Name: De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em Drosophila melanogaster Usando a Flywalk Paradigm (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Aprenda a quantificar comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster usando o sistema Flywalk. Este método automatizado oferece alta resolução temporal para estudar olfação de insetos.

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Agradecemos a Daniel Veit de assistência técnica e Pedro Gouveia no Electricidade em Pó (electricidadeempo.net) para customizar o software de rastreamento para nossas demandas. Agradecemos também a Tom Retzke para apoio durante o processo de filmagem. Este estudo foi apoiado pela Sociedade Max Planck.

As técnicas de construção e detalhes de Flywalk foram descritos em outro 26 (no caso de eventuais problemas de estabelecer esta configuração, mais informações podem ser obtidas a partir de MK). Aqui vamos nos concentrar em obter instruções detalhadas sobre o manuseio do paradigma que vai ajudar a obter resultados confiáveis. 1. Fly Manuseamento <ol><li> Voa traseira em baixa a média densidade culturas em meio de comida 27 horas sob uma luz 12: 12 horas: regime escuro a 23-25 ​​° C e 70% de umidade relativa. Para este fim, permitir 20-30 adulto recém-surgido voa para reproduzir em um grande frasco de comida para uma semana, em seguida, descartar moscas adultas e esperar por descendentes a surgir. </li><li> Recolha 30-40 recém-emergidas (idade &lt;24 horas) moscas adultas e idade-los em no novo um frasco contendo meio alimentar 27 para 3-5 dias. </li><li> Vinte e quatro horas antes do início do experimento comportamental: Transferir todos 30-40 previamente coletadas 3-5 d de idade (ver 2.2) voa para uma nova vial contendo um tampão de espuma de borracha úmida ou um lenço de papel úmido usando um aspirador. NOTA: Não anestesiar moscas usando CO 2. </li></ol> 2. Preparação do Setup Flywalk <ol><li> Use 250 ml garrafas como umidificadores. Encha humidificadores com 100 ml de água destilada. </li><li> Prepare frascos de odor. <ol><li> Preparar 500 ul 10 -3 diluições dos odores puros de acetato de etilo, butirato de etilo, acetato de isopentilo e 2,3-butanodiona em óleo mineral solvente. </li><li> Anexar duas válvulas de retenção bola por odor frasco. Note que o check válvulas permitem unidirecional única fluxo de ar. Por conseguinte, conectar válvulas de retenção de tal forma que o ar possa entrar no frasco de um lado e deixá-la no outro lado. </li><li> Remover a tampa de um tubo de reacção de PCR de 200 uL. Pipetar 100 ul de cada diluição de odor num tubo de reacção separado e coloque os tubos em frascos separados de odor. Também preparar um frasco contendo apenas o odor oi solvente mineraleu. </li><li> Firmemente selar os frascos de odor por fechá-los usando tampões de aço inoxidável e juntas de borracha. </li><li> Ligar os frascos de 5 (4 odor contendo odores e 1 contendo óleo mineral) para o sistema de libertação de odores. Certifique-se de conectá-los na direção do fluxo direita. Uma conexão errada não só irá comprometer a experiência projectada, mas também podem contaminar o sistema de entrega. </li></ol></li><li> Verifique a existência de fugas por meio de selagem da saída da câmara de mistura do dispositivo de estímulo. Certifique-se que todos os fluxos de ar antes do dispositivo de estímulo agora cair progressivamente a zero. Se não, verifique se há vazamentos que agora podem ser identificados pelo som de assobio de ar que sai do sistema. </li><li> Transferir cuidadosamente 15 moscas individuais para 15 tubos de vidro individuais usando um aspirador e tubos de vidro perto de ambos os lados usando os adaptadores correspondentes. Nota: Como o sistema deve ser hermeticamente fechado por experiências bem sucedidas, verifique se os adaptadores caber tubos de vidro hermeticamentee note que os tubos de vidro podem quebrar durante esta etapa. Tome cuidado para evitar lesões através do uso de luvas e óculos de protecção. </li><li> Ligue os tubos de vidro para a configuração Flywalk e, a partir de agora, espere pelo menos 15 minutos antes do início do experimento para permitir moscas para se habituar ao novo ambiente. </li><li> Depois de prender os tubos de vidro: verifique a leitura dos medidores de vazão a jusante digitais no computador 1 se os 16 fluxos de ar após os tubos de vidro adicionar até o fluxo de ar que entra no sistema. Além disso, verifique no computador 1, se a umidade é entre 60% e 80%. </li><li> Projeto do protocolo de estímulo controlar a sequência e tempo de estímulos odor apresentadas às moscas. Para obter os dados descritos por exemplo, odores e 4 apresentam o controlo (óleo mineral) isoladamente e todos ternário possível e as misturas quaternário dos odores simultaneamente para 40 vezes cada um. Definir a duração do pulso para 500 ms, com um intervalo de 90 segundos interstimulus e aleatório seqüência de estímulo. </li><li> Ligue o lifonte ght (LED-cluster; λ = 630). Certifique-se de fornecer luz suficiente para o acompanhamento eficiente sem aumentar a temperatura no interior dos tubos de vidro. </li><li> Defina-se uma região de interesse do sistema de seguimento, arrastando uma moldura em frente da área a ser monitorizada, de tal modo que todos os 15 tubos de vidro estão incluídos e aproximadamente 5 mm das extremidades dos tubos são excluídos. </li><li> Configure 14 linhas de separação entre tubos paralelos individuais no sistema de rastreamento alterando suas posições Y no script correspondente para manter indivíduo identificável moscas durante todo o experimento. Certifique-se de posicioná-los de tal forma que há sempre um tubo de vidro entre duas dessas linhas separadoras, porque apenas uma mosca serão rastreadas entre qualquer conjunto de duas linhas. </li><li> Certifique-se de definir os parâmetros da câmara de tal forma que as moscas são controladas de forma confiável ao longo dos tubos de vidro. Se moscas são perdidos nas extremidades da região de interesse, aumentar o brilho ou o ganho de seguimento software. Evite vibrações mecânicas do sistema de rastreamento. Acompanhe utilizando software comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Iniciar a experiência, iniciando o protocolo de estímulo. Grave flies&#39; XY coordenadas a 20 fps (frames por segundo) e log em combinação com o estado da válvula odor em arquivos de texto. </li></ol> Análise 3. Dados NOTA: Os passos seguintes na análise de dados são automatizadas utilizando rotinas escritas personalizados programados em R. Porque estes passos são cruciais para a obtenção de resultados significativos na análise irá, todavia, ser apresentados em uma maneira passo-a-passo. Os dados brutos para a análise são-arquivos .csv que contêm informações sobre o estado sincronizado válvula odor, número de pulsos no experimento e 15 posições mosca-x em cm em um eixo de tempo comum para um ciclo de estimulação odor. Código personalizado para análise de dados podem ser fornecidos mediante solicitação. <ol><li> Open-arquivo .csv, encontrar tempo ponto de abertura da válvula indicado por um chaESL na coluna que representa o estado da válvula. </li><li> Calcula-se a função linear da posição da forma de odor F (t) = s * t + i onde t é o tempo no ciclo de estimulação, s é a velocidade do vento (aqui 20 cm / seg) e a intersecção i pode ser calculado usando o ponto de tempo entra o odor dos tubos na posição 0 (abertura da válvula mais atraso). </li><li> Encontre o ponto de tempo em que o odor e voar x-posição cruzam para cada voar e definir esse ponto de tempo para 0. Nota: Esta maneira posições mosca estão alinhados para cada individual&#39;s encontro com o odor. </li><li> Excluir moscas sentadas nas próprias bordas da região de interesse. </li><li> Calcular a velocidade de X-posições, dividindo o deslocamento ao longo do eixo x por o intervalo de tempo (100 msec) e repetir o procedimento para cada ciclo de estimulação. </li><li> Para acelerar o tempo de obtenção de pratos, como mostrado na Figura 2E calcular curso de tempo da velocidade média para cada mosca e de odor e aqueles do curso de tempo significativo para um determinado odor. </li><li> Para obter o deslocamento líquido, tal como mostrado na Figura 3C calcular o deslocamento de líquido dentro de 4 segundos após o pulso de odor para cada evento de controle e, depois, o deslocamento líquido médio por mosca e odor. </li></ol> 4. Procedimento de Limpeza <ol><li> Limpe o vidro Tubes <ol><li> Remover moscas e adaptadores de tubos de vidro e tubos de vidro de molho com detergente. </li><li> Lavar tubos de vidro em água corrente destilada e seque-as usando ar pressurizado. </li><li> Tubos de vidro térmico a 200 ° C durante 8 h. </li></ol></li><li> Limpe Odor Delivery System <ol><li> Remove todos os frascos de odor e a tubagem da câmara de mistura central. </li><li> Remover adaptadores de tubos a partir da câmara de mistura. </li><li> Câmara de mistura limpa, lavando-o com solução de limpeza de laboratório e solventes (por exemplo, etanol, acetona). Execute estas etapas sob o capô laboratório. </li><li> Câmara de mistura a seco usando ar sob pressão e aquecer a 200 ° C durante 8 h. </li></ol></li><li> Limpe Odor Frascos e Válvulas de retenção <ol><li> Remova o plugue de aço (junta de borracha de descarte) e válvulas de retenção de frascos de odor e aproveitar todos os componentes na solução de limpeza de laboratório. </li><li> Componentes sonicate em um banho de ultra-som e lavá-los com água destilada. </li><li> Limpe todos os componentes, exceto válvulas de retenção com etanol e acetona. Execute estas etapas sob o capô laboratório. </li><li> Componentes secos que utilizam ar pressurizado e aquecê-los a 200 ° C durante 8 h. </li><li> Válvulas de retenção limpo por dentro por rubor-los com etanol e acetona, utilizando uma seringa (considere direção do fluxo). Execute estas etapas sob o capô laboratório usando óculos de laboratório. Porque acetona ataca peças de borracha, imediatamente válvulas de retenção secas por rubor-los com ar pressurizado. </li><li> Remover os odores residuais pulsando ar através de válvulas de retenção por vários dias. Utilize uma incubadora a 60 ° C e de 1 seg no ar / 1 seg de ar fora regime para este passo de limpeza. </li></ol&gt; </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora o sistema Flywalk parece bastante sofisticado, à primeira vista, uma vez configurado e funcionando, é fácil de usar e produz resultados muito robustos. Para enfatizar a consistência dos resultados produzidos com o bioensaio pode-se dizer que os resultados representativos mostrados aqui foram obtidos quase 2 anos depois alguns dos resultados apresentados em estudo anterior 29 com uma configuração modificada usando um novo software de rastreamento e fonte de luz. No entanto, as respostas são atractivas -...

A meta primordial de qualquer investigação neuroetológica é estabelecer um nexo de causalidade entre os estados de atividade de neurônios individuais ou circuitos neuronais eo comportamento de um organismo. Para alcançar este objetivo a atividade neuronal e comportamento devem ser monitorados em condições idênticas de estímulo e essas condições de estímulo deveriam idealmente ser semelhantes aos do sistema nervoso sob escrutínio evoluído para fazer sentido. Especialmente quando se trata de bioensaios comportamentais, estas exigências têm historicamente se mostrado bastante exigente em Drosophila melanogaster neuroethology olfativo. Uma vez liberada a partir da fonte, plumas odor quebrar rapidamente se em filamentos finos com difusão turbulenta causada pelo movimento do ar é o principal determinante da distribuição odor 1. Como resultado, um inseto navegar para atingir uma fonte de odor experimenta a estimulação intermitente com pacotes de odor intercaladas com intervalos variáveis ​​de ar limpo. ambosandando e insetos voadores - incluindo Drosophila - foram demonstradas para explorar essa regime estimulação intermitente para a navegação de afluência contra o vento em cima de encontro pluma e predominantemente movendo cross-vento na ausência de odores 2 - 5. Considerando que os procedimentos de estimulação em experimentos fisiológicos imitar em grande parte aqueles um inseto pode enfrentar em seu ambiente natural, quer proporcionando puffs únicas de odores intercalados com longos períodos de ar limpo ou sequências de estimulação dinâmica 6 - 11, muitas bioensaios comportamentais utilizados na Drosophila neuroethology como ensaio armadilha , arenas em campo aberto ou T-maze contar com odor gradientes 12 - 15. No entanto, porque os gradientes de odor, por definição, são variáveis ​​na concentração, dependendo da distância a partir da fonte de odor, um comportamento particular não pode ser atribuída a uma concentração de odor usando preciso desses paradigmas. Além disso, a inclinação daum gradiente de odor depende criticamente sobre as propriedades físico-químicas do odorante. Um gradiente de um composto altamente volátil será mais rasa do que o criado por um composto menos volátil e, portanto, também mais difícil de controlar de um organismo depender de medição de diferenças de concentração no espaço como o único meio de navegação 16 - 20, o que pode conduzir a uma interpretação incorrecta de preferências olfativas particularmente em ensaios escolha. Este efeito também é altamente prejudicial ao investigar comportamento em relação a misturas de odores, pois leva a diferentes proporções de mistura de componentes em cada ponto no espaço e, portanto, mais uma vez se opõe a uma clara correlação entre a fisiologia e comportamento. Enquanto moscas do vinagre tendem a se agregar em fermentação de frutas, eles são solitários em sua navegação em direção a fontes de alimento e locais de oviposição. No entanto, em vez de testar animais individuais muitos paradigmas comportamentais utilizados em Drosophila neuroetholoGy examinar o comportamento guiado por odor de coortes de moscas e atração é marcado como a fracção de moscas que escolhem o odor ao longo de um estímulo controle. Estas experiências de coorte têm contribuído grandemente para a compreensão da mosca neuroethology e muitas das observações feitas por usá-los pode ser confirmada em experimentos single-mosca. No entanto, tem sido observado que voa pode influenciar cada decisão alheia 21 e em casos extremos, a avaliação de um odor pode mudar de indiferença à evasão dependendo da densidade populacional 22. Além disso, os resultados destes tipos de experimentos muitas vezes fornecem apenas o ponto final de uma sequência de decisões comportamentais ao invés de observar o que a mosca está fazendo enquanto ele estiver fazendo isso, o que seria desejável ao tentar correlacionar o comportamento com a atividade neuronal. Estas experiências de coorte, em vez de baixa resolução são contrastados por métodos de alta resolução single-mosca, como arenas de voos cativos e esteiras que permitempara uma observação directa das respostas de comportamento no momento em que o estímulo é apresentado 20,23,24. No entanto, as experiências de coorte ainda são populares, porque eles são muito eficientes e fornecem resultados robustos, mesmo em baixo comparativamente tamanhos de amostra, porque a variabilidade inter-individual e inter-julgamento são parcialmente média para fora devido à observação de populações ao longo de períodos de tempo prolongados. Enquanto voo tethered e esteira provavelmente fornecer o padrão-ouro, relativa apresentação do estímulo e resolução temporal, as arenas utilizadas são projetados para animais individuais e por isso é necessário para obter os tamanhos de amostra para uma análise estatística demorado. Várias outras abordagens têm sido recentemente desenvolvidos para permitir uma aquisição eficiente de alta-resolução dos dados comportamentais em combinação com um regime de estímulo bem definida. Estes incluem não vigiada seguimento 3D de várias moscas do vinagre em um túnel de vento em combinação com um modelo 3D preciso da pluma de odor 5 </sup&gt;, o rastreamento de vários moscas individuais em câmaras escolha fornecidas com correntes de ar de ambos os lados 25 e o paradigma Flywalk 26. Em Flywalk, 15 moscas individuais situam-se em pequenos tubos de vidro e continuamente monitorizada por uma câmara de suspenso, sob condições de luz vermelha. Os odores são adicionados a uma corrente de ar contínua de 20 cm / seg e viajar através dos tubos de vidro a uma velocidade constante. A corrente de ar é humidificado fazendo-o passar através de 250 ml garrafas contendo água destilada (humidificadores) antes de entrar no sistema de libertação de odores. As posições flies&#39; são registados dentro de uma região quadrado de interesse (ROI) que abrange a maior parte do comprimento dos tubos de odor (mas excluindo as bordas exteriores dos tubos (aproximadamente 5 mm de cada lado), em que as moscas não pode mover-se mais para cima ou a favor do vento) em torno do tempo de apresentação de odor (Figura 1A, B). Voar identidades são mantidas constantes pelo sistema de rastreamento de turante o experimento com base em suas posições Y (ou seja, os seus limites de tubo de vidro). Estimulação odor é conseguida usando um dispositivo de estímulo multi-componente que permite a apresentação de até 8 odores individuais possíveis e todas as suas misturas 26,29 (Figura 1B). O curso de uma experiência é controlada por um computador de regulação do sistema de entrega e recolha de odor temperatura e humidade informações (computador 1, Figura 1C). Este computador também controla um datalogger (iniciar / parar a gravação) em um segundo computador que rastreia continuamente posições voar a 20 quadros por segundo (computador 2). Voe posições, estado da válvula odor (ou seja, ponto de tempo de abertura da válvula), odor ID, ​​temperatura e umidade em torno de ciclos de estimulação odor são registradas no computador 2. Desta forma, informações sobre odor e voar posições são sincronizados e exportados como .csv-arquivos que podem continuar a ser processados ​​e analisados ​​utilizando rotinas de análise escrito sob medida. porquetodo o sistema é controlado por computador, sem intervenção humana, é necessário durante uma sessão experimental.

<table><tbody><tr><td>Configuração do Flywalk</td> Detalhes <td>personalizados</td><td></td><td>disponíveis mediante solicitação</td></tr><tr><td>Dispositivo de estímulo</td> Detalhes <td>personalizados</td><td></td><td>disponíveis mediante solicitação</td></tr><tr><td>Cluster de LEDs</td> Detalhes <td>personalizados</td><td></td><td>disponíveis mediante solicitação</td></tr><tr><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Logitech, Lausanne, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Computadores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flywalk Reloaded v1.0 software</td><td>Electricidade Em P&oacute; (electricidadeempo.net)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Labview 11.0</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comida padrão para moscas</td><td>Personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos para moscas padrão</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos para moscas padrão</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirador</td><td>personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odors</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Tubos de reação PCR</td><td>Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de alta resolução quantificação do comportamento odor-guiada em<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; usando a<em&gt; flywalk</em&gt; paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Em seu ambiente natural, insetos, como o vinagre voar Drosophila melanogaster são bombardeados com uma quantidade enorme de odorants quimicamente distintos. Para complicar ainda mais, os odores detectados pelo sistema nervoso dos insetos geralmente não são compostos isolados, mas misturas cuja composição e rácios de concentração variar. Isto leva a uma quantidade quase infinito de diferentes estímulos olfactivos que têm de ser avaliados pelo sistema nervoso. Para entender quais aspectos de um estímulo odor determinar a sua avaliação pela mosca, é desejável, portanto, examinar de forma eficiente o comportamento guiado por muitos no sentido de odor odores e misturas de odores. Para se correlacionam diretamente comportamento para a atividade neuronal, o comportamento deve ser quantificada em horários similares e em condições idênticas às de estímulo em experimentos neurofisiológicos. No entanto, muitos bioensaios olfativos usados ​​atualmente em Drosophila neuroethology são bastante specialized quer no sentido da eficiência ou em direção a resolução. Flywalk, um sistema de entrega de odor e monitoramento automatizado, preenche a lacuna entre eficiência e resolução. Ele permite a determinação de um pacote exactamente quando odor estimulada uma mosca que anda livremente, e para determinar as ANIMAL reacção comportamental dinâmica.

Como as moscas são autorizadas a distribuir livremente nos seus tubos de vidro entre os pulsos de odor e o pulso de odor viaja através dos tubos de vidro a uma velocidade constante moscas encontrar o odor em momentos diferentes, dependendo da sua posição-x, no momento da estimulação. Como resultado, os inícios das trajectórias de fluxo ascendente evocados por um pulso de 500 ms de um atraente 10 -3 diluição de acetato de etilo são atrasadas em cerca de 1 segundo para as moscas na extremidade a jusante da seus...

O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

O objetivo geral deste bioensaio comportamental é investigar o comportamento orientado por odor em moscas-das-frutas. O Fly Walk é um sistema de alto rendimento que rastreia e analisa automaticamente as respostas comportamentais de múltiplas moscas individuais a estímulos olfativos. Esta nova técnica pode ajudar a responder perguntas-chave na área da olfação em insetos.Como é o equilíbrio hedônico de um odor, ou o que a adição de odorizantes adicionais significa para esse equilíbrio? A principal vantagem deste experimento é que podemos analisar o comportamento orientado por odor com alta resolução temporal, utilizando estímulos olfativos semelhantes aos que os insetos experimentam na natureza ou aos que também utilizamos em gravações eletrofisiológicas. Geralmente, indivíduos que tentam usar este método podem enfrentar dificuldades, pois, na verdade, ele exige um sistema hermético ao ar; portanto, é necessário saber por onde o ar está passando e ter certeza absoluta de que não há vazamentos em nenhum ponto onde o ar possa escapar do sistema. Para esses experimentos, é importante criar as moscas em ciclo claro-escuro de 12 por 12 horas, em culturas com densidade baixa a média, contendo um meio alimentar normal.Mantenha a temperatura ambiente entre 23 e 25 graus Celsius, e a umidade relativa em torno de 70% durante a preparação. Utilize frascos de cultura grandes para manter 20 a 30 adultos por uma semana e colete grupos de 30 a 40 descendentes de sexo misto para formar uma coorte experimental. Quando a coorte tiver entre dois e quatro dias de idade, transfira-a para um novo frasco contendo uma rolha de espuma úmida ou um papel-toalha úmido.Deixe as moscas em jejum neste frasco por 24 horas antes do teste. É fundamental que as moscas não sejam anestesiadas durante esta transferência. Para esta montagem, frascos de 250 mililitros servem como muitos umidificadores.Encha cada frasco com 100 mililitros de água destilada. Em seguida, prepare estoques de trabalho de meio mililitro de cada odorizante na diluição de 1:1000 dos odores puros e óleo mineral. Da mesma forma, prepare um tubo de PCR contendo apenas óleo mineral para servir como controle negativo.Agora prepare o sistema de entrega de odor para cada odorizante. No experimento, conecte duas válvulas esféricas de retenção a cada frasco de odor.Certifique-se de conectar os frascos de odor no sentido correto do fluxo. Uma conexão incorreta não só comprometerá o experimento planejado, mas também poderá contaminar o sistema de entrega. Em seguida, verifique o sistema quanto a vazamentos.Primeiro, feche a saída da câmara de mistura. Em seguida, verifique se todo o fluxo de ar antes do dispositivo de estímulo cai para zero. Se houver vazamentos no sistema, procure ouvi-los.Eles geralmente podem ser resolvidos substituindo as juntas de borracha em conexões cruciais ou substituindo a tubulação de teflon. Na primeira etapa deste procedimento, há risco de quebra de vidro, portanto, coloque equipamento de proteção. Transfira cuidadosamente 15 moscas de teste individuais para os tubos de vidro individuais usando um aspirador, feche os tubos de vidro em ambas as extremidades usando os adaptadores correspondentes, que devem encaixar muito firmemente.Em seguida, conecte os tubos de vidro carregados ao equipamento de caminhada das moscas. Depois que todos os tubos estiverem fixados, deixe as moscas se habituarem ao novo ambiente por pelo menos 15 minutos antes de iniciar o experimento. Agora, ligue a fonte de luz.Certifique-se de fornecer luz suficiente para um rastreamento eficiente sem aumentar a temperatura no interior dos tubos de vidro. Neste momento, todos os frascos de odor devem estar conectados para criar um sistema fechado. O período de habituação depende de um sistema fechado sem vazamentos, de modo que o fluxo de ar através dos tubos seja na mesma velocidade que durante os períodos de teste.Verifique o fluxo de ar no computador, conectando-o aos medidores de fluxo digitais. A soma dos fluxos de ar que saem do sistema deve ser igual ao fluxo de ar que entra no sistema. Caso contrário, há uma vazão presente.O vazamento afetará o fluxo de ar em todos os tubos, mas o tubo problemático geralmente é aquele que apresenta a maior queda no fluxo de ar. Se um novo vazamento for identificado, geralmente é causado por um tubo de vidro quebrado dentro do adaptador, ou por fragmentos de vidro nos adaptadores provenientes de experimentos anteriores. Durante esse processo, certifique-se de que a umidade do ar que sai do sistema esteja entre 60 e 80%. Após as moscas terem se aclimatado aos seus tubos, o experimento pode ser iniciado.Em princípio, qualquer sequência de odores pode ser apresentada até o momento. Os melhores resultados podem ser obtidos randomizando os estímulos e separando-os por pelo menos 90 segundos no total.Apresente cada odorante 40 vezes em pulsos de 500 milissegundos. Em seguida, configure uma região de interesse arrastando um quadro sobre a área a ser monitorada. Inclua todos os 15 tubos de vidro no quadro, mas exclua os cinco milímetros externos das extremidades dos tubos.O próximo passo é desligar o software de rastreamento e fazer modificações no script. Isso alterará a posição do eixo Y das 14 linhas paralelas que separam os tubos individuais. Quando o software de rastreamento for reativado, apenas uma mosca deve estar presente entre quaisquer duas linhas.Em seguida, certifique-se de que os parâmetros da câmera estão ajustados para que as moscas sejam rastreadas com confiabilidade ao longo dos tubos de vidro. Se as moscas forem perdidas nas bordas da região de interesse, aumente o brilho ou o ganho do software de rastreamento. Agora que o sistema está completamente preparado, inicie o protocolo de estímulo.Registre as posições das moscas a uma taxa de 20 quadros por segundo e registre essas posições coordenadas em conjunto com o status da válvula de odor em arquivos de texto. Como o experimento é muito sensível a odores, é necessário realizar limpezas regulares para limpar os tubos de vidro, mergulhá-los em detergente e depois enxaguá-los com água destilada corrente. Após a lavagem, seque os tubos com ar pressurizado e aqueça-os a 200 graus Celsius por oito horas.Para limpar o sistema de entrega de odor primeiramente, remova todos os frascos de odor e as tubulações da câmara de mistura central. Em seguida, remova os adaptadores de tubulação da câmara de mistura. Limpe a câmara de mistura vazia enxaguando-a com um solvente sob uma capela, assim como feito com os tubos.Seque a câmara de mistura utilizando ar pressurizado e aqueça-a a 200 graus Celsius por oito horas. Para limpar os frascos de odor e as válvulas, remova os tampões de aço, descarte as juntas de borracha e retire as válvulas de retenção, as válvulas de retenção com sabão, o etanol e outros componentes em ambos etanol e acetona. Em seguida, sonique os componentes embebidos por 30 minutos na configuração máxima e enxágue-os com água destilada.Como antes, utilize ar pressurizado para secagem e aqueça os componentes a 200 graus Celsius por oito horas. Enxágue-os com etanol quando a acetona estiver no sentido do fluxo de ar, pois a acetona ataca peças de borracha; seque imediatamente cada válvula de retenção enxaguada com ar pressurizado para remover todos os odores residuais das válvulas de retenção enxaguadas. Passe ar através delas por vários dias, montando-as em uma incubadora a 60 graus Celsius com o fluxo de ar pulsando ligado e desligado em intervalos de um segundo.15 moscas fêmeas privadas de alimento foram expostas ao butirato de etila. A barra amarela representa o pulso de odor. Os quadrados azuis indicam o movimento contra o vento dentro de um intervalo de tempo de 100 milissegundos.Quadrados vermelhos correspondentes representam o movimento a favor do vento. As mesmas moscas também exibiram movimento contra o vento em resposta à estimulação com acetato de isopentila, acetato de etila ou dois butanos d média da população. A resposta da mosca ao acetato de etila teve início acentuado, alta amplitude e curta duração.Em contraste, a resposta ao dois três butano Dion apresentou início médio mais tardio, menor amplitude e duração mais longa. Em última análise, os dados de cada odorizante foram analisados dessa maneira e posteriormente examinados para mostrar que os quatro odores provocaram um deslocamento ascendente maior dentro de quatro segundos do que o solvente. Além disso, ao abrir os frascos de odorizantes, simultaneamente as moscas foram expostas a todas as misturas possíveis.Após estimular as moscas com os quatro odores individuais, as estimulações com misturas dos quatro odores foram todas pelo menos tão atrativas quanto o composto individual mais atrativo na mistura. Uma vez dominado, você pode realizar este experimento em até uma hora, e então ele funciona por oito horas, sendo que já após 30 minutos é possível visualizar seus primeiros resultados. Assim, este método permite realmente obter dados de muitas moscas em pouco tempo, com alta resolução temporal.Mas tenha cuidado. Este experimento exige uma limpeza minuciosa entre os experimentos. Se o seu sistema ainda estiver contaminado com as formigas do experimento anterior, você pode esquecer os seus resultados no fly walk.Você pode, é claro, também testar moscas geneticamente modificadas, permitindo investigar o impacto de circuitos neurais individuais ou específicos no comportamento orientado por odores. Após o desenvolvimento dessa nova técnica, abriu-se caminho para pesquisas nesta área, a fração de insetos, a fim de compreender a codificação desses odores no cérebro do inseto. E, importante, o uso do mesmo tipo de estimulação para comportamento na caminhada da mosca e para experimentos fisiológicos significa que podemos realmente comparar esses dois paradigmas experimentais diferentes.Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como estabelecer o teste de caminhada da mosca, e deverá ser capaz de montar este experimento no seu próprio laboratório e iniciar em breve seus próprios experimentos de alto rendimento sobre o afeto em insetos. Mas não se esqueça: trabalhar com vidraria e produtos químicos pode ser extremamente perigoso; portanto, use sempre um jaleco de laboratório, óculos de proteção e luvas.

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Research

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