Medindo respostas fisiológicas de Drosophila Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

O objetivo geral deste procedimento é medir as respostas fisiológicas dos neurônios gustativos da Drosophila aos feromônios lipídicos. Essa técnica pode ser usada para responder a perguntas-chave em neurobiologia sensorial, como identificar os ligantes para receptores gustativos órfãos. A principal vantagem dessa técnica é que as respostas de neurônios gustativos individuais podem ser estudadas em um animal vivo intacto.

Depois de anestesiar a mosca, prenda-a a uma lamínula de 0,17 milímetro usando uma gota muito pequena de esmalte transparente. Prenda o lado da braguilha ao slide usando a gota inteira. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use um pincel úmido para estender uma perna dianteira da mosca.

Em seguida, usando duas tiras muito finas de fita, prenda o primeiro e o quinto segmentos do tarso na lamínula. Se os neurônios da tromba forem fotografados, coloque outra tira fina de fita adesiva sobre o rostro da tromba para expor o labelo. Agora, faça uma mureta ao redor da mosca usando uma caneta PAP.

Deixe a anestesia passar por meia hora antes de fazer as medições. Para este protocolo, preparar as diluições necessárias da solução de ligante de reserva de um miligrama por mililitro, utilizando PBST. Para iniciar o procedimento, sobreponha 10 microlitros de PBST nos segmentos tarsais seguros e expostos.

Isso umedece a perna e evita que ela saia de foco. Em seguida, concentre-se nos segmentos usando um sistema óptico que pode obter um bom sinal fluorescente com resolução de tempo rápida, como um microscópio confocal de disco giratório com uma câmera sCMOS. Colete três pilhas Z de pré-estimulação dos neurônios de interesse no segmento do tarso.

Neste exemplo, as imagens são capturadas com exposições de 200 milissegundos e um binning de dois por dois em uma seção de seis mícrons por meio mícron a cada dois segundos. Certifique-se de otimizar a potência do laser para minimizar o branqueamento de fotos e, ao mesmo tempo, permitir uma alta relação sinal-ruído. Aqui, um laser de 491 nanômetros e 100 miliwatts é operado a 30% de transmissão.

O sinal deve ser detectável antes da estimulação, mas não se aproximar da saturação. Agora, pipete 10 microlitros de solução de estimulação no segmento tarsal de interesse. Ao pipetar, tenha muito cuidado para evitar tocar na perna ou em qualquer parte do corpo da mosca ou o tarso sairá da posição.

Em seguida, adquira imediatamente as primeiras imagens pós-estimulação e continue a coletar imagens suficientes para documentar a mudança máxima na fluorescência. Para análise, abra uma série de pilhas Z confocais usando o software de análise e processamento de imagem Fiji ou ImageJ. Faça uma projeção de intensidade de soma de todas as fatias Z para cada um dos pontos de tempo.

Aqui, há seis fatias e 120 pontos de tempo. Primeiro, selecione a opção de pilha na imagem e, em seguida, selecione a opção de projeção Z. Insira um para a fatia inicial e quatro para a fatia de parada.

Para o tipo de projeção, insira fatias de soma e selecione todos os períodos de tempo. Agora, defina uma região de interesse, ou ROI, como um corpo celular ou projeção neuronal. Use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar em torno dos limites da estrutura.

Em seguida, clique no rótulo de análise e selecione a opção Gerenciador de ROI em ferramentas. Quantifique a fluorescência do ROI selecionando primeiro a opção definir medições no menu analisar. Marque as caixas para densidade integrada, área, valor médio e máximo de cinza e rótulo.

Em seguida, selecione a opção mais no menu do gerenciador de ROI e escolha a opção de várias medidas. Agora, calcule a mudança máxima na fluorescência para o ponto de tempo t. Para quantificar a fluorescência pós-estimulação, meça a densidade integrada do ROI.

Para t igual a zero, meça a fluorescência de pré-estimulação a partir das imagens de pré-estímulo do ROI da mesma maneira. A média dos valores de três imagens para este t é igual a zero. Para quantificar a fluorescência de fundo, meça a densidade integrada de uma área de tecido desprovida de neurônios detectáveis que tenha o mesmo tamanho e forma que o ROI.

Colete um valor de plano de fundo exclusivo para cada ponto de tempo. O indicador de cálcio GCamP foi expresso usando dois padrões diferentes de expressão de Gal4. Cada padrão rotula uma população distinta de neurônios da perna dianteira e células de suporte não neuronais.

Para ambos os padrões de expressão, foram observadas respostas específicas do ligante ao feromônio lipofílico CH503. A mudança relativa na intensidade de fluorescência do sinal GCamP aumentou com concentrações mais altas de CH503. Curiosamente, uma dose de cinco nanogramas de CH503 pode suprimir a resposta neuronal.

As respostas medidas dos neurônios Gr68a e ppk23 diferiram. A resposta neuronal dos neurônios marcados com o driver Gr68a Gal4 exibiu um padrão tônico, enquanto os neurônios ppk23 mostraram uma resposta oscilatória fásica na perna. Na tromba, os neurônios ppk23 mostraram uma resposta tônica de início tardio do corpo celular e uma resposta oscilatória de uma projeção axonal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir as respostas fisiológicas de neurônios gustativos individuais a feromônios lipídicos e outros ligantes hidrofóbicos. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia quimiossensorial medirem as respostas de neurônios gustativos individuais em Drosophila melanogaster. Usando essa técnica, a atividade neuronal pode ser silenciada ou ativada usando um shibire com temperatura controlada ou um transgene TRiP a-one, acoplando o microscópio de disco giratório a uma incubadora de palco com temperatura controlada.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cinco minutos, excluindo o tempo necessário para a mosca se recuperar da anestesia. Ao executar este método, é importante fixar a mosca firmemente na lamínula sem danificar sua pata dianteira. Durante a geração de imagens, é importante adquirir imagens assim que a perna dianteira for estimulada com solução de feromônio.