De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em Drosophila melanogaster Usando a Flywalk Paradigm

O objetivo geral deste bioensaio comportamental é investigar o comportamento guiado por odor em moscas do vinagre. O Fly Walk é um sistema de alto rendimento que rastreia e analisa automaticamente as respostas comportamentais de várias moscas individuais a estímulos olfativos. Essa nova técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave na área do olfato de insetos.

Como o que é o equilíbrio hedônico de um odor, ou o que a adição de odores adicionais significa para esse equilíbrio? A principal vantagem deste experimento é que podemos odores guiados por comportamento em alta resolução temporária, e usamos estímulos de odor que são semelhantes aos que os insetos experimentam na natureza ou aos que também usamos em registros eletrofisiológicos. Geralmente, os indivíduos que tentam usar esse método podem ter dificuldades porque, na verdade, ele precisa de um sistema hermético, então você precisa saber por onde o ar está passando e precisa ter certeza de que não há vazamentos por onde o ar pode sair do sistema I Para esses experimentos, é importante criar as moscas em um ciclo escuro de 12 a 12 luzes em culturas baixas a médias contendo um meio alimentar normal.

Mantenha a temperatura ambiente entre 23 e 25 graus Celsius, e a umidade relativa deve estar em torno de 70%na preparação. Usando grandes frascos de cultura, fez de 20 a 30 adultos por uma semana e coletou grupos de 30 a 40 descendentes de sexo misto para fazer uma coorte experimental. Quando uma coorte tiver dois a quatro dias de idade, transfira-a para um novo frasco contendo um tampão de espuma úmida ou um lenço de papel úmido.

Deixe as moscas morrerem de fome neste frasco por 24 horas antes do teste. É vital que as moscas não sejam anestesiadas durante esta transferência. Para esta configuração, garrafas de 250 mililitros servem como muitos umidificadores.

Encha cada garrafa com 100 mililitros de água destilada. Em seguida, prepare estoques de trabalho de meio mililitro de cada odorante como uma diluição de 1000 dos odores puros e óleo mineral. Da mesma forma, prepare um tubo de PCR apenas com óleo mineral para servir como controle negativo.

Agora prepare o sistema de entrega de odor para cada odorante. No experimento. Conecte duas válvulas de retenção de esfera a cada frasco de odor.

Certifique-se de conectar os frascos de odor na direção correta do fluxo. Uma conexão errada não apenas comprometerá o experimento planejado, mas também poderá contaminar o sistema de entrega. Em seguida, verifique se há vazamentos no sistema.

Primeiro, sele a saída da câmara de mistura. Em seguida, verifique se todo o fluxo de ar antes que o dispositivo de estímulo caia para zero. Se houver vazamentos no sistema, ouça-os.

Eles geralmente podem ser resolvidos trocando juntas de borracha em conexões cruciais ou trocando tubos de Teflon. Para a primeira etapa deste procedimento, quebrar o vidro é uma preocupação, portanto, coloque o equipamento de proteção. Transfira cuidadosamente 15 moscas de teste individuais para os tubos de vidro individuais Usando um aspirador, feche os tubos de vidro de ambos os lados usando os adaptadores correspondentes, eles devem se encaixar muito bem.

Em seguida, conecte os tubos de vidro carregados à configuração de caminhada com mosca. Uma vez que todos os tubos estejam conectados, deixe as moscas se habituarem ao novo ambiente por pelo menos 15 minutos antes de iniciar o experimento. Agora ligue a fonte de luz.

Certifique-se de fornecer luz suficiente para um rastreamento eficiente sem aumentar a temperatura dentro dos tubos de vidro. Os frascos de odor devem estar todos conectados neste ponto para criar um sistema fechado. O período de habituação depende de um sistema fechado sem vazamentos, de modo que o fluxo de ar através dos tubos está na mesma velocidade que durante os períodos de teste.

Verifique o fluxo de ar no computador, conecte-o aos medidores de vazão digitais. O total de fluxos de ar que saem do sistema deve ser igual ao fluxo de ar que entra no sistema. Caso contrário, há um vazamento presente.

O vazamento afetará o fluxo de ar em todos os tubos, mas o tubo problemático geralmente é o que apresenta a maior queda no fluxo de ar. Se um novo vazamento for identificado, geralmente é causado por um tubo de vidro que quebrou dentro do adaptador ou é causado por cacos de vidro dentro dos adaptadores de experimentos anteriores. Durante este processo, certifique-se de que a umidade do ar que sai do sistema entre 60 e 80%Depois que as moscas se aclimatarem aos seus tubos, o experimento pode ser executado.

Em princípio, qualquer sequência de odores pode ser apresentada até agora. Os melhores resultados podem ser obtidos randomizando os estímulos e separando-os em pelo menos 90 segundos. No total.

Apresente cada odor 40 vezes em pulsos de 500 milissegundos. Em seguida, configure uma região de interesse arrastando um quadro pela área a ser monitorada. Inclua todos os 15 tubos de vidro na estrutura, mas exclua os cinco milímetros externos das extremidades dos tubos.

O próximo passo é desligar o software de rastreamento e fazer modificações no script. Isso mudará a posição do eixo Y das 14 linhas paralelas que separam os tubos individuais. Quando o software de rastreamento estiver ligado novamente, apenas uma mosca deve estar presente entre duas linhas.

Em seguida, certifique-se de que os parâmetros da câmera estejam definidos para que as moscas sejam rastreadas de forma confiável ao longo dos tubos de vidro. Se as moscas se perderem nas bordas da região de interesse, aumente o brilho ou o ganho do software de rastreamento. Agora que o sistema está totalmente preparado, inicie o protocolo de estímulo.

Registre as posições das moscas a uma taxa de 20 quadros por segundo e registre essas posições de coordenadas em combinação com o status da válvula de odor em arquivos de texto. Como o experimento é muito sensível a odores, é necessária uma limpeza regular para limpar os tubos de vidro, mergulhá-los em detergente e depois enxaguá-los em água destilada corrente. Após o enxágue, seque os tubos sob ar pressurizado e aqueça-os a 200 graus Celsius por oito horas.

Para limpar primeiro o sistema de fornecimento de odor, remova todos os frascos de odor e tubos da câmara de mistura central. Em seguida, remova os adaptadores de tubulação da câmara de mistura. Limpe a câmara de mistura vazia enxaguando-a com um solvente sob uma coifa como os tubos.

Seque a câmara de mistura com ar pressurizado e aqueça-a a 200 graus Celsius por oito horas. Para limpar os frascos de odor e as válvulas, remova os plugues de aço, descarte as juntas de borracha e remova as válvulas de retenção, válvulas de retenção de sabão e etanol e outros componentes do etanol e da acetona. Em seguida, sonice os componentes embebidos por 30 minutos na configuração máxima e enxágue-os com água destilada.

Como antes, use ar pressurizado para secar e aqueça os componentes a 200 graus Celsius por oito horas. Lave-os com etanol Quando a acetona na direção do fluxo de ar, porque a acetona ataca as peças de borracha, seque imediatamente cada válvula de retenção lavada com ar pressurizado para remover todos os odores residuais das válvulas de retenção lavadas. Pulse o ar através deles por vários dias, instale-os em uma incubadora de 60 graus Celsius com fluxo de ar pulsando em intervalos de um segundo.

15 moscas fêmeas famintas foram expostas ao butirato de etila. A barra amarela representa o pulso de odor. Os quadrados azuis representam o movimento contra o vento dentro de um período de 100 milissegundos.

Correspondentemente, quadrados vermelhos representam o movimento a favor do vento. As mesmas moscas também exibiram movimento contra o vento em resposta à estimulação com acetato de pentila isop, acetato de etila ou dois três butano d em média para a população. A resposta da mosca ao acetato de etila teve um início acentuado, alta amplitude e curta duração.

Em contraste, a resposta a dois três butano Dion teve um início médio tardio, menor amplitude e maior duração. Por fim, os dados de cada odorante foram resolvidos dessa maneira e, em seguida, analisados para mostrar que todos os quatro odores provocaram um deslocamento contra o vento maior em quatro segundos do que o solvente. Além disso, ao abrir frascos de odor, as moscas foram expostas a todas as misturas possíveis.

Depois de estimular as moscas com os quatro odores individuais, os estímulos com misturas dos quatro odores foram pelo menos tão atraentes quanto o composto único mais atraente da mistura. Uma vez dominado, você pode executar esse experimento em uma hora e, em seguida, ele é executado por oito horas e já 30 minutos depois você pode visualizar seus primeiros resultados. Portanto, esse método realmente permite obter dados de muitas moscas em pouco tempo com alta resolução temporária.

Mas tenha cuidado. Este experimento requer uma limpeza extensa entre os experimentos. Se o seu sistema ainda estiver contaminado com as formigas do último experimento, você pode esquecer seus resultados na caminhada com mosca.

Você pode, é claro, também testar moscas geneticamente modificadas, para que você possa investigar o impacto de circuitos neurais individuais ou de fábrica no comportamento guiado por OD. Após o desenvolvimento dessa nova técnica, abriu caminho para fazermos pesquisas nessa área, facção de insetos, para entender a codificação desses odores no cérebro do inseto. E o mais importante, usar o mesmo tipo de estimulação para o comportamento na caminhada com mosca e para experimentos fisiológicos significa que podemos realmente comparar esses dois paradigmas experimentais diferentes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia sobre como estabelecer a caminhada com mosca e deve ser capaz de estabelecer esse experimento em seu próprio colo e iniciar seus próprios experimentos de alto rendimento sobre afeto de insetos em breve. Mas não se esqueça, trabalhar com vidraria e produtos químicos pode ser extremamente perigoso, portanto, sempre use um jaleco. Use óculos e luvas.