Name: Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprenda a síntese de nanofibras de queratina/PCL por eletrofiação para engenharia de tecidos e cicatrização de feridas. Este método eficiente permite aplicações em liberação de fármacos e regeneração tecidual.

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Autores gostariam de agradecer a National Science Foundation através da Engenharia Centro de Pesquisa para revolucionar biomateriais metálicos (ERC-0.812.348) e Nanotecnologia de Graduação em Educação (CEE 1.242.139) para o financiamento de apoio.

Todos protocolo segue as diretrizes do Escritório de Pesquisa Compliance e Ética da Universidade Estadual da Carolina do Norte A &amp; T. 1. Preparação Químico para queratina Extraction 4 <ol><li> Para preparar 1000 ml de 2% p / v de solução de ácido peracético (PAS), sob uma coifa adicionar 20 ml de ácido peracético a 980 ml de Água desionizada (DI). </li><li> Para preparar 1000 ml de solução de base 100 mM Tris (TBS), adicione 12,2 g de Tris base a 1.000 ml de água DI e mexa até dissolver completamente. </li><li> Preparar a solução diluída de ácido clorídrico (DHAS) numa hotte vertendo 4 ml de ácido clorídrico concentrado em 30 ml de água Dl. </li><li> Obter aproximadamente 20 g de aparas de cabelo humano, que não foram tratadas quimicamente ou alterados. O cabelo pode ser de qualquer comprimento. </li><li> Lavar o cabelo cuidadosamente, à mão, com água morna e sabão. Use água deionizada (DI) para o enxágüe final. </li><li> Coloque o cabelo em duas 600 ml copos e colocar em um 80 ºC oven durante 1 h. </li><li> Drenar o líquido do fundo do copo e colocar de novo no forno até que o cabelo esteja completamente seco. </li><li> Divide cabelos secos igualmente entre os 600 ml copos, colocando 10 g de cabelo em cada copo. Não permita que o cabelo para preencher mais de 500 ml. </li><li> Despeje 500 ml de PAS em cada copo certificando-se de cobrir todo o cabelo. Cobrir os copos com parafilme e armazenar durante 12 h. </li></ol> 2. Preparação de queratina solução de extracção <ol><li> Separa-se o cabelo da PAS usando um crivo de 500 um. Recolher as PAS resíduos em um recipiente separado. Lavar o cabelo cuidadosamente com água DI para remover qualquer PAS restante. </li><li> Colocar o cabelo lavado em um balão de 500 ml. Pour 400 ml de TBS para o balão, certificando-se que o cabelo é coberto. Colocar o balão num banho de agitação ajustado a 38 ° C, 65 rpm durante 1 h. </li><li> Após 1 hora, retire do tremendo banheira e despeje o líquido, cerca de 400 ml de solução de extracção queratina (KES), into num copo de 1000 ml. </li><li> Pour 400 ml de água Dl ao frasco contendo o cabelo assegurar que o cabelo é coberto e colocar de volta no banho de agitação durante 1 h. Retirar o balão do banho de agitação e despeje os restantes 400 ml de KES para o copo de 1000 ml com o KES previamente coletadas. O cabelo não é mais necessária e pode ser despejado para fora do frasco e descartado no receptáculo de lixo mais próxima. </li></ol> 3. A concentração de queratina solução de extracção <ol><li> Encha banho rotodistiller para a linha superior com água destilada e ajustado para 90 ºC. Defina a velocidade de rotação de 200 rpm. Ligue o chiller-bomba de refrigeração e definir a -10 ºC. </li><li> Utilizando um medidor de pH para monitorizar o pH da KES, utilizar uma pipeta para adicionar lentamente DHAS 1 mM para o KES até atingir um pH de 7,0. Agita-se lentamente à medida que a solução é adicionada. </li><li> Despeje a KES neutralizada em 500 ml balão de fundo redondo até cerca trimestre completo. Execute o destilador de acordo com o fabricante doProtocolo para 1,25 h. <ol><li> Repetir o passo 3.3 até todo o KES foi destilada. O frasco que está ligado firmemente. </li></ol></li></ol> 4. Diálise de queratina solução de extracção <ol><li> Pour solução KES igualmente em 12 14 ml de tubos cónicos separadas. Centrifugar os tubos a 1050 xg durante 10 min. </li><li> Despeje a KES centrifugado para um copo limpo, certificando-se de deitar fora dos escombros recolhidos. Repetir até que todo o KES foi centrifugada. </li><li> Encha uma 2.000 ml cilindro graduado com água DI. </li><li> Corte de membrana de celulose tubulação de diálise a 24 polegadas, e prenda uma extremidade do tubo para mantê-la fechada. </li><li> Mergulhar o comprimento do tubo no interior do cilindro de água Dl para torná-lo mais flexível e mais fácil de abrir. </li><li> Abrir a extremidade não cortada da membrana de celulose tubo de diálise e lentamente verter 60 ml da solução KES centrifugado para o tubo. Use outro clipe para fechar esta extremidade do tubo. </li><li> Coloque o ditubo ANÁLISE no 2.000 ml cilindro de água DI e deixe descansar por 24 h. Mudar a água Dl no cilindro a cada 3 a 4 horas. </li><li> Após o período de 24 horas, esvaziar a solução KES dialisados ​​em frascos tapados, certificando-se de deixar espaço na parte superior e coloque no congelador a -20 ° C durante 24 h. </li></ol> 5. Liofilização de queratina solução de extracção <ol><li> Defina o liofilizador a -86 ºC. </li><li> Retirar os frascos contendo congelada KES do congelador, retire as capas dos frascos e colocá-los em ampolas liofilizador. Coloque as vedações nas ampolas e gire o botão para criar uma pressão de vácuo de 0,133 mbar. Liofilizar as amostras durante cerca de 48 horas, até que toda a umidade está desaparecido. </li></ol> 6. Preparação de Soluções de electrospinning (10% em peso de solução de queratina) <ol><li> Remover a queratina em pó a partir do liofilizador e pesá-lo. </li><li> Adicionar água Dl para o pó de queratina para criar a 10% peso / pesosolução de queratina. </li></ol> 7. Preparação de solução a 10% em peso de PCL <ol><li> Obter PCL (polímero ε-caprolactona, Mn 70-90 kDa), e trifluoroetanol (TFE). Prepara-se uma 10% em peso de PCL em TFE por agitação S / N e se obter uma mistura homogénea. </li></ol> 8. Preparação de Solução queratina / PCL <ol><li> Obter a solução de PCL a 10% em peso de solução previamente preparada e queratina 10% em peso. Adicionar queratina na gota solução PCL sábio, a fim de criar 10 ml PCL / soluções de queratina de 90:10, 80:20, 70:30 e 60:40 proporções. </li><li> Use um vortex para obter uma mistura homogénea de solução PCL / queratina antes eletrofiação. </li></ol> 9. Produção de electrospun PCL / fibra de queratina <ol><li> Colocar aproximadamente 8 ml da solução de PCL / queratina numa seringa descartável de 10 ml, equipado com um tubo de plástico de diâmetro 0,5 mm. Colocar a seringa numa bomba de seringa em que a taxa de fluxo é ajustado para ser 2,5 ml / h. </li><li&gt; Aplicar a tensão para a extremidade da agulha ligada ao tubo (~ posicionado 23 cm a partir da fibra de recolha do tambor, e ~ 30 graus a partir da horizontal). Aplicar um 19 - Tensão kV 22 ao tubo e girar o tambor colector em cerca de 200 rpm. <ol><li> Enrole o tambor colector com folha de alumínio antes de executar a amostra. Certifique-se de que a folha de alumínio é estável através da aplicação da fita de rotulagem em cada extremidade. Nota: As fibras irá formar na folha de alumínio (Ver Figura 2), armazenar a folha coberta de fibra à TA. </li></ol></li></ol> 10. Análise Mecânica de PCL / queratina nanofibras <ol><li> Cortar a amostra em 60 mm por 8 mm. Certifique-se de gravar a espessura usando micrômetro digital. Para cada uma das composições preparadas, usar cinco amostras. </li><li> Fixe a amostra de 60 x 8 mm para o testador de tração. Use um suporte de amostra projetado para anexar a amostra. Sanduíche da amostra entre suportes de amostra que é feita a partir de um cartão de índice usando duplofita de lado. Aplicar a célula 10 N de carga com uma taxa de deslocamento de 10 mm / min. Nota: O suporte de amostra foi projetado para ser 62 mm por 40 mm com uma janela interna de 50 mm por 38 mm. </li><li> extensão de registro e valores de carga por meio de software de acordo com o protocolo de software. </li><li> Calcule o estresse dividindo-se a força pela área da amostra testada. Em seguida, calcula-se dividindo a estirpe mudança no comprimento pelo comprimento inicial. </li><li> Gerar a curva de tensão-deformação traçando estresse em eixo y para o valor de tensão correspondente no eixo x. </li><li> Calcular o módulo de Young a partir da região linear onde inclinação é igual ao módulo de elasticidade. Determinar a força de tração do enredo estirpe estresse tomando 0,2 compensados ​​em estirpe% e desenhar uma linha paralela à curva região linear. </li><li> Realizar a análise estatística dos dados mecânicos obtidos em triplicado anteriormente utilizando a análise de variância usando software de análise 8. Valores de p &lt;0,05 nósestá considerado estatisticamente significativo. </li></ol> 11. Superfície Morfologia e Caracterização Estrutural <ol><li> Use microscópio electrónico de varrimento (SEM) com parâmetros de tensão de aceleração de 15 kV e corrente de 5 mA para observar a morfologia das fibras electrospun. <ol><li> Antes de imagem com SEM, cortar uma secção 2 cm2 da fibra e anexá-lo a um estágio SEM utilizando fita de cobre. Coloque a fase interior do revestidor por crepitação e revestimento com ouro a 15 mA durante 1 min e 30 seg para criar uma camada de ouro de aproximadamente 11 nm de espessura. Coloque a amostra na câmara do SEM. Observe as amostras de fibras. </li></ol></li><li> Use transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho (FTIR) para caracterizar a ligação química entre o PCL e queratina. Coloque o ponto 2 cm2 da membrana electrospun nanofibras em um suporte magnético e purgar o sistema com ar seco antes do teste. Obter espectros para 200 scans e analisar o espectro usando stasoftware ndard acordo com o protocolo de software. </li><li> Realizar análise de espectro usando o software padrão e usar triplicado de cada relação de nanofibras de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 12. Estudos de Interacção de fibra celular <ol><li> Fibras cortadas em 16 mm, duas amostras. Use um, à base de silicone cola biocompatível para corrigir cada amostra a lamelas com um diâmetro de 12 mm. </li><li> Cole uma extremidade da amostra de fibra para a parte de trás da lâmina de cobertura, embrulhar a amostra em torno da lamela, depois cola a extremidade livre da amostra para a parte de trás da lâmina de cobertura, bem como, deixando a parte superior do deslizamento coberto com apenas o amostra de fibra. </li><li> Coloque as amostras de fibras numa placa de 24 poços. Esterilizar as amostras por imersão em etanol a 80% durante 1 h. </li><li> Lavar o etanol a partir das amostras usando água Dl. Em seguida, pipeta de 2 ml de meio basal para as amostras, assegurando-se a cobrir a totalidade da amostra. Remover o meio após 5 min. </li><li> Use fibroblastos 3células T3 para semear as amostras de fibras. Suspender as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com antibióticos e soro bovino fetal a 10% (FBS), de modo que existem cerca de 62000 células / cm 2 por 1 ml de DMEM. </li><li> 1 ml da solução de MEMD contendo células 3T3 em cada placa de assegurar que cada amostra de fibra é coberto com cerca de 62000 células / cm2. Incubar o bem-placas durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: O uso de 5% de CO 2, porque esse nível pode normalmente manter o pH do meio celular no gama fisiológica para dia. </li></ol> 13. Degradação de nanofibras Matrix <ol><li> Corte seco / membranas de nanofibras de queratina PCL em quadrado aproximadamente 30 mm x 30 mm. </li><li> Esterilizar as amostras de 900 mm 2 com álcool 80% por um período de incubação de 10 min e lavar abundantemente com água DI. Incubar as amostras em 15 ml de PBS, pH 7,5, a 37 ° C. Substitua o buffer a cada 3 dias. </li><li> Tome as membranas fora da solução a intervalos especificados, 1 semana e 7 semanas, e enxaguar com água DI. </li><li> Coloque as amostras de membrana em ampolas liofilizador. Coloque as vedações nas ampolas e gire o botão para criar um vácuo. Liofilizar durante 24 horas, até que esteja completamente seco. </li><li> Fixe a amostra seca para um estágio SEM utilizando fita de cobre. Coloque a fase interior do revestidor por crepitação e revestimento com ouro a 15 mA durante 1 min e 30 seg. </li><li> Coloque a amostra na câmara do SEM. Observe as amostras de fibras a uma tensão de aceleração de 1,5 kV e 5 corrente mA. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Extracção de queratina do cabelo humano foi conseguida com sucesso. O ácido peracético actuou como um agente de oxidação sobre o cabelo humano, permitindo que a queratina a ser extraído pela base Tris. A produção de pó de queratina era pequena escala, devido ao facto de que só foi feito para fins de investigação. Este processo já foi estabelecido na indústria para a produção em larga escala. O objectivo de extrair a queratina em pequena escala foi para controlar a contaminação, a variabilidade do lote, e custo-efetivida...

Eletrofiação é reconhecido como um método predominante de realização nanofibras de polímero. As fibras podem ser produzidas em nanoescala e as propriedades das fibras são personalizada 1. Estes desenvolvimentos e as características de nanofibras electrospun têm sido especialmente interessante para suas aplicações em engenharia biomédica especialmente em engenharia de tecidos. As nanofibras electrospun apresenta semelhanças com a matriz extracelular e, portanto, promover a adesão celular, a migração e proliferação 2. Devido a esta semelhança com a matriz extracelular (ECM), fibras electrospun podem ser utilizados como materiais para auxiliar na limpeza de feridas, a entrega de drogas, e para tecidos de engenharia, tais como o fígado, ossos, coração, músculo e 3. Uma variedade de diferentes polímeros de origem sintética e natural foram usadas para criar fibras electrospun para diferentes aplicações de engenharia biomédica 4. Recentemente, tem vindo a crescer emteresse no desenvolvimento de nanofibras compostas por mistura sintética e polímeros naturais 4. Nestas composições os produtos finais tipicamente herdar a resistência mecânica associados com o polímero sintético, ao mesmo tempo que adopta pistas biológica e as propriedades do polímero natural. Nesta experiência, PCL e queratina são apresentados como os polímeros sintéticos e naturais, para serem utilizados para a síntese de um composto de nanofibras. A queratina é um polímero natural que se encontra no cabelo, lã e unhas. Ela contém muitos resíduos de aminoácidos; de interesse notável é cisteína 4,5. Idealmente um polímero de ocorrência natural seria biorenewable, biocompatível e biodegradável. Queratina possui todas estas três características, acentuando a proliferação celular e apego aos biomateriais tem sido incorporadas no 6. Policaprolactona (PCL) é um polímero reabsorvível, sintético que é significativo emengenharia de tecidos 4. Este polímero foi anteriormente reconhecida por sua estabilidade estrutural e mecânica, no entanto, carece de afinidade celular e exibe uma taxa de degradação longa. A natureza hidrofóbica de PCL é provavelmente responsável para a falta de afinidade de células 7. No entanto, PCL compensa suas limitações por ser altamente miscível com outros polímeros. A PCL / composite queratina deve demonstrar as propriedades mecânicas do PCL e incorporar as propriedades biológicas de queratina, tornando-o uma escolha ideal para várias aplicações biomédicas.

<table><tbody><tr><td>Cabelo Humano&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Obtido na barbearia local em Greensboro</td></tr><tr><td>Ácido peracético</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (polímero de e-caprolactona)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluoroetanol (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (TrizmaTM Base em pó)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99,9% cristalino</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lote 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Membrana de celulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa microscópio óptico de corte molecular</td></tr><tr><td></td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M Japão</td><td></td></tr><tr><td>microscópio eletrônico de varredura</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td></td></tr><tr><td>Máquina Shimadzu de mesa</td> japonesa <td>América do Norte Instrumentos analíticos e de medição Série AGS-X Série</td><td>AGS-X</td><td>Colômbia, MD</td></tr><tr><td>Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier</td><td>Bruker Tensor 2 Instrument&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Software</td><td></td><td></td> de origem <td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>Difração de raios X (XRD)</td> <td>Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffrattometer</td><td></td><td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblasto 3T3&nbsp; célula</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Student- Newman-Keuls teste post hoc</td><td>SigmaPlot 12 software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntese de nanofibras baseado em queratina de engenharia biomédica

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, devido à sua versatilidade e potencial para aplicações em vários campos, está a ser frequentemente utilizado para fabricar nanofibras. A produção destes nanofibras porosa é de grande interesse devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Aqui nós elaborar sobre a fabricação de queratina contendo poli (ε-caprolactona) (PCL) nanofibras (ou seja, PCL / fibra composta de queratina). queratina solúvel em água foi primeiro extraído a partir de cabelo humano e misturado com PCL em diferentes proporções. A solução combinada de PCL / queratina foi transformada em membranas nanofibrous usando um electrospinning laboratório concebido configurar. A morfologia das fibras e propriedades mecânicas do nanofibras obtidas foram observados e medidos através de microscopia eletrônica de varredura e testador de tração. Além disso, degradabilidade e químicas propriedades do nanofibras foram estudados por FTIR. MEV mostrou morfologia da superfície uniforme para fibras PCL / queratina de diferentes composições. Estes PCL / keratin fibras também mostrou excelentes propriedades mecânicas, tais como ponto de módulo e falha de Young. células de fibroblastos foram capazes de prender e proliferam, assim, provando boa viabilidade celular. Com base nas características acima discutidas, pode-se fortemente argumentam que as nanofibras de misturas de polímeros naturais e sintéticos podem representar um excelente desenvolvimento de materiais compósitos que podem ser usadas para diferentes aplicações biomédicas.

fibra Morfologia As imagens SEM das fibras foram obtidos para todas as composições de fibra. Ver Figura 3. Imagem Fibra confirma que as fibras são orientadas aleatoriamente. Ensaios mecânicos Mecanicamente fibras fortes são geralmente necessários para várias aplicações de engenharia de tecidos. Estas fibras devem manter força e flexibilidade suficiente e...

nanofibras electrospun têm uma área de superfície elevada em relação ao peso, a integridade mecânica excelente, e suportar o crescimento e proliferação celular. Estas nanofibras têm uma ampla gama de aplicações biomédicas. Aqui podemos fabricar queratina / nanofibras PCL, usando a técnica de electrospinning, e caracterizar as fibras para possíveis aplicações em engenharia de tecidos.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

O objetivo geral deste experimento é sintetizar e caracterizar nanofibras à base de queratina para aplicações biomédicas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de engenharia biomédica, como cicatrização de feridas, liberação de fármacos e tecidos engenheirados, como fígado, osso e músculo. A principal vantagem desta técnica é que ela é barata, eficiente e pode ser ampliada para produção em larga escala.A implicação desta técnica estende-se ao tratamento de feridas e à administração de fármacos para regeneração tecidual. Embora este método possa fornecer informações sobre a vantagem do uso de nanofibras eletrofiadas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a regeneração tecidual. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois é difícil preparar uma substância polimérica capaz de gerar nanofibras.Obtenha aproximadamente 20 gramas de recortes de cabelo humano que não tenham sido quimicamente tratados ou alterados. O cabelo pode ter qualquer comprimento. Lave bem o cabelo manualmente com água morna e sabão.Utilize água desionizada para a lavagem final. Coloque os cabelos em dois béqueres de 600 mililitros e coloque-os em uma estufa a 80 graus Celsius por uma hora. Após secagem, divida os cabelos secos uniformemente entre os béqueres de 600 mililitros, colocando 10 gramas de cabelo em cada béquer.Não permita que o cabelo ocupe mais de 500 mililitros. Em seguida, despeje 500 mililitros de solução de ácido peracético, ou PAS, em cada béquer, certificando-se de cobrir todo o cabelo. Cubra os béqueres com Parafilm e armazene por 12 horas.Se pare o cabelo do PAS usando uma peneira de 500 mícrons, coletando o PAS descartado em um recipiente separado. Enxágue bem o cabelo com água desionizada para remover qualquer resíduo de PAS. Após colocar o cabelo enxaguado em um frasco de 500 mililitros, despeje 400 mililitros de solução de Tris Base 100 milimolar, ou TBS, no frasco, certificando-se de que o cabelo esteja completamente coberto.Em seguida, coloque o frasco em um banho com agitação ajustado a 38 graus Celsius, 65 RPM, por uma hora. Após uma hora, retire o frasco do banho com agitação. Descarte o líquido, que corresponde a aproximadamente 400 mililitros de solução de extração de queratina, ou KES, em um béquer de 1000 mililitros.Despeje 400 mililitros de água desionizada no frasco contendo os cabelos, garantindo que os cabelos fiquem cobertos antes de colocar o frasco novamente no banho de agitação por uma hora. Retire o frasco do banho de agitação e despeje os 400 mililitros restantes do KES no béquer de 1000 mililitros com o KES previamente coletado. Os cabelos não são mais necessários e podem ser descartados no recipiente de lixo mais próximo.Após neutralizar o KES coletado conforme descrito no protocolo do texto, despeje a solução no balão de fundo redondo de 500 mililitros até cerca de um quarto da capacidade. Execute o destilador de acordo com o protocolo do fabricante por 1,25 hora, garantindo que o balão esteja firmemente conectado. Repita este processo até que todo o KES tenha sido destilado.Distribua igualmente a solução de KES destilada em 12 tubos cônicos separados de 14 mililitros. Centrifugue os tubos a 1.050 ×g por 10 minutos. Despeje o KES centrifugado em um béquer limpo, certificando-se de derramar afastado dos detritos acumulados.Repita até que toda a KES tenha sido centrifugada. Em seguida, corte a membrana de celulose do tubo de diálise com 24 polegadas de comprimento e prenda uma das extremidades do tubo para mantê-la fechada. Abra a extremidade não presa do tubo de diálise de membrana de celulose e despeje lentamente 60 mililitros da solução de KES centrifugada dentro do tubo.Use outro clipe para fechar esta extremidade do tubo. Coloque o tubo de diálise em um cilindro de 2.000 mililitros contendo água desionizada e deixe em repouso por 24 horas, trocando a água desionizada no cilindro a cada três a quatro horas. Em seguida, transfira a solução de KES dialisada para frascos com tampa, certificando-se de deixar espaço na parte superior.Coloque os frascos tampados em um congelador a menos 20 graus Celsius por 24 horas. Após o período de congelamento de 24 horas, retire as tampas dos frascos e coloque-os em ampolas para liofilização. Coloque as tampas nas ampolas e gire o botão para criar uma pressão de vácuo de 0,133 milibar.Liofilize as amostras por aproximadamente 48 horas até que toda a umidade desapareça. Prepare uma solução de queratina em PCL adicionando, gota a gota, uma solução de queratina a 10% em peso em uma solução de PCL a 10% em peso, de modo a obter soluções de 10 mililitros com proporções de PCL para queratina de 90 para 10, 80 para 20, 70 para 30 e 60 para 40. Coloque aproximadamente oito mililitros da solução de PCL/queratina homogeneizada por vortex em uma seringa descartável de 10 mililitros, equipada com um tubo plástico de diâmetro de 0,5 milímetro.Coloque a seringa em uma bomba de seringa onde a vazão é ajustada em 2,5 mililitros por hora. Aplique uma tensão na ponta da agulha conectada ao tubo. Aplique uma tensão de 19 a 22 quilovolts ao tubo e gire o cilindro coletor em torno de 200 RPM.Corte as fibras em amostras de 16 milímetros quadrados. Use uma cola biocompatível à base de silicone para fixar cada amostra em lamínulas com diâmetro de 12 milímetros. Cole uma extremidade da amostra da fibra no verso da lamínula e enrole a amostra ao redor da lamínula.Em seguida, cole a extremidade livre da amostra na parte traseira do lamínula também, deixando o topo do lamínula coberto apenas pela amostra da fibra. Coloque as amostras de fibra em uma placa de 24 poços. Esterilize as amostras imergindo-as em etanol 80% durante uma hora.Lave o etanol das amostras usando água desionizada. Em seguida, pipete 2 mililitros de meio basal sobre as amostras, certificando-se de cobrir completamente a amostra por cinco minutos. Utilize células fibroblásticas 3T3 para semear as amostras de fibra.Suspenda as células em DMEM, suplementado com antibióticos e 10% de soro bovino fetal, de modo que haja aproximadamente 62.000 células por centímetro quadrado por um mililitro de DMEM. Adicione um mililitro da solução de DMEM contendo as células 3T3 em cada poço da placa, garantindo que cada amostra de fibra fique coberta com aproximadamente 62.000 células por centímetro quadrado. Incube as placas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após cortar as membranas de nanofibras de PCL/queratina secas, esterilize as amostras de 900 milímetros quadrados com álcool a 80% durante um período de incubação de 10 minutos. Em seguida, lave bem as membranas com água deionizada. Depois, incube as amostras em 15 mililitros de PBS, pH 7,5, a 37 graus Celsius, substituindo o tampão a cada três dias.Retire as membranas da solução em intervalos especificados de uma semana e sete semanas. Enxágue com água deionizada. Coloque as amostras de membrana em ampolas para liofilizador.Coloque as tampas nas ampolas e crie um vácuo para liofilizar as amostras por 24 horas até ficarem completamente secas. Em seguida, fixe a amostra seca em uma platina de microscopia eletrônica de varredura, ou MEV, utilizando fita de cobre. Coloque a platina dentro do sputter coater e recubra com ouro a 15 miliampères por um minuto e trinta segundos.Carregue a amostra na câmara do MEV. Observe as amostras de fibras com uma tensão de aceleração de 1,5 quilovolts e uma corrente de cinco microampères. Imagens representativas de nanofibras à base de PCL/queratina obtidas com sucesso por eletrofiação a partir de soluções com proporções de PCL/queratina de 70 para 30, 80 para 20 e 90 para 10 são mostradas aqui.Descobriu-se que as fibras eletrofiadas possuem módulos de Young próximos ao do tecido nativo. Os módulos de Young diminuíram com o aumento da proporção de queratina. A figura exibe uma tendência gráfica da variação do módulo de Young em função da razão PCL/queratina.Os espectros de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier exibidos aqui confirmam a ligação do PCL à queratina. O pico principal, medido em 1.722 centímetros inversos, está de acordo com as medidas básicas padrão da banda de absorção do PCL e é visível em todos os espectros. A adesão e proliferação celulares nas fibras de queratina do PCL confirmam que as fibras não são tóxicas e oferecem suporte ao crescimento celular.O crescimento de filópodes ao longo das nanofibras indica uma interação favorável entre os fibroblastos e as fibras de PCL/queratina. Uma vez dominada, essa técnica de síntese de nanofibras pode ser realizada em 24 horas, se executada corretamente. Ao tentar o procedimento de eletrofiação, é importante lembrar-se da viscosidade da solução polimérica, da taxa de fluxo da solução, da voltagem aplicada, da velocidade do tambor rotativo e dos passos para o cultivo celular de fibroblastos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanofibras baseadas em PCL/queratina e sua importância no campo da engenharia biomédica. Após este procedimento, outros métodos, como testes de viabilidade celular e de degradação in vivo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a resposta de toxicidade aos tecidos, o crescimento tecidual e a degradação das fibras. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de engenharia regenerativa explorarem campos como regeneração da pele, cicatrização de feridas e liberação de fármacos.Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos, como TFE, e altas voltagens pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos de segurança, jalecos e luvas, bem como a correta eliminação dos solventes, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma abordagem eficiente para a preparação de nanofibras decorados com grupos funcionais capazes de interagir especificamente com as proteínas é descrito. A primeira abordagem requer a preparação de um polímero funcionalizado com o grupo funcional apropriado. O polímero funcional é fabricado em nanofibras por electrospinning. A eficácia da ligação das nanofibras com uma proteína é estudada por microscopia confocal.

Procedimento para a fabricação de nanofibras biofuncionais

Electrospun andaimes podem ser processados ​​de pós-produção para aplicações de engenharia de tecidos. Aqui descrevemos métodos para girar andaimes complexos (por fiação consecutivos), para fazer andaimes mais espessa (por camadas de multi-uso de calor ou vapor de recozimento), para atingir a esterilidade (produção asséptica ou pós-produção de esterilização) e adequadas para atingir as propriedades biomecânicas.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

Síntese e fabricação de fibras longas electrospun abrangendo uma área maior depósito através de um coletor recém-concebido a partir de um polímero biodegradável romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) foi relatado. As fibras eram capazes de suportar o crescimento de células derivadas de células-tronco pluripotentes.

Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar andaimes electrospun nanofibras com organização gradated de fibras e explorar suas aplicações na regulação da morfologia celular / orientação. Gradientes no que diz respeito às propriedades físicas e químicas dos scaffolds nanofibras oferecer uma ampla variedade de aplicações na área biomédica.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

Materiais poliméricos super-hidrofóbicos bidimensionais e tridimensionais são preparados por eletrofiação ou eletropulverização de polímeros biodegradáveis misturados com um polímero de menor energia superficial de composição semelhante.

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

Este manuscrito descreve o procedimento para fabricar e caracterizar as fibras de electrospun de Griffithsin-modificado poli (ácido lático-co-glicólico) que demonstram potente atividade antiviral e adesiva contra infecção por vírus da imunodeficiência humana tipo 1 em vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar a superfície e caracterizar a morfologia resultante, conjugação, e dessorção de Griffithsin superfície-modificado com fibras são descritos.

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

As inserções de cultura de tecidos com membranas plásticas são o padrão ouro em laboratórios de cultura de células como suportes permeáveis para estabelecer camadas celulares e modelos de tecidos de barreira. Aqui, apresentamos um método simples para substituir a membrana plástica por uma membrana mais biologicamente relevante feita de uma proteína de seda de aranha funcionalizada recombinante.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Aprenda a síntese de nanofibras de queratina/PCL por eletrofiação para engenharia de tecidos e cicatrização de feridas. Este método eficiente permite aplicações em liberação de fármacos e regeneração tecidual.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

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