Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

O objetivo geral deste procedimento é obter frações de linfócitos BNT de amostras de amígdalas humanas. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da virologia, como quais são os papéis das frações de linfócitos BT na patogênese de doenças virais Dentro de três horas após sua remoção cirúrgica. Transporte o tecido da amígdala para o laboratório em um tubo de centrífuga de 50 mililitros cheio de HBSS estéril e gelado contendo suplementos.

Em seguida, usando os procedimentos de biossegurança apropriados recomendados para o manuseio de tecido humano. Umedeça o tecido com suplemento fresco contendo HBSS e transfira as amígdalas para uma placa de cultura de células plásticas de 60 milímetros no gelo. Usando uma pinça, remova quaisquer coágulos sanguíneos visíveis ou tecidos adiposos e conjuntivos e, em seguida, transfira as amígdalas para uma nova placa de 60 milímetros contendo cinco mililitros de HBSS com suplementos.

Em seguida, corte. O tecido da amígdala se aglomera em fragmentos de três a 10 milímetros, seguido pela transferência dos fragmentos para um filtro de células plásticas de 100 micrômetros em uma nova placa de cultura de células de 60 milímetros contendo 10 mililitros de HBSS fresco com suplementos usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de plástico suavemente. Esprema os fragmentos de tecido através do filtro de células, certificando-se de que os fragmentos de amígdala permaneçam totalmente imersos no HBSS quando todo o tecido tiver sido macerado, descarte o filtro e transfira a suspensão celular resultante para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mililitros no gelo.

Leve a solução celular a um volume final de 35 mililitros com HBSS fresco contendo suplementos e, em seguida, adicione 10 mililitros de solução de gradiente de densidade de temperatura ambiente em alguns tubos cônicos de 50 mililitros. Sobrepor suavemente as suspensões celulares sobre os gradientes de densidade, tomando cuidado para não misturar as soluções e depois separar as células por centrifugação. As células mononucleares se separarão em uma camada branca fofa na interface com os glóbulos vermelhos, fibroblastos e detritos celulares localizados no sedimento no fundo do tubo.

Usando uma pipeta de 10 mililitros, colete cuidadosamente a camada de células mononucleares e puxe as células mononucleares em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, lave as células três vezes em 25 mililitros de PBS gelado por cada lavagem e ressuspenda o pellet final em 15 mililitros de PBS. Depois de contar o número de células viáveis, coloque as células no gelo para isolar as células T tonsoras por separação magnética de esferas.

Gire a suspensão de células mononucleares e ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão de separação gelado por um vezes 10 elevado às sete células. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo estéril de dois mililitros e incube em 20 microlitros de CD três anticorpos magnéticos por uma hora a quatro graus Celsius com mistura suave contínua para manter as células e a suspensão no final da incubação, transfira as células para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de tampão de separação gelado e lave-as durante a lavagem. Fixe o separador magnético ao suporte e carregue uma coluna no ímã.

Lave a coluna com 500 microlitros de tampão de separação gelado e, em seguida, coloque um filtro de 40 micrômetros no topo da coluna. Agora suspenda novamente o pellet celular em 500 microlitros de tampão de separação fresco e carregue as células através do filtro na coluna que coleta a célula B contendo EIT em um cônico de 15 mililitros. Dois bon ice quando todas as células passaram para o tubo de coleta.

Lave a coluna quatro vezes com 500 microlitros de tampão de separação por um vezes 10 para as sete células esperando que o reservatório da coluna esteja vazio antes de aplicar a próxima lavagem. Após a última lavagem, transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 15 mililitros. Em seguida, usando o êmbolo da coluna para pressionar dois mililitros de tampão de separação através da coluna no tubo para coletar a fração de células T positivas CD três.

Para analisar as frações isoladas de células B e t tonsor, faça a pelota CD três frações celulares positivas e CD três negativas e lave ambos os conjuntos de células em um mililitro de PBS suplementado com 0,2% BSA ou PBSA após o segundo spin. Distribua alíquotas de 100 microlitros das células e PBSA no número apropriado de tubos para rotulagem por fax e adicione a quantidade apropriada de fluoro quatro monoclonal conjugado ou anticorpo de controle a cada tubo. Em seguida, vórtice brevemente os tubos e incube-os por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro no final da incubação.

Lave os tubos duas vezes com PBSA fresco e, em seguida, fixe a coloração celular com aldeído paraforme a 1% para detectar a presença de DNA de adenovírus nas células por PCR. Realize a amplificação de PCR sob as condições de ciclagem apropriadas, separando os produtos de amplificação de PCR resultantes em um gel de 1,5% AGROS e tampão EDTA interestadual. Finalmente, visualize as bandas resultantes com a coloração de ácido nucleico apropriada.

De acordo com os protocolos padrão, uma separação bem-sucedida das células mononucleares tonsor resulta em subpopulações altamente purificadas de linfócitos BNT, conforme confirmado pela análise citométrica de fluxo usando anticorpos anti CD 20 e anti CD dois para detectar as populações de linfócitos b e t, respectivamente. Em contraste, uma separação ineficiente das células mononucleares resulta em frações celulares que são uma mistura de células dos linfócitos b e t. Subpopulações, DNA e RNA podem ser extraídos dos linfócitos b e t separados por esferas magnéticas para análise a jusante, como acabamos de demonstrar.

Por exemplo, aqui, a detecção específica de DNA de adenovírus em linfócitos T TONSOR, detectada por PCR, é mostrada citoplasmática de qualidade. O RNA também pode ser extraído de linfócitos tonsor B NT isolados. Uma vez monstruosa, duas amostras de amígdalas podem ser processadas em seis horas se a técnica for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante processar as amostras de amígdalas o mais rápido possível. O número de etapas de lavagem e o volume do tampão de lavagem também são parâmetros críticos para um bom resultado. Após este procedimento, outros métodos como QPCR e R-T-Q-P-C-R podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a presença quantitativa de DNA viral e mRNA após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do campo da virologia explorarem a patogênese e a latência de diferentes espécies virais nos tecidos linfóides humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar frações de linfócitos BT de amostras de amígdalas humanas. Não se esqueça de que trabalhar com materiais não rastreados de origem humana, como sangue e tecidos, pode ser extremamente perigoso.

Portanto, devem ser seguidas práticas de segurança apropriadas.