Quantificação de vida útil de invertebrados
Muitos animais naturalmente param de crescer ao chegar à idade adulta, após os quais sofrem envelhecimento ou "senescência" até morrerem. A quantidade…
Experimentos de quantificação da vida útil permitem que os cientistas examinem as influências genéticas e ambientais na vida útil de um organismo. Organismos modelo invertebrados, como a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e a lombriga Caenorhabditis elegans,têm se mostrado extremamente úteis nesse sentido. Ao realizar experimentos que medem e manipulam a vida útil desses organismos, os cientistas começaram a trabalhar os fatores que afetam o processo de envelhecimento.
Neste vídeo, você aprenderá sobre alguns princípios por trás da vida útil e do envelhecimento, protocolos básicos para medir a vida útil no verme e na mosca das frutas, e maneiras pelas quais esses experimentos estão sendo aplicados.
Antes de olhar para os procedimentos experimentais para medir a vida útil, é importante primeiro entender o que é vida útil e envelhecimento.
A vida útil é a quantidade de tempo que um organismo vive e funciona, entre o nascimento e a morte. Alguns organismos, como muitas plantas, podem teoricamente viver para sempre. Enquanto isso, a maioria dos animais naturalmente pararia de crescer, mesmo em condições ideais, após as quais envelheceriam ou "senesce" até morrerem.
Os cientistas ainda não entendem completamente por que os organismos envelhecem. Diversos fatores, incluindo radiação e danos químicos do meio ambiente, e subprodutos tóxicos de nossos próprios processos metabólicos, foram sugeridos para desempenhar um papel no envelhecimento.
Para estudar esses fatores, os pesquisadores têm aproveitado os tempos de geração curta de organismos modelos invertebrados, como vermes e moscas, que permitem aos cientistas observar várias gerações ao longo de dias ou semanas, em vez de meses, como no caso de modelos de mamíferos como ratos. Eles também são bastante favoráveis à manipulação genética, com muitas ferramentas disponíveis que permitem que genes específicos sejam ligados ou desligados facilmente para observar seus efeitos no processo de envelhecimento.
Agora que aprendemos por que modelos de invertebrados são altamente favoráveis aos estudos de envelhecimento, vamos ver como experimentos para medir a vida útil são realizados em vermes. Resumidamente, esses experimentos envolvem a coleta de vermes-pais, sincronizando a idade de sua descendência, tratando vermes larvais com uma droga para inibir a reprodução, e finalmente transferindo vermes para placas de teste e contando vermes que estão vivos ou mortos.
No início do procedimento, é necessário obter um número suficiente de animais com correspondência etária sincronizando um lote de vermes para todos os ovos colocados ao mesmo tempo. Para isso, os primeiros vermes são deixados no mesmo prato de cultura por aproximadamente uma semana, permitindo que eles consumam todos os alimentos disponíveis e, assim, induzindo a fome. Algumas das larvas de vermes que estão famintas entrarão em um estado resistente e preso pelo crescimento chamado "dauer". Então, essas larvas dauer são movidas para uma placa fresca. Neste ambiente rico em alimentos, as larvas dauer retomarão seu ciclo de vida e se tornarão adultos jovens reprodutivamente maduros.
Finalmente, depois de dois dias esses vermes adultos são transferidos para outra placa fresca e autorizados a colocar ovos por até 24 horas. Uma vez que um número suficiente de ovos são adquiridos, os adultos são removidos da placa, e os ovos são incubados a 20°C por 2-3 dias para permitir que os vermes eclodam e cresçam até o estágio larval L4.
Para medir a vida útil dos vermes, essas larvas são transferidas para placas contendo a droga FUDR, que suprime a reprodução de vermes sem afetar a vida adulta. Ao longo do experimento, para determinar se os vermes estão vivos ou mortos, a placa pode ser aproveitada para observar o movimento dos vermes. Para vermes mais velhos, pode ser necessário gentilmente cutucar a cabeça do verme para obter uma resposta. Remova vermes mortos e regise o número de vermes mortos e vivos. Os animais devem ser transferidos para placas frescas a cada 2-3 dias para evitar a fome.
Agora que mostramos a quantificação da vida útil dos vermes, vamos examinar como é feito em moscas frutíferas. Resumidamente, o procedimento envolve permitir que as fêmeas coloquem ovos em uma gaiola especial, coletando ovos, permitindo que larvas se desenvolvam em moscas, classificando moscas com base no sexo e, finalmente, contando moscas mortas que aparecem ao longo do tempo.
Para obter moscas com correspondência etária, moscas adultas são colocadas em uma gaiola de coleta de ovos, que contém pratos de suco de frutas listrados com pasta de levedura. Os ovos coletados são lavados, colocados em garrafas de crescimento larval, e incubados por cerca de 10 dias para que as moscas se desenvolvam. Moscas adultas de um dia são então transferidas para garrafas de alimentos adultos e incubadas por dois dias para permitir que elas atinjam a maturidade sexual.
Essas moscas são então coletadas, anestesiadas e classificadas em machos e fêmeas para evitar confundir as medidas de vida útil com fatores específicos do sexo. Em seguida, as moscas de sexo único são colocadas em frascos de crescimento. A cada dois dias, as moscas devem ser "viradas" em novos frascos com alimentos frescos. Moscas mortas são pontuadas contando as que são deixadas no velho frasco, bem como aquelas que caíram no novo frasco.
Agora que você aprendeu os protocolos básicos para medir a vida útil em modelos invertebrados, vamos ver como os cientistas estão adaptando essas técnicas para estudar a biologia do envelhecimento e da longevidade.
Pesquisadores estão estudando os efeitos de diferentes fatores, como temperatura e drogas, na vida útil. Neste estudo em particular, os cientistas cultivaram vermes em mídia líquida em placas de microtiter de 96 poços, para que os efeitos de múltiplas substâncias e condições de crescimento possam ser testados de uma só vez. Eles descobriram que, por exemplo, o crescimento dos vermes a 25°C, em vez de 20°C, diminuiu a vida útil dos vermes, assim como as altas concentrações da droga antidepressivo Mirtazepine.
Ensaios de vida útil também podem ser combinados com técnicas como interferência de RNA, ou RNAi, para identificar genes que afetam a sobrevivência animal. RNAi é uma técnica experimental poderosa que usa RNAs curtas para diminuir, ou "knockdown", o nível de expressão de um gene alvo. Aqui, os cientistas trataram vermes com RNAi contra o gene bec-1, depois infectaram-nos com a bactéria patogênica Salmonella e realizaram um ensaio de sobrevivência. Vermes com bec-1 derrubados mostraram uma diminuição acentuada na vida útil em comparação com vermes onde o gene está expressando normalmente.
Por fim, experimentos de quantificação de vida estão sendo usados para avaliar o efeito de diferentes condições de crescimento sobre a longevidade dos animais. Neste experimento, os cientistas cultivaram vermes com idade em uma série de pratos com quantidade variada de alimentos bacterianos. Esse regime de crescimento, chamado de restrição calórica ou dietética, tem sido observado para ter um efeito significativo na vida útil dos vermes.
Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre quantificação de vida útil em modelos invertebrados. Este vídeo discutiu alguns dos princípios por trás do envelhecimento e da vida útil, os protocolos para medir a vida útil em vermes e moscas, e algumas aplicações de experimentos de medição ao tempo de vida. Em última análise, a esperança é que esses experimentos ajudem os cientistas a encontrar os fatores e caminhos que controlam o envelhecimento, e permitir o desenvolvimento de terapias para lidar com doenças relacionadas à idade, como Alzheimer e doenças cardiovasculares. Obrigado por assistir!
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Experimentos de quantificação da vida útil permitem que os cientistas examinem as influências genéticas e ambientais na vida útil de um organismo. Organismos modelo invertebrados, como a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e a lombriga Caenorhabditis elegans,têm se mostrado extremamente úteis nesse sentido. Ao realizar experimentos que medem e manipulam a vida útil desses organismos, os cientistas começaram a trabalhar os fatores que afetam o processo de envelhecimento.
Neste vídeo, você aprenderá sobre alguns princípios por trás da vida útil e do envelhecimento, protocolos básicos para medir a vida útil no verme e na mosca das frutas, e maneiras pelas quais esses experimentos estão sendo aplicados.
Antes de olhar para os procedimentos experimentais para medir a vida útil, é importante primeiro entender o que é vida útil e envelhecimento.
A vida útil é a quantidade de tempo que um organismo vive e funciona, entre o nascimento e a morte. Alguns organismos, como muitas plantas, podem teoricamente viver para sempre. Enquanto isso, a maioria dos animais naturalmente pararia de crescer, mesmo em condições ideais, após as quais envelheceriam ou "senesce" até morrerem.
Os cientistas ainda não entendem completamente por que os organismos envelhecem. Diversos fatores, incluindo radiação e danos químicos do meio ambiente, e subprodutos tóxicos de nossos próprios processos metabólicos, foram sugeridos para desempenhar um papel no envelhecimento.
Para estudar esses fatores, os pesquisadores têm aproveitado os tempos de geração curta de organismos modelos invertebrados, como vermes e moscas, que permitem aos cientistas observar várias gerações ao longo de dias ou semanas, em vez de meses, como no caso de modelos de mamíferos como ratos. Eles também são bastante favoráveis à manipulação genética, com muitas ferramentas disponíveis que permitem que genes específicos sejam ligados ou desligados facilmente para observar seus efeitos no processo de envelhecimento.
Agora que aprendemos por que modelos de invertebrados são altamente favoráveis aos estudos de envelhecimento, vamos ver como experimentos para medir a vida útil são realizados em vermes. Resumidamente, esses experimentos envolvem a coleta de vermes-pais, sincronizando a idade de sua descendência, tratando vermes larvais com uma droga para inibir a reprodução, e finalmente transferindo vermes para placas de teste e contando vermes que estão vivos ou mortos.
No início do procedimento, é necessário obter um número suficiente de animais com correspondência etária sincronizando um lote de vermes para todos os ovos colocados ao mesmo tempo. Para isso, os primeiros vermes são deixados no mesmo prato de cultura por aproximadamente uma semana, permitindo que eles consumam todos os alimentos disponíveis e, assim, induzindo a fome. Algumas das larvas de vermes que estão famintas entrarão em um estado resistente e preso pelo crescimento chamado "dauer". Então, essas larvas dauer são movidas para uma placa fresca. Neste ambiente rico em alimentos, as larvas dauer retomarão seu ciclo de vida e se tornarão adultos jovens reprodutivamente maduros.
Finalmente, depois de dois dias esses vermes adultos são transferidos para outra placa fresca e autorizados a colocar ovos por até 24 horas. Uma vez que um número suficiente de ovos são adquiridos, os adultos são removidos da placa, e os ovos são incubados a 20°C por 2-3 dias para permitir que os vermes eclodam e cresçam até o estágio larval L4.
Para medir a vida útil dos vermes, essas larvas são transferidas para placas contendo a droga FUDR, que suprime a reprodução de vermes sem afetar a vida adulta. Ao longo do experimento, para determinar se os vermes estão vivos ou mortos, a placa pode ser aproveitada para observar o movimento dos vermes. Para vermes mais velhos, pode ser necessário gentilmente cutucar a cabeça do verme para obter uma resposta. Remova vermes mortos e regise o número de vermes mortos e vivos. Os animais devem ser transferidos para placas frescas a cada 2-3 dias para evitar a fome.
Agora que mostramos a quantificação da vida útil dos vermes, vamos examinar como é feito em moscas frutíferas. Resumidamente, o procedimento envolve permitir que as fêmeas coloquem ovos em uma gaiola especial, coletando ovos, permitindo que larvas se desenvolvam em moscas, classificando moscas com base no sexo e, finalmente, contando moscas mortas que aparecem ao longo do tempo.
Para obter moscas com correspondência etária, moscas adultas são colocadas em uma gaiola de coleta de ovos, que contém pratos de suco de frutas listrados com pasta de levedura. Os ovos coletados são lavados, colocados em garrafas de crescimento larval, e incubados por cerca de 10 dias para que as moscas se desenvolvam. Moscas adultas de um dia são então transferidas para garrafas de alimentos adultos e incubadas por dois dias para permitir que elas atinjam a maturidade sexual.
Essas moscas são então coletadas, anestesiadas e classificadas em machos e fêmeas para evitar confundir as medidas de vida útil com fatores específicos do sexo. Em seguida, as moscas de sexo único são colocadas em frascos de crescimento. A cada dois dias, as moscas devem ser "viradas" em novos frascos com alimentos frescos. Moscas mortas são pontuadas contando as que são deixadas no velho frasco, bem como aquelas que caíram no novo frasco.
Agora que você aprendeu os protocolos básicos para medir a vida útil em modelos invertebrados, vamos ver como os cientistas estão adaptando essas técnicas para estudar a biologia do envelhecimento e da longevidade.
Pesquisadores estão estudando os efeitos de diferentes fatores, como temperatura e drogas, na vida útil. Neste estudo em particular, os cientistas cultivaram vermes em mídia líquida em placas de microtiter de 96 poços, para que os efeitos de múltiplas substâncias e condições de crescimento possam ser testados de uma só vez. Eles descobriram que, por exemplo, o crescimento dos vermes a 25°C, em vez de 20°C, diminuiu a vida útil dos vermes, assim como as altas concentrações da droga antidepressivo Mirtazepine.
Ensaios de vida útil também podem ser combinados com técnicas como interferência de RNA, ou RNAi, para identificar genes que afetam a sobrevivência animal. RNAi é uma técnica experimental poderosa que usa RNAs curtas para diminuir, ou "knockdown", o nível de expressão de um gene alvo. Aqui, os cientistas trataram vermes com RNAi contra o gene bec-1, depois infectaram-nos com a bactéria patogênica Salmonella e realizaram um ensaio de sobrevivência. Vermes com bec-1 derrubados mostraram uma diminuição acentuada na vida útil em comparação com vermes onde o gene está expressando normalmente.
Por fim, experimentos de quantificação de vida estão sendo usados para avaliar o efeito de diferentes condições de crescimento sobre a longevidade dos animais. Neste experimento, os cientistas cultivaram vermes com idade em uma série de pratos com quantidade variada de alimentos bacterianos. Esse regime de crescimento, chamado de restrição calórica ou dietética, tem sido observado para ter um efeito significativo na vida útil dos vermes.
Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre quantificação de vida útil em modelos invertebrados. Este vídeo discutiu alguns dos princípios por trás do envelhecimento e da vida útil, os protocolos para medir a vida útil em vermes e moscas, e algumas aplicações de experimentos de medição ao tempo de vida. Em última análise, a esperança é que esses experimentos ajudem os cientistas a encontrar os fatores e caminhos que controlam o envelhecimento, e permitir o desenvolvimento de terapias para lidar com doenças relacionadas à idade, como Alzheimer e doenças cardiovasculares. Obrigado por assistir!
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Q1: Why are fruit flies and roundworms used to study aging and lifespan?
Invertebrate model organisms like Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans have short generation times, allowing scientists to observe multiple generations over days or weeks rather than months. They are also highly amenable to genetic manipulation with tools that enable specific genes to be turned on or off easily, making them ideal for examining genetic and environmental influences on aging.
Q2: What is the dauer stage and why is it important in worm lifespan experiments?
Dauer is a hardy, growth-arrested state that worm larvae enter when starved. To synchronize age-matched worms for lifespan studies, researchers induce dauer by starving worms on a culture plate for approximately one week. When transferred to food-rich environments, dauer larvae resume their life cycle and become reproductively mature, allowing scientists to obtain cohorts of uniformly aged animals for consistent experimental measurements.
Q3: How does FUDR treatment support lifespan measurement in worms?
FUDR is a drug that suppresses worm reproduction without affecting adult lifespan, making it essential for accurate lifespan quantification. By preventing reproduction, FUDR eliminates confounding variables from offspring and allows researchers to focus solely on measuring the survival of individual worms over time without interference from progeny.
Q4: What steps are involved in preparing age-matched fruit flies for lifespan studies?
Adult flies are placed in an egg collection cage with fruit juice-agar plates and yeast paste. Collected eggs are washed and incubated for about 10 days to develop into flies. One-day-old adults are transferred to food bottles for two days to reach sexual maturity, then anaesthetized and sorted by sex to avoid confounding lifespan measurements with sex-specific factors.
Q5: How can RNAi be combined with lifespan assays to study aging?
RNA interference, or RNAi, uses short RNAs to decrease the expression level of target genes. Scientists can treat worms with RNAi against specific genes, then perform survival assays to observe how gene knockdown affects lifespan. This technique helps identify genes that influence animal survival and aging processes by comparing lifespan in knockdown organisms versus controls with normal gene expression.
Q6: What environmental factors have been shown to influence invertebrate lifespan?
Temperature, drugs, pathogens, and diet significantly affect lifespan in invertebrate models. For example, growing worms at 25°C rather than 20°C decreased lifespan, as did high concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Caloric or dietary restriction has also been observed to have significant effects on worm lifespan, demonstrating how growth conditions directly impact longevity.
Q7: How are high-throughput lifespan experiments conducted in invertebrates?
Researchers culture worms in liquid media in 96-well microtiter plates to test multiple substances and growth conditions simultaneously. This approach allows scientists to screen the effects of various drugs, environmental factors, and genetic modifications on lifespan in parallel. The data generated helps identify pathways controlling aging and supports the development of therapies for age-related diseases like Alzheimer's and cardiovascular disease.