Uma nova abordagem que elimina a manipulação de Estudos de Agressão e Efeito "perdedor" em
30 de dezembro de 2015
Durante mosca de fruta lutas, os padrões comportamentais observados, luta dinâmica e aprendizagem e memória associada são influenciadas pelas condições experimentais. O protocolo aqui apresentado descreve um novo procedimento que elimina totalmente a manipulação de moscas durante as experiências. Isso melhora a dinâmica de luta e permite a formação de efeitos fortes "loser".
O objetivo geral deste método é introduzir a formação dos efeitos de perdedor e vencedor em drosófila, melanina, gaster, eliminando o manuseio das moscas no procedimento comportamental. A maioria dos estudos comportamentais com animais realizados em ambiente laboratorial envolve o manuseio dos animais. O manuseio dos animais, por sua vez, geralmente induz estresse nos mesmos, e o estresse pode interferir nos estudos comportamentais que se deseja realizar; por isso, tenta-se eliminar o manuseio estressante dos animais.
Desenvolvemos uma nova câmara para nossos estudos de agressão em moscas-das-frutas que elimina completamente o manuseio dos animais antes, durante ou após os experimentos. Utilizando essas novas câmaras, todos os parâmetros comportamentais que medimos revelaram-se melhores. Com este método, minimizamos a variabilidade comportamental entre indivíduos.
Reduzimos o tempo necessário para gerar uma relação de dominância clara e conseguimos induzir fortes mentalidades de perdedor e vencedor. Essas câmaras são fáceis de usar e podem ter múltiplos propósitos para estudar diferentes comportamentos de moscas-das-frutas. Para iniciar o experimento, criem e mantenham as linhagens de moscas em um incubador com ciclo claro-escuro de 12 horas, a 25 graus Celsius e 50% de umidade relativa.
Em seguida, prepare os frascos de isolamento aquecendo alimento fresco para moscas até que esteja derretido. Com uma pipeta Pasteur, transfira aproximadamente 1,5 mililitro de alimento derretido para tubos de ensaio de vidro vazios e deixe o alimento solidificar com a ajuda de um pincel fino. Remova cuidadosamente uma pupa macho em estágio avançado do frasco estoque e coloque-a na parede interna de um tubo de ensaio contendo alimento recém-preparado.
Feche os frascos de isolamento com algodão e armazene os frascos de isolamento no incubador. Após o isolamento, as moscas estão prontas para serem pintadas. Anestesie a mosca com dióxido de carbono e, em seguida, com um palito fino.
Coloque um pequeno ponto de tinta acrílica no tórax e evite pintar a cabeça, as asas, o abdômen ou as pernas. Deixe a tinta secar por aproximadamente 10 segundos e transfira cuidadosamente as moscas de volta aos seus frascos de isolamento originais. Devolva os frascos de isolamento ao incubador.
Continue com o preparo do equipamento aquecendo o alimento fresco para moscas até que esteja derretido. Use uma pipeta posterior para transferir 0,8 mililitros de alimento para a tampa do frasco com tampa rosqueável e deixe o alimento esfriar. Uma vez que o alimento esteja frio.
Aplicar uma pequena gota de pasta fresca de levedura no centro da superfície do copo de alimento. Lavar o equipamento e as câmaras individuais de combate com água antes de cada uso e secá-los com um papel toalha. Em seguida, aplicar uma gota de massa plástica no copo de alimento e colocá-lo no centro de cada câmara de combate.
Cubra as câmaras de luta com a tampa do aparelho. Posicione o aparelho coberto sob uma fonte de luz e instale uma câmera de vídeo acima da estrutura. Inicie os experimentos comportamentais inserindo divisórias de plástico em cada câmara de luta.
Remova a rolha de algodão do tubo de isolamento e posicione o tubo abaixo de um orifício aberto na lateral do aparelho. Permita que a mosca entre na câmara de luta por eixo geo negativo. Em seguida, feche a parede deslizante após a mosca ter entrado na câmara. Repita o procedimento para introduzir a segunda mosca na câmara de luta no outro lado do aparelho.
Em seguida, coloque o equipamento novamente na posição iluminada para gravação em vídeo. Inicie a gravação e remova o divisor de plástico para permitir que as moscas interajam nos experimentos de efeito perdedor. Grave as primeiras lutas por 20 minutos para garantir a formação de relações de dominância fortes.
Após 20 minutos, recoloque suavemente o divisor de plástico nas câmaras de combate para separar as moscas e interromper a gravação do vídeo. Para induzir uma forte mentalidade de perdedor, certifique-se de que as moscas estabeleçam e mantenham uma relação de dominância durante a primeira luta, e minimize ao máximo a perturbação dos animais ao inserir os divisores para separá-las. Após um período de repouso de 10 minutos, inicie a gravação e remova suavemente o divisor de plástico.
Deixe as moscas interagirem por mais 20 minutos. Pare a gravação após 20 minutos para concluir o experimento. Remova as moscas das câmaras comportamentais por eixo geo negativo invertendo o procedimento descrito antes de o novo método ser usado para observar os primeiros combates.
Em média, o primeiro encontro é observado após dois minutos. O primeiro ataque ocorre após quatro minutos, e as moscas estabelecem uma relação de dominância após oito minutos. Durante os 12 minutos restantes, a relação de dominância é reforçada.
À medida que os vencedores avançam cada vez mais e os perdedores recuam cada vez mais. A nova abordagem foi utilizada para quantificar o efeito do perdedor, ou seja, a porcentagem de perdedores que perdem as segundas lutas durante as segundas lutas. Um efeito significativo é observado quando perdedores anteriores foram pareados com vencedores conhecidos ou com vencedores desconhecidos para suas segundas lutas.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de executar o ensaio de agressão utilizando moscas machos com idade entre seis e sete dias que foram criadas em isolamento social. Assim, uma vez dominadas, essas câmaras permitem a fácil introdução, monitoramento, interação e separação das moscas sem qualquer manipulação, o que induz um forte efeito de perdedor. O uso de divisórias para separar as moscas após a primeira luta permite variações no protocolo experimental.
Podemos manter os vencedores e emparelhá-los com um oponente diferente na segunda luta para induzir um efeito de vencedor. Com pequenos ajustes, as mesmas câmaras podem ser usadas para estudar corte, locomoção e outros comportamentos sociais da mosca-das-frutas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar ensaios de agressão e de como induzir o efeito de perdedor sem manipulação das moscas antes e durante os experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo método para investigar a agressividade em moscas-das-frutas ao eliminar o manuseio, o que reduz o estresse e melhora os resultados comportamentais. O novo design da câmara aumenta a confiabilidade da medição dos efeitos de vencedor e perdedor em Drosophila melanogaster.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Comportamento Animal
Antecedentes
- O manejo de animais pode induzir estresse, afetando estudos comportamentais.
- Os métodos tradicionais frequentemente envolvem manipulação, levando a variabilidade nos resultados.
- Compreender a agressividade em Drosophila pode fornecer insights sobre as dinâmicas comportamentais.
- A eliminação do manejo pode resultar em avaliações comportamentais mais precisas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método que minimize o estresse em moscas-das-frutas durante estudos de agressão.
- Investigar os efeitos do manuseio sobre os resultados comportamentais.
- Aprimorar a confiabilidade da mensuração de comportamentos relacionados à agressão.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de uma nova câmara para estudos de agressividade.
- Eliminação do manuseio antes, durante e após os experimentos.
- Medição de diversos parâmetros comportamentais em Drosophila.
- Comparação dos resultados com métodos tradicionais de manuseio.
Resultados Principais
- Os parâmetros comportamentais mostraram melhora com o novo método.
- Observou-se menor variabilidade entre os indivíduos.
- Efeitos de perdedor mais fortes foram notados na ausência de manipulação.
- As dinâmicas gerais de combate foram aprimoradas.
Conclusões
- O novo design da câmara reduz efetivamente o estresse em moscas-das-frutas.
- A eliminação do manuseio leva a dados comportamentais mais confiáveis.
- Este método pode ser aplicado em estudos adicionais sobre o comportamento animal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aborda um desafio fundamental na neurociência comportamental: minimizar os fatores de confusão experimentais introduzidos pelo manejo de animais. Ao eliminar a intervenção manual, a abordagem aumenta a confiabilidade dos dados para o estudo de alterações comportamentais dependentes da experiência, como os efeitos de perdedor e de vencedor. Isso favorece uma validação mais precisa de alvos em fluxos de descoberta neurocomportamental, nos quais as respostas comportamentais orientam hipóteses mecanicistas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as influências genéticas e ambientais sobre vias relacionadas à agressividade sem as interferências provocadas pelo estresse induzido por manuseio.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade comportamental entre indivíduos, melhorando a sensibilidade do ensaio na detecção de alterações fenotípicas sutis.
- Valor Preditivo: Contribui para a redução de riscos em alvos envolvidos na aprendizagem, memória e comportamento social, fornecendo leituras comportamentais mais precisas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma plataforma padronizada e reproduzível para quantificar a dinâmica de agressividade e a formação de hierarquias sociais.
- Valor Operacional: Facilita fluxos de trabalho compatíveis com alto rendimento por meio da entrada automatizada de moscas via geotaxia e separação de câmaras usando divisórias móveis.
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas quantitativas, como latência da luta, frequência de investidas e tempo das relações de dominância, para aplicações em triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Permite o estudo de alterações comportamentais relacionadas à experiência que modelam aspectos de transtornos psiquiátricos associados à derrota social e reatividade ao estresse.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite o isolamento de circuitos neurais ou vias moleculares específicas que contribuem para a formação do efeito de perdedor, sem interferência de ruídos induzidos por manipulação.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento comportamental longitudinal ao longo de várias rodadas de luta para avaliar a plasticidade comportamental adaptativa ou maladaptativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais fenótipos comportamentais são utilizados para validar alvos que afetam a função de circuitos neurais e a regulação comportamental. Ele permite um fenotipagem consistente antes do avanço para estudos de intervenção mecanicistas ou terapêuticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre genes ou fármacos que influenciam vias relacionadas à agressão, memória social e resposta ao estresse.
- Triagem: Fornece métricas comportamentais quantitativas e reprodutíveis, essenciais para comparar condições genéticas ou farmacológicas.
- Análise: Permite a medição de parâmetros comportamentais temporais (por exemplo, início da luta, frequência de investidas, estabelecimento de dominância) para informar correlações entre dose-resposta ou genótipo-fenótipo.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a modelos pré-clínicos ao capturar comportamentos sociais etologicamente relevantes que refletem mecanismos conservados de estresse e aprendizado.
- Reutilização Corporativa: O design da câmara é adaptável a outros comportamentos sociais de Drosophila, aumentando sua utilidade em múltiplos programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em ensaios comportamentais ao eliminar o manuseio como variável de confusão.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de fluxos de trabalho padronizados e sem manuseio.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção na validação de alvos ao reduzir falsos positivos decorrentes de ruídos comportamentais induzidos pelo estresse.
- Impacto no Portfólio: Permite uma priorização mais precisa de alvos com base em fenótipos comportamentais confiáveis em sistemas relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de Drosophila, observação comportamental e fenotipagem baseada em vídeo.
- Depende do acesso a sistemas de rastreamento comportamental e controles ambientais (ciclos claro/escuro, temperatura, umidade).
- Necessita padronização entre laboratórios quanto à montagem das câmaras, isolamento das moscas e cronometragem dos períodos comportamentais.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir modificações nos mecanismos de entrada baseados em geotaxia.
- As limitações práticas incluem restrições de tamanho das câmaras e dependência da locomoção das moscas para carregamento espontâneo nas arenas.
