Controle mediado por RNAi de aflatoxinas em amendoim: método para analisar a produção de micotoxinas e Transgene Expression na Amendoim /

O objetivo geral deste trabalho é fornecer um método confiável, preciso, barato e rápido para testar a eficácia do silenciamento mediado por RNAi de genes de síntese de aflatoxina de aspergillus em amendoim transgênico usando um número mínimo de sementes, geralmente centenas de gramas de sementes são necessárias para quantificar efetivamente as aflatoxinas em amostras. A principal vantagem desta técnica é que ela usa menos de cinco sementes para testar um determinado tratamento 10 dias antes do preparo das sementes, estabelecer uma cultura de aspergillus flavus positivo para aflatoxina NR RL 3 3 5 7 em meio de trado ZAP Pex. Cultive essa cultura a 25 graus Celsius.

Será usado para inoculação de sementes. Após o preparo das plantas transgênicas que expressam o RNAI, que é detalhado no protocolo de texto, prossiga com a colheita de suas sementes. Primeiro, remova a carpa peric usando abrasão de uma lavadora de alta pressão ajustada para baixo ou raspe a carpa peric com a mão.

Uma vez que a pericarpa é removida, identifique a cor da mesocarpa colocando as vagens em uma placa de maturidade nos grupos adequados. Agora remova os orifícios e processe as sementes amarelas e marrons separadamente. Calcule o número de sementes necessárias para o experimento pelo menos três pedaços de sementes, o que significa que são necessárias três metades de co-chumbo por linha de amendoim que está sendo amostrada.

Cubra o fundo de um béquer estéril com uma camada de sementes e, em seguida, cubra as sementes com um volume medido de 75% de etanol. Em seguida, dobre esse volume. Deixe as sementes incubarem em solução por 30 segundos e depois enxágue-as em água destilada esterilizada.

Em seguida, trate as sementes com um volume de 2% de hipoclorito como feito com o etanol F. Deixe esta incubação prosseguir por cinco minutos. Em seguida, use três enxágues em volumes cinco vezes maiores de água destilada esterilizada.

Para remover o hipoclorito, é fundamental que toda a solução de hipoclorito seja lavada nesta etapa. As sementes agora são esterilizadas na superfície. Em seguida, hidrate as sementes submergindo-as em água destilada esterilizada por duas horas, preparada para colocar as sementes hidratadas em uma placa de Petri estéril.

Todos os materiais devem ser esterilizados neste momento. Remova os tegumentos das sementes usando uma pinça e, em seguida, separe o cohain. Por fim, remova os embriões com um bisturi.

Os embriões podem ser descartados ou usados para regenerar novas plantas. Em seguida, corte a oleína ao meio com um bisturi e mergulhe as metades e a água destilada esterilizada até que estejam prontas para a inoculação. Em seguida, seque o excesso de água da metade do co-chumbo em toalhas de papel estéreis e coloque os pedaços de sementes em placas separadas de 1,5% com divots do tamanho da semente e coloque as sementes neles com os lados cortados para cima para inocular as metades do co-chumbo.

Adicione dois microlitros de uma suspensão de 10.000 esporos de aspergillus por microlitro às superfícies de corte. Não deixe a suspensão escorrer pelas laterais da semente pela metade. Por fim, coloque os pratos em uma incubadora escura a 30 graus Celsius por um a quatro dias até que sejam testados.

Após um dia, após dois dias e após três ou quatro dias, as sementes removem suavemente as metades inoculadas selecionadas aleatoriamente, conforme necessário. Use um lenço de papel para limpar o excesso de esporos e trado e coloque a amostra em um frasco com tampa de rosca de vidro. Transfira amostras não inoculadas para tubos de dois mililitros para análise RTPCR.

Amostras grátis em nitrogênio líquido e armazene amostras congeladas em um freezer até que sejam processadas. Para a análise de aflatoxina, obtenha a semi-leita inoculada em um frasco de tampa de rosca de vidro de quatro mililitros, se necessário. A amostra ficará estável por muitos meses a 80 graus Celsius negativos.

Quando as sementes estiverem à temperatura ambiente, extraia a amostra adicionando quatro volumes de metanol e deixando os tubos incubarem durante a noite no escuro à temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, execute o UPLC primeiro, prepare uma mini coluna de propileno de 1,5 mililitro com uma frita correspondente. Em seguida, adicione 200 miligramas de óxido de alumínio.

E em seguida, insira outra frita. Próxima posição, A-U-P-L-C autos frasco amostrador sob e em contato com a mini coluna para minimizar a evaporação. Agora adicione 0,5 mililitros de extrato de metanol da amostra a um copo descartável dois não plástico.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de aceto nitrilo ao tubo e misture as soluções com uma pipeta. Agora aplique 0,5 mililitros da mistura na mini coluna preparada e colete o EIT usando apenas a gravidade. Uma vez que o EIT é coletado, prenda rapidamente uma tampa séptica ao frasco de coleta para uso no UPLC.

Coloque os frascos em A-U-P-L-C já preparados com uma fase móvel de teste de metanol aquático e acedonita. Em seguida, quantificar o teor de aflatoxinas nas TIEs. Consulte o protocolo de texto para obter mais detalhes junto com a análise UPLC.

Configure os pedaços de sementes usados para extração em frascos de vidro individuais. Em seguida, liofilize os frascos durante a noite e meça o peso seco da amostra de tecido pela manhã para que as concentrações de aflatoxina possam ser expressas em nanogramas por grama de amostra. Em seguida, remova as amostras do freezer e adicione triol e triture os tecidos congelados com um homogeneizador de moinho de esferas a 3.100 RPM por 40 segundos e prossiga para a extração de RNA, um vetor de RNAI carregando pequenos fragmentos de cinco genes de síntese de aflatoxina de um flavis foi usado para transformar plantas de amendoim.

Os números de identificação correspondem aos números de anotação do genoma do instituto amplo de 99 TRANSFORMANTES regenerados, sete linhas positivas de PCR foram clonadas e testadas conforme descrito. Todos os sete apresentaram 60 a 100% menos acúmulo de aflatoxina em comparação com as linhas de controle. Os resultados de duas das sete linhas são apresentados.

Essas duas linhas RN AI mostraram a presença do NPT dois marcadores selecionáveis. De acordo com os resultados do S-T-N-P-C-R, o controle negativo utilizado foi uma linhagem PCR negativa que passou pelo processo de transformação para testar as linhagens de RNAi quanto à sua capacidade de resistir a aflatoxinas recém-colhidas kedia de uma aflatoxina positiva. Uma linha de flavis NRRL 3 3 5 7 foi aplicada a meio berço de chumbo sem embrião e testa após incubação por até 96 horas.

Os tecidos inoculados foram processados usando UPLC para medir seus níveis de aflatoxina conforme descrito. Esses resultados foram confirmados por espectrometria de massa por cromatografia líquida. No geral, o RNAi 2 88 72 mostrou uma redução de 94 a 100% na aflatoxina B dois e uma redução de 90 a 100% na aflatoxina B em comparação com o controle.

Já o RNAi 2 88 74 apresentou uma redução de 60 a 100% em ambas as aflatoxinas. Seguindo este procedimento, os mesmos extratos de sementes podem ser usados para analisar o fito Xin a fim de entender melhor a resposta da semente à invasão fúngica. Este método também fornecerá uma ferramenta única para ajudar a desenvolver a tecnologia de RNAI para o controle de micotoxinas.