal vantagem desta técnica é seu alto paralelismo derivado do design de chips de nanoestrutura, apresentando centenas de milhares de nanoporos e a leitura fluorescente de eventos de transporte. As implicações dessa técnica se estendem ao que está criando os melhores ensaios de bibliotecas eficazes para proteínas de membrana. Porque a plataforma baseada em chip permite um registro de transporte altamente paralelo e automático.

Geralmente, os indivíduos novos neste método aprenderão rapidamente como lidar com a técnica apresentada. O foco sempre foi criar um ensaio amigável para que todos os interessados pudessem adotá-lo. Este ensaio de transporte de membrana utiliza um silício em wafer isolado, projetado usando gravação de íons de reação.

Cerca de 1.000 chips de ensaio são fabricados a partir de cada wafer. Cada chip contém 250.000 microcavidades. Essas cavidades são seladas por bicamadas lipídicas contendo as proteínas de transporte de interesse.

A membrana constitui a interface do sensor. Inicialmente, os materiais fluorescentes estão contidos em um lado da bicamada lipídica, correspondendo ao interior dos lipossomas a partir dos quais são compostos. Cada cavidade é endereçável por meio de uma leitura de fluorescência multiespectral.

Uma camada superior opaca bloqueia os sinais fluorescentes do reservatório tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertida. Usando microscopia de força atômica, as aberturas dos poros uniformemente dispostas e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício foram medidas em 3,6 nanômetros, ideal para a fusão de vesículas. A microscopia eletrônica de varredura mostra uma seção transversal através de um nanoporo, que acessa as cavidades do femtolitro dentro do chip de silício.

Este vídeo mostra a preparação dos proteolipossomas, a preparação dos chips para o ensaio e a execução básica do ensaio. Ligar um balão de fundo redondo lavado com etanol a um evaporador rotativo. Secar a película lipídica durante 40 minutos a 300 milibares, a 30 graus Celsius de temperatura do banho-maria e a uma velocidade máxima de rotação para formar uma película lipídica homogénea na parede de vidro do balão.

Em seguida, usando uma bomba de alto vácuo, seque o filme lipídico por mais 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão e oito contas de vidro lavadas com etanol ao frasco para fazer as vesículas multilamelares. Conecte o frasco ao evaporador rotativo e gire sem vácuo a 50 graus Celsius na velocidade máxima.

Após 45 minutos, a solução parecerá leitosa, sem filme lipídico residual nas paredes. Transferir o balão sob um gás inerte para um banho ultrassónico e sonicar durante quatro minutos à temperatura ambiente. A sonicação interrompe os lipossomas, tornando-os unilamelares.

Agora, divida a solução LUV em alíquotas de um mililitro e execute cinco ciclos de congelamento e descongelamento usando nitrogênio líquido e um banho-maria a 40 graus Celsius. Isso leva à ruptura, rearranjo e crescimento dos lipossomas. Na última etapa de congelamento, armazene todas as amostras a menos 80 graus Celsius.

Antes de reconstituir uma alíquota LUV, extrudar os lipossomas passando a alíquota através de uma membrana filtrante de policarbonato de 400 nanómetros 17 vezes, utilizando uma miniextrusora. Em seguida, desestabilize os LUVs adicionando 4% de Triton X-100 para 0,25% de solução de entrada. Incube a mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.

Agora, misture uma parte de MscL purificada e modificada em 20 partes dos lipossomas saturados com detergente e continue a incubação por 30 minutos. Após a incubação, pegue uma alíquota de 100 microlitros e adicione um volume de calcina 30 milimolar. Incube esta mistura por cinco minutos a 50 graus Celsius.

Agora, remova o detergente da amostra tratada com calcina e não tratada. Adicione bioesferas úmidas em tampão Tris a cada uma e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa rotativa. Antes do experimento, teste uma preparação usando um ensaio de atividade.

Para começar, misture a base de elastômero no agente de cura e dessece totalmente a mistura para que fique horrorizada. O adesivo deve ser usado dentro de 30 minutos quando estiver pronto. Enquanto isso, tomando precauções, limpe uma lâmina de vidro com cinco mililitros de clorofórmio, aplicado em uma seringa de vidro, e deixe a lâmina secar.

Agora, usando uma pipeta de 10 microlitros, deposite o adesivo preparado na lamínula. Em seguida, remova cuidadosamente um chip da placa de wafer usando uma pinça fina. Com o lado revestido do cavaco para cima, deposite-o no adesivo e esfregue-o suavemente na lâmina para distribuir uniformemente o adesivo.

Não deixe bolhas de ar ficarem presas abaixo ou qualquer adesivo ficar acima do chip. Além disso, faça o conjunto de forma que ele se encaixe no suporte deslizante de oito câmaras. Agora descasque os conjuntos por duas horas a 65 graus Celsius em um secador de gabinete.

Mais tarde, remova a camada protetora dos chips com algumas lavagens com solvente a 54 graus Celsius. Primeiro coloque os cavacos montados em um suporte de slide. Em seguida, incube-os em três banhos de solvente por 10 minutos cada.

Isopropanol, acetona e isopropanol. Em seguida, lave cuidadosamente e completamente as lascas com água ultrapura. Complete o processo secando os cavacos sob um fluxo suave de gás nitrogênio.

Agora, prepare uma lâmina pegajosa de oito poços e coloque-a para trás no banco. Em seguida, levante e pressione cuidadosamente as corrediças da tampa na corrediça adesiva com as lascas voltadas para os poços. Deixe o conjunto descansar por alguns minutos antes de prosseguir.

Antes de prosseguir com o ensaio de translocação, lave bem o conjunto de cavacos, conforme descrito no protocolo de texto, terminando com um banho de tampão Tris. Em seguida, troque a solução do banho por tampão DOPEd Tris, contendo cinco cloreto de cálcio milimolar e um corante micromolar Oy647. Em seguida, adicione proteolipossomas à câmara do chip para uma concentração final de um miligrama por mililitro e aguarde uma hora.

Após uma hora, enxágue os chips quatro vezes com 400 microlitros de tampão Tris sem cálcio. Agora, adicione o corante controlado a cada poço até cinco micromolares e prossiga com o ensaio. Em seguida, monte o suporte do chip no microscópio de epifluorescência e concentre-se na borda do chip de nanoporos para encontrar as microcavidades.

Quando as microcavidades estiverem em foco, examine a matriz de nanoporos em busca de uma região que exiba a maior proporção de teto. Os detalhes são fornecidos no protocolo de texto. Os lipossomas foram preparados e verificados quanto à distribuição e dispersão de tamanho.

Os lipossomas preparados foram maiores que o diâmetro dos poros para o ensaio, o que é essencial. Lipossomas monodispersos também são desejáveis. Antes do experimento, a proteína MscL modificada na preparação do lipossomo foi verificada usando um ensaio de extinção de fluorescência.

A proporção de lipossomas com MscL modificado ativo foi adequada para prosseguir com o experimento de translocação. No biochip, foi observada a translocação de soluto de um alvo fluorescente através do canal MscL modificado. O modulador químico, MTSET, foi usado para abrir os canais MscL projetados por meio de repulsão eletrostática.

A subsequente diminuição da fluorescência dentro do espaço cavitário foi monitorada. Este processo mostrou-se altamente reprodutível, com eventos de efluxo muito consistentes. As curvas de efluxo resultantes agruparam-se em duas populações distintas, correspondendo a eventos de translocação de canal único ou multicanal.

O sistema foi capaz de acompanhar até três corantes fluorescentes exclusivos com análise em tempo real. Isso facilita a discriminação precisa de resultados positivos, eventos de efluxo mono-exponencial, cinética complexa, intrusões lipídicas e rupturas de membrana. Uma vez dominada, esta técnica pode ser executada em etapas consecutivas, nomeadamente preparação de chips, preparação de amostras, imagiologia e análise, tornando todo o protocolo modular.