Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

As plantas vasculares dependem de camadas extracelulares que funcionam como barreiras impermeáveis entre os tecidos vegetais e o ambiente externo. Essas células lipofílicas, enquanto estruturas associadas, restringem a infecção patogênica e regulam o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas para dentro e para fora dos tecidos vegetais. Uma barreira importante é a cutícula da planta, uma estrutura complexa exclusiva das plantas.

A cutina é um poliéster lipídico glicerol insolúvel que constitui a matriz estrutural da cutícula e está associada a ceras extraíveis por solvente. Aqui apresentamos uma técnica confiável para testar a composição de poliésteres lipídicos e segurar tecidos vegetais lipídicos. Neste protocolo, amostras de tecido total são colhidas, homogeneizadas e, exaustivamente, dilapidadas por uma série de extrações de solventes para remover lipídios solúveis em solvente, incluindo ceras cuticulares e epi particulares.

Triglicerol em lipídios de membrana. As amostras são então despolimerizadas em seus monômeros lipídicos componentes por óxido de metanfetamina de sódio catalisado por lise de metila. Os reagentes de simulação são adicionados aos grupos transmetilato hidroxila em seus derivados de células trimetil correspondentes adequados para análise cromatográfica gasosa.

Os resíduos derivados são então transferidos para frascos de GC e carregados em A-G-C-M-S para análise, gerando um cromatograma, caracterizando a composição monomérica dos biopoliésteres. Presente em amostras extraídas. Aqui colhemos amostras de folhas inteiras do tipo selvagem e dois mutantes de plantas maduras de arabidopsis ANA.

Para extração e análise, adicione 0,5 gramas de tecido aos tubos de vidro limpos que foram pré-enxaguados com clorofórmio. Coloque 100 mililitros de isopropanol em um frasco e adicione hidroxitolueno butilado a uma concentração de 0,01% O BHT é um antioxidante adicionado para proteger as ligações duplas e os ácidos graxos da oxidação durante as extrações por solvente. Pré-aqueça o solvente em banho-maria a aproximadamente 85 graus.

Adicione 25 mililitros de isopropanol aquecido por grama de tecido vegetal e incube as amostras no LOC de calor a 85 graus por 15 minutos. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente e com proteção para os ouvidos e olhos. Finalmente, triture as amostras com um homogeneizador para obter uma dispersão homogênea dos tubos de vedação com tampas de rosca e agite a 100 RPM para uma a duas amostras de centrífuga a 800 G por 10 minutos.

Para separar a fase orgânica dos materiais de maior densidade compactados no pellet, remova e descarte o sobrenadante usando um Pasteur ou propent. Tenha cuidado para evitar perturbar o pellet. Adicione um volume igual de isopropanol à temperatura ambiente e agite as amostras durante a noite.

A 100 RPM, centrifugar as amostras e rejeitar o sobrenadante. Eu adiciono 25 mililitros de uma solução dois para um de clorofórmio, metanol, pergrama de tecido e agito as amostras durante a centrífuga durante a noite e descarto a fase orgânica. Em seguida, repita esse processo usando uma solução de metanol de clorofórmio de um a dois.

Secar o pellet durante a noite e transferir os tubos da hotte para um dessecador a vácuo contendo sulfato de cálcio anidro para desidratar as amostras durante um período de pelo menos três dias ou até se atingir uma massa constante. Uma vez completamente secas, as amostras estão prontas para defloração por metálise catalisada por óxido de metanfetamina de sódio. Adicionar duas soluções de padrões internos aos tubos contendo tecidos secos usando uma seringa de vidro, começando com 25 microlitros de decanoato de metila HETO e 25 microlitros de ômega pentec e lactona.

Para iniciar a polimerização profunda, adicione 0,9 mililitros de acetato de metila às amostras, seguido por 1,5 mililitros de catalisador de óxido de metanfetamina de sódio e 3,6 mililitros de metanol. Incubar amostras a 60 graus por duas horas com vórtice periódico dentro do sistema de reação, os poliésteres lipídicos reagem com ânions nucleofílicos de óxido de metanfetamina para formar intermediários tetraédricos instáveis, que prontamente se dissociam em ácidos graxos, ésteres metílicos e ânions de óxido. Esses óxidos a são bases conjugadas e reagem com o metanol regenerando os ânions IDE de metanfetamina catalisamente ativos, sustentando assim reações adicionais de polimerização profunda.

Se houver água no sistema, ela reagirá com o óxido de metanfetamina de sódio para formar hidróxido de sódio. Uma base forte que converte irreversivelmente poliésteres em ácidos graxos livres indesejáveis. Em vez de fas para evitar a hidrólise, o acetato de metila é adicionado para remover qualquer hidróxido de sódio dentro do sistema.

Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente. Após a incubação, extraia os monômeros adicionando 10 mililitros de dicloreto de metileno a cada tubo. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de ácido glacial para acidificar as amostras.

Encha os tubos com solução de cloreto de sódio 0,5 molar, vortex completamente e centrifugue por minutos. Sob a hotte. Transfira cuidadosamente a fase orgânica inferior por pipeta para tubos limpos pré-enxaguados de tamanho médio.

Lave as amostras novamente com solução salina em vórtice e centrifugue por 10 minutos. Remova a fase aquosa superior e, em seguida, adicione sulfato de sódio anidro às amostras como agente de secagem para remover vestígios de água remanescentes na centrífuga de amostras de vórtice de solução e transfira o solvente para limpar tubos de tamanho pequeno pré-enxaguados, carregue os tubos em um evaporador de nitrogênio para evaporar o solvente e obter resíduos secos de monômeros. Usando uma seringa de vidro, adicione 100 microlitros de purina e 100 microlitros de BSTFA para converter grupos hidroxila em derivados voláteis de células trimetil

Incube amostras a 100 graus por 10 minutos. Deixe os tubos esfriarem e evaporarem sob gás nitrogênio. Adicione 500 microlitros de uma solução de tolueno HEPTANO um-para-um aos resíduos de dissolução vermelha, que são então centrifugados brevemente.

Transfira amostras derivadas para frascos de GC contendo inserções de 400 microlitros. Colocar as amostras de carga dos frascos num cromatógrafo gasoso, que as injecta numa coluna capilar para análise, o eluato é então detectado por espectrómetro de massa quádruplo. Os dados brutos adquiridos pela análise GCMS são processados e apresentados como um cromatograma para cada amostra.

Monômeros individuais correspondentes a diferentes picos cromatográficos são identificados por seus espectros de massa específicos. Nos tempos de retenção de GC, as quantidades de monômeros individuais são determinadas usando o método de quantificação padrão interno, permitindo comparações da abundância e composição de monômeros entre amostras. Aqui são mostrados cromatogramas de sobreposição de análises representativas de monômeros, liberados de um tecido foliar de abscesso de coelho correspondente ao tipo selvagem e dois alelos mutantes de um gene que codifica uma enzima monooxigenase P quatro 50 demonstrando perfis monoméricos distintos.

Nossos resultados demonstram diferenças significativas, a abundância de três principais plantas de cutina, monômeros e arabidopsis selvagens e mutantes. Este protocolo é um método robusto para testar a composição de poliésteres lipídicos vegetais pelo isolamento, identificação e quantificação de seus monômeros constituintes. O procedimento é escalável e pode ser facilmente adaptado para processar grandes quantidades de vários materiais vegetais, incluindo raízes, sementes, folhas e outros tecidos inteiros.

Esta técnica é aplicável a estudos que investigam a biossíntese, regulação e distribuição de cutina e suberina em plantas superiores.