Name: Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a isolar e analisar monômeros de poliésteres lipídicos da cutícula vegetal usando extração sequencial e GC-MS. Este método permite estudar a composição da cutina em diferentes espécies e mutantes de plantas.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC)-USRA para S.J. e por uma bolsa NSERC-Discovery para I.M. Agradecemos a Richard Bourgault, Meghan Rains e Amanda Fluke pela assistência técnica. Sementes de mutantes att1-1 e att1-2 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jian-Min Zhou, Instituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento, Pequim, China.

Nota: Este protocolo foi adaptado de Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et ai. (2013) 7,10,11. Passos 1-5 são sumariados na Figura 1. Deslipidação 1. Tissue Nota: Sempre lavar todos os vidros e tampas com clorofórmio, deixando secar sob exaustor, antes de usar. CUIDADO: Executar homogeneização do tecido e todas as etapas de transferência solvente sob exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial para evitar o contato direto com produtos químicos e para proteger as amostras de contaminação. <ol><li> Banho de água Pré-aqueça e bloco de calor a 85 ° C. </li><li> Pesar aproximadamente 0,5 g de cada amostra de folha em 20 mm x 125 mm tubos de ensaio de vidro previamente pesado com politetrafluoretileno (PTFE) tampas de rosca -faced. Incluem quatro repetições por amostra. </li><li> Coloque 2-propanol num balão de Erlenmeyer (cerca de 125 ml; 25 ml por g de SAMPle). Adicionar 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (também conhecido como hidroxitolueno butilado, BHT) para uma concentração final de 0,01% (w / v). Nota: Adicionar BHT a partir de um 5% (w / v) de solução de reserva em metanol (BHT ajuda a minimizar a oxidação de ácidos gordos insaturados). </li><li> Pré-aqueça solução de 2-propanol a 85 ° C em banho de água. </li><li> Adicionar 12 ml de solvente quente de 2-propanol para cada tubo de amostra e calor durante 15 min a 85 ° C em bloco de calor. Este passo inativa lipases que podem ser libertadas a partir de células rompidas. </li><li> Deixe os tubos arrefecer até à temperatura ambiente e triturar o tecido cuidadosamente com homogeneizador até obter uma suspensão homogénea. </li><li> Coloque as amostras num agitador orbital e agitar durante 1-2 horas a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 2-propanol e agita-se durante 12 horas à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 12 ml de CHCl 3: CH3OH (2: 1, v / v) até ao resíduo (25 ml por g de amostra) e agitar durante a noite a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 12 ml de CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) até ao resíduo e agitar durante a noite a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e remover o solvente. </li><li> Deixe secar amostras sob exaustor durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Secar o resíduo e, em seguida, colocar-se num exsicador de vácuo sobre CaCl2 anidro ou CaSO4 até peso constante (3-5 dias). </li></ol> 2. A despolimerização: metanólise com metóxido de sódio (Figura 2) ATENÇÃO: Siga as etapas 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 e 2,17-2,18 sob exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial. <ol><li> Pré-aqueça o bloco de calor a 60 ° C. </li><li> Pesar tubos de ensaio contendo o resíduo seco (importante para cálculos posteriores). </li><li> Adicionar padrões internos a cada tubo: 25 ωL heptadecanoato de metilo (1 mg / ml) e 25 ul ω-pentadecalactone (1 mg / ml de stock). </li><li> Adicionar 0,9 ml de acetato de metilo, 1,5 mL de metóxido de sódio, e 3,6 ml de metanol a cada tubo e cap-los. Em alternativa, preparar uma mistura de reacção com estes três reagentes e adicionar alíquotas de 6 ml para cada amostra. </li><li> Amostras de calor durante 2 horas a 60 ° C e periodicamente vórtice em intervalos de 15 min. </li><li> Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 10 ml de dicloreto de metileno (CH 2 Cl 2) e 1,5 ml de ácido acético glacial para extrair os ésteres metílicos dos ácidos gordos. </li><li> Adicionar uma solução salina (NaCl 0,5 M) para encher cada tubo e a tampa. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 10 min a 800 x g. </li><li> Transferir a fase orgânica (inferior) para limpar tubos de tamanho médio (16 x 125 tubos de ensaio de vidro com poli mmtetrafluoroetileno (PTFE) tampa de rosca -faced). </li><li> Adicionar uma solução salina (NaCl 0,5 M) para encher cada tubo e a tampa. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 10 min a 800 x g. </li><li> Remover fase aquosa (superior) e repita os passos de 2,11-2,12. </li><li> Remova toda a fase aquosa (superior). </li><li> Adicionar sulfato de sio anidro (Na 2 SO 4) para o solvente, tampão, e os tubos de vórtice durante 1 min; amostras pode agora ser deixada até ao dia seguinte. A esta amostras ponto pode ser deixada durante a noite sob a coifa. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg para compactar o Na 2 SO 4 sal na parte inferior. </li><li> Transferir a fase orgânica para um tubo de vidro descartável pequena (13 x 100 mm tubos de ensaio de vidro com politetrafluoroetileno (PTFE) com tampa de rosca -faced). </li><li> Evaporar o solvente à secura sob azoto e avançar para a etapa de derivação. Se não processado imediatamente, armazenar evaporada amostras a -20 ° C (amostras pode ser umlso armazenado antes do passo de evaporação). </li></ol> 3. Preparação de Derivados de Cromatografia Gasosa ATENÇÃO: Siga as etapas 3.1.2 e 3.1.5 - 3.1.8 sob um exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial. <ol><li> Derivados trimetilsilílicos <ol><li> Pré-aqueça o bloco de aquecimento a 100 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de piridina e 100 ml de BSTFA (N, O-bis-trimetilsilil-trif luoroacetamida) a cada tubo e cap-los. </li><li> Amostras de aquecer a 100 ° C durante 10 min. </li><li> Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. </li><li> Evapora-se as amostras sob azoto à temperatura ambiente. Evitar a aplicação de calor para amostras, os monómeros são altamente voláteis, nesta fase. </li><li> Adicionar 500 ul de 1: 1 (v / v) de heptano: tolueno. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 2 min a 800 x g. </li><li> Adicionar amostras para frascos de GC e proceder à análise GC / MS. </li></ol></li><li> Acetilderivados Nota: Para acetilação, modificar passos 3.1.1-3.1.3 acima da seguinte forma (não mostrado na vídeo); os passos 3.1.4-3.1.8 são os mesmos: <ol><li> Pré-aqueça o bloco de calor a 60 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de piridina e 100 ul de anidrido acético (Ac2O) para os tubos. </li><li> Amostras de calor 1 hora a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Análise <ol><li> Usar uma coluna HP-5 capilar (30 mx 0,25 mm de espessura x 0,25 uM filme) ou equivalente (isto é., 5% de difenilo, 95% de dimetil polisiloxano). Programa de GC com o fluxo de gás transportador hélio fixado em 1,5 ml / min e a temperatura do forno programado para 150 a 300 ° C a 3 ° C / min. </li><li> Use injeção de divisão (split proporção de 1:10) e definir espectrômetro de massa modo para digitalizar mais de 40-600 amu (elétron impacto de ionização). </li><li> Criar uma tabela de seqüência incluindo solvente (em branco), WT e mutantes repetições, cada um usando o método de análise cutin indicado. </li><li> Carga de solventee frascos de amostra sobre o carrossel, adicione-hexano para frascos de lavagem de seringas no amostrador automático, se necessário, e iniciar a sequência. Após a sequência estiver completa, dadas vestígios cromatograma iónico estão disponíveis para todas as amostras. </li></ol> Análise 5. Dados <ol><li> Identificar monómeros de poliéster lipídico comparando espectro de massa de cada pico de espectros de massa publicado ou pesquisando uma biblioteca comercial, se disponível. </li><li> Para cada um dos picos identificados no cromatograma total de corrente de iões, utilizar os seus respectivos tempos de retenção para encontrar as áreas na tabela de resultados de integração a partir do software GC / MS (Figura Suplementar 1). </li><li> Para cada monômero (colunas AB), adicione os valores de área encontrados na tabela de integração (Figura Suplementar 1, coluna D) para a coluna correspondente para cada replicar amostra na tabela Excel de monómeros (Supplemental Arquivo 2, colunas CF), que é uma folha de cálculo para quantificar Arabidopsisderivados cutin EAS. Use Suplementar Arquivo 3 se derivados acetilados são preparados em vez disso. </li><li> Adicione as áreas das normas internas (SI) para as colunas é (HK). Para os monómeros que não são derivatizados, ésteres metílicos ou seja, ácidos gordos (FAMEs), e os ésteres de dimetilo do ácido dicarboxilicos (DCA EMDs), utilizar 17: 0 FAME (IS1) como IS para a quantificação (células roxo-protegida na tabela de monómero; Suplementar Arquivos 2/3). Para monómeros hidroxilados, incluindo álcoois primários, ácido ferúlico e ácidos ω-hidroxi, utilizar 15: 0 15-hidroxi FAME (IS2), como é de escolha para a quantificação composto (células verdes-shadded na tabela de monómero; Suplementar Arquivos 2/3) . </li><li> Adicione peso folha seca para cada replicar para colunas AX-BA (Supplemental arquivo 2) ou AQ-AT (Supplemental Arquivo 3); alternativamente, digitalizar folhas de calcular áreas de superfície e adicionar valores de área para a mesa de monômero para expressar cargas de monómeros por unidade deárea de superfície. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao contrário de outros biopolímeros, tais como proteínas e ADN, poliésteres planta de lípidos não são feitas a partir de um molde. Em vez disso, as composições dependem da especificidade das enzimas presentes nos tecidos que formam estes polímeros extracelulares. Como tais análises, química do componente de componentes são essenciais para compreender a composição de poliéster de lípidos. Os métodos químicos para clivar ligações éster incluem saponificação, hidrogenólise, transmetilação catalisada por ácido, e catalisada por base transmetilação 2. Cada um deles tem vantagens e desvantagens. Saponificação produz ácidos gordos hidroxi livres que podem sofrer reações secundárias. A hidrogenólise com hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) 16 foi utilizado para a análise cutina 7. A hidrogenólise reduz carbonos funcionalizados para álcoois e as estruturas originais precisam de ser inferida por deuteriolysis com deutereto de alumínio e lítio (LiAlD 4). odesvantagem desta abordagem é a exigência de alta resolução GC / MS para comparar o grau de deuteriation dos polióis gordos obtidos para fazer atribuições das suas estruturas. Transesterificação catalisada por ácido com metanol trifluoreto de boro (BF3) tem sido freqüentemente utilizada em cutina e suberina depolymerizations 8,17,18, mas o reagente tem uma vida útil limitada e pode introduzir artefactos devido a reacções secundárias 15. Ácido sulfúrico metanólico também produz ésteres metílicos dos monómeros mas com maiores proporções de ácidos gordos de 2-hidroxi, que presumivelmente não são verdadeiros componentes de poliéster lípido, em comparação com outros métodos 10. O método de transesterificação catalisada NaOMe descrito neste protocolo produz ésteres metílicos de ácidos gordos que são derivatizados por sililação de grupos hidroxilo, fornecendo espectros de massa característico para a identificação, ou por acetilação para proporcionar derivados mais estáveis ​​de grupos hidroxilo foR quantificação. Uma desvantagem desta técnica é que a hidrólise compete com a transesterif icação, quando a água está presente na reacção. A água reage com NaOMe (o catalisador) e produz NaOH, que por sua vez hidrolisa ésteres metílicos de ácidos gordos para se obter os ácidos livres (Figura 2D). Esta é uma reacção colateral indesejável porque dois picos irá estar presente para cada ácido gordo: um éster de metilo e um derivado de éster TMSi, complicando assim a análise. Usando reagentes anidros e a adição de acetato de metilo como um co-solvente para competir com saponificação são assim passos cruciais para prevenir a hidrólise (Figura 2D). Cutin e suberina conter entre 1 e 26% de glicerol 4. No entanto, este monómero não será detectado por as condições experimentais descritas neste protocolo. O glicerol é altamente hidrofílico e, ao contrário dos monómeros de éster de metilo de ácidos gordos, será eliminada durante os passos de solvente de lavagem aquosas. Esta limitação também umpplies a outros métodos de despolimerização cutina, glicerol, mas pode ser determinada na camada aquosa obtida após transesterificação utilizando um método enzimático. Alternativamente, ele pode ser quantificada usando condições mais suaves (por exemplo., 0,05 M NaOMe) sem nova extracção da água para detectar todos os monómeros, incluindo glicerol 19,20 .Embora útil para a finalidade de quantificação glicerol, condições suaves geralmente dar incompleto de despolimerização e cutina suberina. Se um GC acoplado a um detector de ionização de chama (FID) está disponível, todas as repetições podem ser analisados ​​no presente instrumento, para fins quantitativos, depois de picos de uma amostra representativa foram identificados por GC / MS. Como alternativa, os monômeros em GC / FID traços podem ser identificados, se os seus índices de retenção são conhecidos. O detector de ionização de chama tem especialmente elevada sensibilidade e uma ampla gama de proporcionalidade, que é crítica para a quantificação de componentes principais e secundárias amostrasem corridas individuais. Além disso, é robusto e fácil de manter e operar 15. O protocolo descrito permite a fiável e reprodutível isolamento, identificação e quantificação dos monómeros de poliéster de lípidos de plantas, permitindo a caracterização de mutantes química que diferem na composição de um ou mais monómeros de poliéster de lípidos. O procedimento é expansível, ele pode ser facilmente adaptada para processar tanto pequenas quantidades a granel e de diversos materiais de planta, incluindo sementes, raízes, folhas, caules e flores. Dados de espectrometria de massa de monómeros de poliéster de lipídios de muitas espécies têm sido publicados por ex., 21-26 e constituem recursos valiosos para identificar monómeros desconhecidos quando adaptar este protocolo para outros tecidos e / ou espécies. Este método é aplicável para a biossíntese de investigações, regulação e de distribuição de poliésteres de lípidos em plantas superiores.

As plantas vasculares confiar em camadas extracelulares, que funcionam como barreiras impermeáveis ​​entre os tecidos de plantas e o ambiente externo. Estas estruturas associadas da parede celular lipofílico restringir a infecção patogénica e regular o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas dentro e para fora dos tecidos da planta 1. Tais barreiras são a cutícula da planta, uma estrutura única para plantas sinapomórficas 2, e barreiras de difusão diferentes contendo suberina. A cutícula é uma camada oleofï¿½lico sintetizado por células epidérmicas e ligado a eles por meio de uma camada péctico no lado extracelular da parede celular 3-5. É encerra os órgãos aéreos primárias de plantas superiores, funcionando como uma interface vital entre tecidos da planta e do meio ambiente. Cutina, a matriz estrutural da cutícula, e suberina são dois poliésteres glicerolípido insolúveis associadas com ceras solvente 2,4-extraíveis. Estes l poliméricoIPIDs são compostas de derivados de ácidos gordos saturados e insaturados e de ambos são estruturalmente e funcionalmente semelhante. No entanto, eles são distinguíveis por diferentes características de sites de composição e deposição química. Suberina é um poliéster alifático localizado no interior das paredes das células de certos tecidos internos e externos que formam uma parede secundária. Tecidos suberizadas incluem periderms de raízes, tubérculos e casca de árvore, endoderme raiz, camadas de revestimento de sementes, e feridas curadas 2. Ao contrário cutina, o poliéster suberina tipicamente contém álcoois, ácidos dicarboxílicos saturados e mono-insaturados, e uma grande proporção de monómeros de cadeia muito longa (C≥20). Cutina é o mais abundante poliéster lípido em plantas vasculares 6, e é composto de glicerol e C16-C18 derivados de ácidos gordos interesterificada, tais como ácidos gordos hidroxi e hidroxi-4 epóxi substituído. Embora a composição de polímeros cutinavaria entre espécies tracheophyte, os monómeros primários mais predominantes são de 10, 16-di-hidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi-18: 0, e 9,10,18-tri-hidroxi-18: 0 ácidos gordos. Curiosamente, folha de Arabidopsis e cutina haste é composta principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8. Cutículas vegetais também apresentam uma considerável variabilidade em espessura, variando de poucos nanómetros a vários micrómetros 9. Uma vez que o isolamento cutícula é uma etapa trabalhosa e demorada, especialmente para cutículas folha muito fina, tais como aqueles da Arabidopsis thaliana 8, os métodos que não utilizam o isolamento cutícula foram desenvolvidos e validados 7,8. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para o estudo da composição de monómero de cutina em folhas de Arabidopsis thaliana por metóxido de sódio (NaOMe) catalisada por despolimerização e subsequente cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa (GC / MS) análise. Este protocolo oferece um método robusto para ensaiar a composition de poliésteres planta de lipídios nos tecidos delipidadas inteiros, e foi adaptado a partir de protocolos previamente relatados 7,10,11. Amostras de tecido integrais são primeiro homogeneizado e exaustivamente delipidadas, removendo lipídios solventes extraível incluindo cuticular e ceras epicuticulares, lípidos da membrana, e triacilgliceróis. Enriquecida resíduos de parede celular são então despolimerizados em seus constituintes monómeros de éster de metilo por metanólise catalisada por metóxido de sódio. Ésteres metílicos dos ácidos gordos são extraídos por acidificação, e os seus derivados para obter trimetilsililo ou acetilo derivados correspondentes. Resíduos derivatizados são altamente voláteis, e podem ser eluídas a partir de uma coluna de cromatografia em fase gasosa a uma temperatura razoável, sem alterar a sua conformação estrutural durante a análise de GC / MS.

<table><tbody><tr><td>Produtos químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvente para deslipidação</td></tr><tr><td>Sulfato de sódio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Agente de derivatização</td></tr><tr><td>BSTFA (N, O-bis (trimetilsilil) -trifluoroacetamida)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Agente de derivatização</td></tr><tr><td>Hidroxitolueno butilado (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidante</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Agente de dessecação</td></tr><tr><td>Suflico de cálcio, anidro (DRIERITE- 8 MESH com indicador)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Agente de dessecação</td></tr><tr><td>Clorofórmio (Triclorometano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Agente de acidificação</td></tr><tr><td>Gás transportador de hélio, ar comprimido</td><td>Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Gás transportador, GC / MS</td></tr><tr><td>Heptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Hexanos</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Solvente orgânico, reativo à transmetilação</td></tr><tr><td>Acetato de metila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Heptadecanoato de metila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Padrão interno (estoque de 1mg/mL)</td></tr><tr><td>Dicloreto de metileno (diclorometano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Nitrogênio, comprimido</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Gás de arraste, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactona</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Padrão interno (1 mg/ml de estoque)</td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvente para derivatização</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Solução salina BP358212</td><td></td></tr><tr><td>Metóxido de sódio (25%%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleófilo</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td>para Crescimento de Plantas</tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX é recomendado para o cultivo de plantas Arabidopsis (Eddy, R. e Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Métodos Purdue para Crescimento de Arabidopsis.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cúpula de Umidade PermaNest</td><td>Solução do Produtor, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de Plantas Perma-Nest (22x11in)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vasos quadrados para estufas, 3,5 polegadas&nbsp;</td><td>Solução do Produtor, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizante de Planta de Propósito Geral, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm tubo de ensaio de vidro com tampa de rosca de Teflon</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de vidro de 16 x 125 mm com tampa</td> <td>de rosca de TeflonKimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de vidro de 20 x 125 mm com tampa de rosca com face de Teflon</td> Tampas de frascos de GC <td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>Microinserções de frascos de GC</td><td></td><td></td> de C400051A National Scientific National Scientific C4011631 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Frascos de GC National Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>pipetas pasteur descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dançarina</td><td></td><td></td> <td>do ventreUm shaker pode ser usado para este fim se a dançarina do ventre não estiver disponível</td></tr><tr><td>DB-5 Coluna capilar GC</td><td>J& W Scientific, CA, EUA; &nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu; m espessura do filme</td></tr><tr><td>Dessecador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT único espectrômetro de massa quadupolo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador</td><td></td><td></td><td></td>de nitrogênio</tr><tr><td>Polytron homogeneizador</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo a gás Trace 1300</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulador de dois estágios</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e composicional análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster monómeros

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

As plantas terrestres produzem biopoliésteres alifáticos extracelulares que modificam as paredes celulares de tecidos específicos. As células epidérmicas sintetizam cutina, um poliéster de glicerol e ácidos graxos modificados que constitui a estrutura da cutícula que cobre as superfícies aéreas das plantas. A suberina é um poliéster lipídico relacionado que é depositado nas paredes celulares de certos tecidos, incluindo a endoderme radicular e a periderme dos tubérculos, cascas de árvores e raízes. Esses polímeros lipídicos são altamente variáveis em composição entre as espécies de plantas e geralmente diferem entre os tecidos dentro de uma única espécie. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para estudar a composição monômera da cutina em folhas de Arabidopsis thaliana por despolimerização catalisada por metóxido de sódio (NaOMe), derivatização e subsequente análise de cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC / MS). Este método pode ser utilizado para investigar os monómeros de poliésteres insolúveis isolados de tecidos vegetais inteiros deslipidados contendo cutina ou suberina. O método pode ser aplicado não apenas para caracterizar a composição de polímeros lipídicos em espécies não analisadas anteriormente, mas também como uma ferramenta analítica em abordagens genéticas diretas e reversas para avaliar a função do gene candidato.

O protocolo descrito no presente manuscrito está configurado para determinar monómeros de poliéster de lipídios, minimizando as contribuições de lípidos não Cutin 10 Figura 1 apresenta uma visão geral do ensaio, que toma por completo entre 8 (ie, cutin ou suberina.) -. 10 dias (a partir de colheita de tecido inicial a obtenção de dados de GC), dependendo de quanto tempo as amostras são deixadas a secar. A metanólise catalisada por base seleccionada (Figura 2) Método para despolimerizar poliésteres foi previamente validado para as sementes de Arabidopsis, que contêm tanto cutina e suberina. Os tecidos são homogeneizados e exaustivamente primeiro delipidada para remover lípidos de solventes extraíveis. O rendimento resíduo após a extração, como porcentagem do peso fresco inicial, é normalmente de 6% para A. thaliana Col-0 folhas. Enriquecida resíduos de parede celular são secos num exsicador de vácuo e, em seguida, nos seus constituintes despolimerizado monómeros de éster de metilo decatalisada por base transmetilação. Duas horas de incubação foi escolhido como o tempo necessário para a despolimerização crítica e recuperação de componentes de poliéster de lípidos adequada. Tempos de incubação mais longos resultou em aumento de ácidos 2-hidroxi; estes potencialmente derivar de esfingolípidos membrana 10. Um cromatograma típico de Arabidopsis do tipo selvagem se cutina folha é mostrada na Figura 3, para derivados S -TMSi éter (Figura 3A) e derivados de O-acetil (Figura 3B). Cada pico foi identificado por comparação com os espectros de massa a partir da literatura 7,8 e uma base de dados pública 12 .O nosso protocolo de vídeo mostra como preparar derivados de TMSI, mas as amostras podem, alternativamente, ser acetilado para derivatizar grupos hidroxilo. Derivados silanisados ​​são bons para fins de identificação, porque eles dão espectros de massa de diagnóstico. No entanto, os derivados acetilados são mais estáveis ​​e uma boa alternativa para a sililaçãomonômeros uma vez foram identificados 10. Para ajudar a implementar esse protocolo em laboratórios que têm apenas GC acoplado ao detector de ionização de chama (FID), GC / FID traços correspondentes a derivativos acetilados de WT monómeros folha cutina e para uma série homólogo de normas metílicos dos ácidos gordos éster são também mostrados (Figura Suplementar 4). Este método é qualitativa e detecta diferenças quantitativas entre amostras, daí o seu valor para a análise mutante. As quantidades de monómeros individuais são determinadas usando o método do padrão interno de quantificação, permitindo comparações de abundância monómero entre as amostras. Deve esclarecer-se, no entanto, que o tamanho de pico (contagens totais de iões) podem não coincidir com as razões molares dos monómeros do poliéster. Estamos incluindo tabelas editáveis ​​de monômeros para calcular os montantes de monômero em folha Arabidopsis cutin como ésteres de ácidos gordos e derivados metílicos EAS (Supplemental arquivo 1), ou ace<html> Tyl (Supplemental derivados de arquivo 2) de álcoois. Estas tabelas podem ter de ser adaptados se amostras são extraídas a partir de órgãos ou de diferentes espécies de plantas. Como exemplo, temos analisado Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) folhas de tipo selvagem e dois alelos nulos-mutante anteriormente caracterizados do gene CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) e att1-2 (m-2 ) 13,14. Monooxigenases do citocromo P450 da subfamília CYP86A codificar supostos co-oxidases e participe de suberina e cutina biossíntese monômero. Os nossos resultados (Figura 4) demonstram as reduções significativas na quantidade de três principais monómeros lipídicas nas folhas mutantes em comparação com as folhas WT. Consistente com a função da enzima previsto, 16: 0, 18: 2, e 18: 1 dicarboxilatos foram especificamente afectados em mutantes ATT1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visão geral da análise de poliéster lipídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figura 2. Mecanismo de transmetilação NaOMe a reacção catalisada. Os aniões metóxido nucleofílicos atacar o carbono cabonyl de poliésteres lipídicos para formar um intermediário tetraédrico instável (A), que dissocia-se facilmente em ésteres metílicos de ácidos gordos e de alcóxido aniões (B). Estes alcóxidos são bases conjugadas, e reagir com metanol, regenerando os aniões metóxido cataliticamente activas, sustentando assim as reacções de despolimerização adicionais (C). Se a água está presente nasistema, que irá reagir com metóxido de sódio para formar hidróxido de sódio, uma base forte que irreversivelmente hidrolisa para produzir ésteres de ácidos gordos livres indesejáveis. Acetato de metila é adicionado como um co-solvente 15 para remover pequenas quantidades de hidróxido de sódio dentro do sistema (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figura 3. Representante cromatograma iónico total de tipo selvagem folha Arabidopsis thaliana monómeros cutina. (A) O trimetilsilílico (TMSi) éter e (B) derivados de hidroxila de etilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figura 4. cutina composição de monómero de Arabidopsis thaliana WT e dois alelos mutantes nulos do gene CYP86A2. (Mutante-1 = att1-1; mutante-2 = att1-2) As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 4) . Adaptado a partir de 13, com a permissão de © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Figura Suplementar 1. Pico resultados de integração tabela do software de GC / MS. Os picos correspondentes a monómeros identificados e os padrões internos são identificados pela sua retenti<html> a tempo (coluna C) e valores de área estão tabulados na coluna D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Suplementar Arquivo 2. Tabela de Arabidopsis monómeros Cutin (derivados trimetilsililico de ésteres metílicos dos ácidos gordos hidroxi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Suplementar Tabela 3. Ficheiro de Arabidopsis monómeros cutina (derivados de O-acetil de ésteres metílicos de ácidos hidroxi-gordos).com / arquivos / ftp_upload / 53386 / &quot;target =&quot; _ blank Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;&gt; Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Suplementar Figura 4. GC / FID vestígios de (AB) de éster metílico de ácido gordo (FAME) padrões de índice de retenção (picos são rotulados com cada comprimento de cadeia saturada FAME); e (C) A. acetilado folha WT thaliana monómeros cutina. Os números no pico correspondem a: 16: 0 FAME (1), ácido ferúlico (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: éster dimetílico do ácido dicarboxílico; FAME: éster metílico de ácidos gordos; IS1: padrão interno 1, 17: 0 FAME; IS2: st internoAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a>

Os poliésteres lipídicos constituem os componentes estruturais de duas modificações da parede celular, a cutícula da planta e as barreiras de difusão contendo suberina. Neste vídeo, descrevemos um método para despolimerizar a cutina de folhas inteiras deslipidadas. O método pode ser aplicado para investigar mutantes comprometidos na biossíntese de cutina ou suberina.

Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

As plantas vasculares dependem de camadas extracelulares que funcionam como barreiras impermeáveis entre os tecidos vegetais e o ambiente externo. Essas estruturas associadas a células lipofílicas restringem infecções patogênicas e regulam o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas para dentro e para fora dos tecidos vegetais. Uma barreira importante é a cutícula vegetal, uma estrutura complexa exclusiva das plantas.Cutina é um poliéster de glicerol lipídico insolúvel que constitui a matriz estrutural da cutícula e está associado a ceras extraíveis com solvente. Aqui apresentamos uma técnica confiável para analisar a composição de poliésteres lipídicos e reter tecidos vegetais deslipidados. Neste protocolo, amostras inteiras de tecido são coletadas, homogeneizadas e exaustivamente degradadas por uma série de extrações com solvente para remover lipídios solúveis em solvente, incluindo ceras cuticulares e epicuticulares.Triglicerídeos nos lipídios da membrana. Em seguida, as amostras são despolicomerizadas em seus monômeros lipídicos constituintes por meio da metilólise catalisada por metóxido de sódio. São adicionados reagentes de simulação para transmetilar os grupos hidroxila em seus derivados correspondentes de trimetilcila, adequados para análise por cromatografia gasosa.Os resíduos derivados são então transferidos para frascos de CG e carregados no A-G-C-M-S para análise, gerando um cromatograma que caracteriza a composição monomérica dos biopoliésteres presentes nas amostras extraídas. Aqui, coletamos amostras completas de folhas de plantas de arábidos do tipo selvagem e de dois mutantes maduros.Para extração e análise, adicione 0,5 gramas de tecido em tubos de vidro limpos previamente lavados com clorofórmio. Coloque 100 mililitros de isopropanol em um frasco e adicione butil-hidroxi-tolueno até atingir uma concentração de 0,01%. O BHT é um antioxidante adicionado para proteger as ligações duplas e os ácidos graxos contra oxidação durante as extrações com solvente. Pré-aqueça o solvente em banho-maria a aproximadamente 85 graus.Adicione 25 mililitros de isopropanol aquecido por grama de tecido vegetal e incube as amostras na câmara térmica a 85 graus por 15 minutos. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente com proteção auditiva e ocular. Por fim, homogeneíze as amostras com um homogeneizador para obter uma dispersão homogênea, feche os tubos com tampas de rosca e agite a 100 RPM por um a dois minutos, em seguida, centrifugue as amostras a 800 G por 10 minutos.Para separar a fase orgânica dos materiais de maior densidade compactados no pellet, remova e descarte o sobrenadante utilizando um pipeta de Pasteur ou propipeta. Tenha cuidado para não perturbar o pellet. Adicione um volume igual de isopropanol à temperatura ambiente e agite as amostras durante a noite.Centrifugue as amostras a 100 RPM e descarte o sobrenadante. Adiciono 25 mililitros de uma solução na proporção de dois para um de clorofórmio e metanol, por grama de tecido, e agito as amostras durante a noite, centrifugo e descarto a fase orgânica. Em seguida, repita este processo utilizando uma solução de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois.Seque o pellet durante a noite e transfira os tubos da capela para um dessecador a vácuo contendo sulfato de cálcio anidro para desidratar as amostras por um período de pelo menos três dias ou até que a massa constante seja alcançada. Uma vez que as amostras estejam completamente secas, elas estarão prontas para defloração por metálise catalisada por metóxido de sódio. Adicione duas soluções de padrões internos aos tubos contendo tecidos secos usando uma seringa de vidro, começando com 25 microlitros de decanoato de metil HETO e 25 microlitros de pentecano omega e lactona.Para iniciar a polimerização profunda, adicione 0,9 mililitros de acetato de metila às amostras, seguidos por 1,5 mililitros de catalisador de metóxido de sódio e 3,6 mililitros de metanol. Incube as amostras a 60 graus por duas horas com vortexagem periódica dentro do sistema de reação; os poliésteres lipídicos reagem com ânions metóxido nucleofílicos formando intermediários tetraédricos instáveis, que se dissociam prontamente em ácidos graxos, ésteres metílicos e ânions óxido. Esses óxidos são bases conjugadas e reagem com metanol, regenerando os ânions metóxido cataliticamente ativos, sustentando assim reações adicionais de polimerização profunda.Se houver água no sistema, ela reagirá com o metóxido de sódio para formar hidróxido de sódio. Uma base forte que converte irreversivelmente poliésteres em ácidos graxos livres indesejáveis. Em vez de fas, para prevenir a hidrólise, o acetato de metila é adicionado para remover qualquer hidróxido de sódio presente no sistema.Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente. Após a incubação, extraia os monômeros adicionando 10 mililitros de diclorometano a cada tubo. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de ácido acético glacial para acidificar as amostras.Encha os tubos com solução de cloreto de sódio 0,5 molar, vortexe completamente e centrifugue por minutos. Sob a capela. Transfira cuidadosamente a fase orgânica inferior por meio de pipeta para tubos médios limpos e pré-lavados.Lave as amostras novamente com solução salina, agite em vórtex e centrifugue por 10 minutos. Remova a fase aquosa superior, então adicione sulfato de sódio anidro às amostras como agente secante para remover traços de água remanescentes na solução; agite as amostras em vórtex, centrifugue e transfira o solvente para tubos pequenos limpos e pré-lavados. Coloque os tubos em um evaporador a nitrogênio para evaporar o solvente e obter resíduos secos de monômeros. Usando uma seringa de vidro, adicione 100 microlitros de purina e 100 microlitros de B-S-T-F-A para converter os grupos hidroxila em derivados voláteis de trimetilcila.Incube as amostras a 100 graus por 10 minutos. Deixe os tubos esfriarem e evaporem sob gás nitrogênio. Adicione 500 microlitros de uma solução de HEPTANO e tolueno na proporção um para um para dissolver os resíduos vermelhos, que são então centrifugados brevemente.Transfira as amostras derivatizadas para frascos de CG contendo inserções de 400 microlitros. Feche os frascos, carregue as amostras em um cromatógrafo a gás, que as injeta em uma coluna capilar para análise, e os eluatos são então detectados por um espectrômetro de massas em quadruplo. Os dados brutos obtidos pela análise de CG-EM são processados e apresentados como um cromatograma para cada amostra.Monômeros individuais correspondentes a diferentes picos cromatográficos são identificados por seus espectros de massa específicos. Nos tempos de retenção da CG, as quantidades de monômeros individuais são determinadas usando o método do padrão interno de quantificação, permitindo comparações da abundância e composição de monômeros entre amostras. São mostrados aqui cromatogramas sobrepostos de análises representativas de monômeros, liberados de tecido foliar de abscesso de coelho correspondentes ao tipo selvagem e a dois alelos mutantes de um gene que codifica uma enzima mono-oxigenase P450, demonstrando perfis monoméricos distintos.Nossos resultados demonstram diferenças significativas na abundância de três monômeros majoritários de cutina em plantas de arabidopsis selvagens e mutantes. Este protocolo é um método robusto para ensaiar a composição de poliésteres lipídicos vegetais mediante o isolamento, identificação e quantificação de seus monômeros constituintes. O procedimento é escalonável e pode ser facilmente adaptado para processar grandes quantidades de diversos materiais vegetais, incluindo raízes, sementes, folhas e outros tecidos inteiros.Esta técnica é aplicável a estudos que investigam a regulação da biossíntese e a distribuição de cutina e suberina em plantas superiores.

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Biology

Biologia

A cutícula é uma planta que cobre waxy exterior sobre as plantas que tem um papel fundamental na conservação da água, mas também é uma importante barreira contra a entrada de microorganismos patogênicos. Neste vídeo, demonstramos a análise de mutantes de plantas cutícula identificados por abordagens frente e verso genética.

Uso de Arabidopsis mutantes eceriferum para Explorar Biossíntese Cutícula Vegetal

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Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição dos carboidratos da parede derivadas.

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Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.

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A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

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Extração da lignina com alto teor de β-O-4 por extração de etanol suave e seu efeito sobre o rendimento de despolimerização

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Aprenda a isolar e analisar monômeros de poliésteres lipídicos da cutícula vegetal usando extração sequencial e GC-MS. Este método permite estudar a composição da cutina em diferentes espécies e mutantes de plantas.

Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

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