Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

As plantas vasculares dependem de camadas extracelulares que funcionam como barreiras impermeáveis entre os tecidos vegetais e o ambiente externo. Essas estruturas associadas a células lipofílicas restringem infecções patogênicas e regulam o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas para dentro e para fora dos tecidos vegetais. Uma barreira importante é a cutícula vegetal, uma estrutura complexa exclusiva das plantas.

Cutina é um poliéster de glicerol lipídico insolúvel que constitui a matriz estrutural da cutícula e está associado a ceras extraíveis com solvente. Aqui apresentamos uma técnica confiável para analisar a composição de poliésteres lipídicos e reter tecidos vegetais deslipidados. Neste protocolo, amostras inteiras de tecido são coletadas, homogeneizadas e exaustivamente degradadas por uma série de extrações com solvente para remover lipídios solúveis em solvente, incluindo ceras cuticulares e epicuticulares.

Triglicerídeos nos lipídios da membrana. Em seguida, as amostras são despolicomerizadas em seus monômeros lipídicos constituintes por meio da metilólise catalisada por metóxido de sódio. São adicionados reagentes de simulação para transmetilar os grupos hidroxila em seus derivados correspondentes de trimetilcila, adequados para análise por cromatografia gasosa.

Os resíduos derivados são então transferidos para frascos de CG e carregados no A-G-C-M-S para análise, gerando um cromatograma que caracteriza a composição monomérica dos biopoliésteres presentes nas amostras extraídas. Aqui, coletamos amostras completas de folhas de plantas de arábidos do tipo selvagem e de dois mutantes maduros.

Para extração e análise, adicione 0,5 gramas de tecido em tubos de vidro limpos previamente lavados com clorofórmio. Coloque 100 mililitros de isopropanol em um frasco e adicione butil-hidroxi-tolueno até atingir uma concentração de 0,01%. O BHT é um antioxidante adicionado para proteger as ligações duplas e os ácidos graxos contra oxidação durante as extrações com solvente. Pré-aqueça o solvente em banho-maria a aproximadamente 85 graus.

Adicione 25 mililitros de isopropanol aquecido por grama de tecido vegetal e incube as amostras na câmara térmica a 85 graus por 15 minutos. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente com proteção auditiva e ocular. Por fim, homogeneíze as amostras com um homogeneizador para obter uma dispersão homogênea, feche os tubos com tampas de rosca e agite a 100 RPM por um a dois minutos, em seguida, centrifugue as amostras a 800 G por 10 minutos.

Para separar a fase orgânica dos materiais de maior densidade compactados no pellet, remova e descarte o sobrenadante utilizando um pipeta de Pasteur ou propipeta. Tenha cuidado para não perturbar o pellet. Adicione um volume igual de isopropanol à temperatura ambiente e agite as amostras durante a noite.

Centrifugue as amostras a 100 RPM e descarte o sobrenadante. Adiciono 25 mililitros de uma solução na proporção de dois para um de clorofórmio e metanol, por grama de tecido, e agito as amostras durante a noite, centrifugo e descarto a fase orgânica. Em seguida, repita este processo utilizando uma solução de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois.

Seque o pellet durante a noite e transfira os tubos da capela para um dessecador a vácuo contendo sulfato de cálcio anidro para desidratar as amostras por um período de pelo menos três dias ou até que a massa constante seja alcançada. Uma vez que as amostras estejam completamente secas, elas estarão prontas para defloração por metálise catalisada por metóxido de sódio. Adicione duas soluções de padrões internos aos tubos contendo tecidos secos usando uma seringa de vidro, começando com 25 microlitros de decanoato de metil HETO e 25 microlitros de pentecano omega e lactona.

Para iniciar a polimerização profunda, adicione 0,9 mililitros de acetato de metila às amostras, seguidos por 1,5 mililitros de catalisador de metóxido de sódio e 3,6 mililitros de metanol. Incube as amostras a 60 graus por duas horas com vortexagem periódica dentro do sistema de reação; os poliésteres lipídicos reagem com ânions metóxido nucleofílicos formando intermediários tetraédricos instáveis, que se dissociam prontamente em ácidos graxos, ésteres metílicos e ânions óxido. Esses óxidos são bases conjugadas e reagem com metanol, regenerando os ânions metóxido cataliticamente ativos, sustentando assim reações adicionais de polimerização profunda.

Se houver água no sistema, ela reagirá com o metóxido de sódio para formar hidróxido de sódio. Uma base forte que converte irreversivelmente poliésteres em ácidos graxos livres indesejáveis. Em vez de fas, para prevenir a hidrólise, o acetato de metila é adicionado para remover qualquer hidróxido de sódio presente no sistema.

Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente. Após a incubação, extraia os monômeros adicionando 10 mililitros de diclorometano a cada tubo. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de ácido acético glacial para acidificar as amostras.

Encha os tubos com solução de cloreto de sódio 0,5 molar, vortexe completamente e centrifugue por minutos. Sob a capela. Transfira cuidadosamente a fase orgânica inferior por meio de pipeta para tubos médios limpos e pré-lavados.

Lave as amostras novamente com solução salina, agite em vórtex e centrifugue por 10 minutos. Remova a fase aquosa superior, então adicione sulfato de sódio anidro às amostras como agente secante para remover traços de água remanescentes na solução; agite as amostras em vórtex, centrifugue e transfira o solvente para tubos pequenos limpos e pré-lavados. Coloque os tubos em um evaporador a nitrogênio para evaporar o solvente e obter resíduos secos de monômeros. Usando uma seringa de vidro, adicione 100 microlitros de purina e 100 microlitros de B-S-T-F-A para converter os grupos hidroxila em derivados voláteis de trimetilcila.

Incube as amostras a 100 graus por 10 minutos. Deixe os tubos esfriarem e evaporem sob gás nitrogênio. Adicione 500 microlitros de uma solução de HEPTANO e tolueno na proporção um para um para dissolver os resíduos vermelhos, que são então centrifugados brevemente.

Transfira as amostras derivatizadas para frascos de CG contendo inserções de 400 microlitros. Feche os frascos, carregue as amostras em um cromatógrafo a gás, que as injeta em uma coluna capilar para análise, e os eluatos são então detectados por um espectrômetro de massas em quadruplo. Os dados brutos obtidos pela análise de CG-EM são processados e apresentados como um cromatograma para cada amostra.

Monômeros individuais correspondentes a diferentes picos cromatográficos são identificados por seus espectros de massa específicos. Nos tempos de retenção da CG, as quantidades de monômeros individuais são determinadas usando o método do padrão interno de quantificação, permitindo comparações da abundância e composição de monômeros entre amostras. São mostrados aqui cromatogramas sobrepostos de análises representativas de monômeros, liberados de tecido foliar de abscesso de coelho correspondentes ao tipo selvagem e a dois alelos mutantes de um gene que codifica uma enzima mono-oxigenase P450, demonstrando perfis monoméricos distintos.

Nossos resultados demonstram diferenças significativas na abundância de três monômeros majoritários de cutina em plantas de arabidopsis selvagens e mutantes. Este protocolo é um método robusto para ensaiar a composição de poliésteres lipídicos vegetais mediante o isolamento, identificação e quantificação de seus monômeros constituintes. O procedimento é escalonável e pode ser facilmente adaptado para processar grandes quantidades de diversos materiais vegetais, incluindo raízes, sementes, folhas e outros tecidos inteiros.

Esta técnica é aplicável a estudos que investigam a regulação da biossíntese e a distribuição de cutina e suberina em plantas superiores.