Name: Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a produzir materiais biomiméticos com adesinas recombinantes acopladas a micropartículas para estudar interações bactérias-hospedeiro. Este método permite analisar a adesão bacteriana e seus efeitos na sinalização celular.

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Os autores agradecem aos membros do grupo Krachler pela leitura crítica do manuscrito. DHS, DV e AMK foram financiados pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BB / L007916 / 1), FA foi financiado por uma bolsa de estudos do Ministério do Ensino Superior e Pesquisa Científica da República do Iraque e o NPS foi financiado por uma bolsa CONICYT.

1. O acoplamento químico de proteínas a polímeros Grânulos <ol><li> Tiol-amina acoplamento direccional Nota: Este protocolo é adequada para o acoplamento de proteínas contendo cisteína a amina funcionalizada pérolas de polímero, usando sulfosuccinimidil 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulação (Figura 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Figura 1. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-amina das proteínas de pérolas de polímero. Amina-esferas de poliestireno modificadas são activados com Sulfo-SMPB. A maleimida reage com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de reagentes: <ol><li> Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li&gt; <li> Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS) de TCEP (Tris (2-carboxietil) fosfina) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Ativação Bead: <ol><li> Misture a suspensão de pérolas, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. </li><li> Adicionar 200 ml de 10 mM preparada de fresco Sulfo-SMPB, para dar um final de concentração de 2 mM. </li><li> Incubar a suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. </li></ol></li><li> Redução da proteína: <ol><li> Durante o período de incubação da etapa de activação, se preparar a proteína para o seguinte passo de acoplamento para que possa ser imediatamente adicionado às esferas activadas. Nota: Embora este passo de redução não é sempre necessária para GST (glutationa S-transferase) proteínas de fusão, recomenda-se a assegurar uma alta eficiência de acoplamento. <ol><li> Verifique a concentração de proteína, e ajustá-lo para a concentração final necessária para a reacção de acoplamento. Nota: proteína 6 mM em PBS, e um volume de 1 ml são normalmente utilizados. </li><li> Adicionar da TCEP para dar uma concentração final de 5 mM. Incubar a solução durante 30 min à TA. Nota: A mistura de reacção pode ser utilizado directamente para a seguinte reacção de acoplamento. </li><li> Reter uma pequena quantidade (alguns ml) da solução de proteína para determinar o pró<html> tein concentração e cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). </li></ol></li></ol></li><li> Proteína passo de acoplamento: <ol><li> Agregar as esferas activadas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga), e lava-se a pelota uma vez em 1 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Ressuspender o sedimento em solução de proteína preparada (por exemplo, 1 ml), para dar a concentração de proteína desejada. Nota: A concentração de proteína durante o passo de acoplamento vai depender da eficiência média de acoplamento (ver secção 2 para a determinação da eficiência de acoplamento) e densidade de acoplamento desejado (tal como calculados em 1.1.4.3). A eficácia é de cerca de 85% e a concentração final desejada em 5 mM de 10x a suspensão do grânulo, de modo que a concentração de proteína durante o passo de acoplamento deve ser de aproximadamente 6 mm. </li><li> Calcula-se a densidade de acoplamento utilizando a seguinte fórmula: jpg &quot;/&gt; onde ρ c densidade de acoplamento [número de moléculas de proteína / nm 2], proteína concentração de proteína conc [mg / ml], proteína M w peso molecular da proteína [Da], talão conc concentração talão [número de contas / L], diâmetro do grânulo d [nm 2] O número de Avogadro </li><li> Utilizar a densidade de acoplamento para o cálculo do espaçamento médio ligando: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Incubar a suspensão de proteína de grânulo durante 2 horas a 25 ° C numa roda rotativa. Nota: Algunsproteínas pode não ser estável à temperatura ambiente. Nestes casos, a reacção pode ser levada a cabo a 4 ° CO / N. </li><li> Desactivar restantes grupos activados sobre os grânulos por adição de estoque de cisteína até uma concentração final de 50 mM e incuba-se a suspensão durante 30 min a 25 ° C numa roda rotativa. Sedimentar as pérolas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga). </li><li> Manter o sobrenadante para a determinação da concentração de proteína e o cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com talão 1 ml de PBS e ressuspender em 1 ml de PBS fresco para dar o produto final. Nota: O protocolo acima irá tipicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a uma concentração final de proteína de 5 mm, o que pode ser usado como um estoque 10x para experiências subsequentes (ver secção 3). </li><li> Para prosseguir com a secção 3 do protocolo, trabalhar com 100 ml / ml de estoque de talão ou a uma concentração final de 500 nM de proteína. Nota: Um bom ponto de partida para este Procedure será de 2 × 10 12 contas / ml, resultando numa densidade média de acoplamento de 3 x 10 -4 proteínas / nm 2 ou um espaçamento médio de 57 nm sobre um grânulo de 2 mm de diâmetro. </li></ol></li></ol></li><li> Acoplamento direccional tiol-carboxi Nota: Este protocolo é adequado para o acoplamento de cisteína contendo proteínas para esferas de poliestireno funcionalizado-carboxilo. O radical carboxilo é primeiro activado usando 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxissuccinimida (NHS), e, em seguida, amina modificada reticulada usando Sulfo-SMPB (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Figura 2. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-carboxilo de proteínas com pérolas de polímero de poliestireno carboxilado. Grânulos são primeiro activado com EDC e modificadas com NHS para formar um semi-estável de NHS-éster. Subsequente amina-acoplamento de ethylenediResultados da amina num grupo amina livre, a qual reage com Sulfo-SMPB. Maleimida ativado grânulos podem então reagir com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de reagentes: <ol><li> Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li><li> Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS), de TCEP imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma 10x estoque (20 mM, ou 4 mg / ml em PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma 10x estoque (50 mM, ou 6 mg / ml em PBS) de NHS (N-hidroxissuccinimida) imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente bntes de uso. </li></ol></li><li> Ativação Bead: <ol><li> Misture a suspensão do grânulo, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. </li><li> Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. </li><li> Adicionar 100 ml de 10x da EDC (2 mM de concentração final) e imediatamente 100 ml de solução de reserva 10x de NHS (5 mM de concentração final) para a suspensão do grânulo. </li><li> Incubar a suspensão de esferas durante 30 minutos a 25 ° C numa roda rotativa. </li><li> Lavar grânulos uma vez em 1 ml de PBS e ressuspender em 0,8 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Adicione 200 ml de etilenodiamina, e incUbate da suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. </li><li> Lavar grânulos uma vez com 1 ml de PBS e ressuspender as contas em 0,8 ml de PBS fresco. </li><li> Proceda da secção 1.1.2.4 (ativação talão com Sulfo-SMPB) conforme descrito no ponto 1.1.2 e siga o resto do protocolo descrito na secção 1.1 (acoplamento direcional Tiol-amina). Realizar a preparação de proteínas e acoplamento de proteínas passos de um modo idêntico ao descrito na secção 1.1. Nota: A eficiência de acoplamento típico usando este protocolo é ligeiramente inferior em comparação com a secção 1.1, portanto, ajustar a concentração de proteína inicial em conformidade para atingir a mesma densidade de acoplamento (75% aprox.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Determinação da eficiência de acoplamento Nota: Para determinar a concentração de proteína, utilizar Bradford Reagente 10 e ensaios colorimétricos como se segue: <ol><li> Inverta suavemente Reagente Bradford para e<html> Nsure homogeneidade do reagente. </li><li> Usando um ml de solução concentrada a 10 mg / BSA, preparar padrões de proteína cobrindo concentrações entre 0,1 e 1,5 mg / ml de BSA em tampão. </li><li> Adicionar 250 ml de reagente de Bradford para poços de uma placa de 96 poços. Prepare poços suficientes para todas as amostras, padrões de proteínas e controles negativos (apenas tampão). </li><li> Adicionar 5 ml de amostra de proteína (padrões proteicos ou tampão, para o controlo negativo) ao reagente na placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa num agitador orbital à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Medir a absorvância a 595 nm utilizando um leitor de placas. </li><li> Gerar uma curva padrão de concentração BSA contra A595 nm e usar isso para determinar concentrações de proteínas em amostras iniciais e sobrenadante. </li><li> Calcula-se a concentração de proteína acoplada como se segue: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Calcula-se a eficiência de acoplamento como: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Utilização de Bead-acoplado Adesinas em ensaios de competição <ol><li> Preparação: <ol><li> Semente de 1 ml por poço de células HeLa, a uma concentração de 150.000 células / ml numa placa de 24 poços um dia antes do ensaio de competição, para permitir que as células a atingir aproximadamente 80% de confluência, antes de se iniciar o experimento. </li><li> Configure cada condição experimental em triplicado. Incluir poços para controlos negativos (sem bactérias adicionados durante ensaios de competição), controlos positivos (esferas de controlo acoplados a fusão-tag só acrescentou durante ensaios de competição) e controles de lise (para experiências de citotoxicidade). </li><li> Inocular um LB (MLB) cultura de 5 ml marinho com uma nova colônia de V. parahaemolyticus e crescer O / N a 30 ° C, agitando. </li><li> Prepare suficiente MAM-coupled talão, como descrito na seção 1. (Coupling). Permitir para 100 ml de 10x estoque talão por poço. </li></ol></li><li> Ensaio de competição: <ol><li> No dia do competitexperimento de iões, medir a DO600 da cultura bacteriana. </li><li> Prepare meio de infecção por diluição de culturas bacterianas em meio DMEM incolor sem aditivos, pré-aquecido a 37 ° C, contendo 10% de suspensão v / v grânulo (ou pérolas ou grânulos de controlo acoplado a adesina), para se obter um MOI de 10. Preparar 1 mL / bem e 10-20% de excesso de volume por amostra. Nota: Para as condições acima mencionadas (placa de 24 poços, V. parahaemolyticus, MOI 10), o volume necessário de cultura D / N para ser adicionado por poço (ml / ml) é calculada como 3 / DO600 da cultura. Por exemplo, 1 ml de meio de infecção conterão tipicamente 100 ml de suspensão de esferas, com alguns ml de cultura bacteriana e ser formadas até 1 ml com incolor, DMEM sem suplementos. </li><li> Remover o meio velho dos poços e lavar as células HeLa em cultura através da adição de 1 ml de PBS estéril, pré-aquecido a 37 ° C a cada poço. </li><li> Remover PBS e adicionar 1 ml de meio de infecção por poço. Também configurar os controles, adicionando soluções containing esferas de controlo e bactérias (controlo positivo) ou grânulos de adesina e sem bactérias (controlos negativos), ou DMEM contendo 0,1% de Triton X-100 (controlo, só é necessária para as medições de citotoxicidade de lise). </li><li> Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante o período de tempo desejado (por exemplo, 4 horas para medições de citotoxicidade ou 1 h durante as medições de adesão). Nota: A aderência bacteriana e citotoxicidade em células hospedeiras podem ser utilizadas como limite de leitura para a eficácia da inibição. Se os pontos de tempo de citotoxicidade e de adesão medições coincidem, ambos os ensaios podem ser realizados utilizando amostras a partir do mesmo poço, uma vez que a citotoxicidade é determinada usando o sobrenadante da cultura e ensaios de ligação utilizar amostras derivadas a partir da camada de células remanescente. </li></ol></li><li> Medições Citotoxicidade: <ol><li> Nos pontos de tempo indicados (por exemplo, 4 horas após a infecção), remover três vezes 200 ml de cada um de 24 poços e a transferênciauma placa de 96 poços. </li><li> Rotação placas de 96 poços a 1500 xg, 5 min e de transferência de 100 ml de cada cavidade para uma nova placa de 96 poços. Adiciona-se 100 ml de meio utilizado durante as experiências de infecção para poços frescas da placa de 96 poços em triplicado (estes vão ser usados ​​como espaços em branco). </li><li> Levar a cabo o ensaio de desidrogenase (LDH), libertação de lactato, utilizando um kit de detecção da LDH citotoxicidade e seguindo as instruções do fabricante. <ol><li> Resumidamente, calcular a quantidade de reagente necessários em incrementos de 25 (por exemplo, se 62 amostras estão a ser medido, compõem mistura reagente suficiente para 75 etc.). </li><li> Por exemplo, por 100 amostras, misturar 11,25 ml de reagente A com 250 ul de reagente B. Inverter, não vortex para evitar a formação de espuma. </li><li> Coloque a mistura em um reservatório para ser capaz de pipetar com uma pipeta multi-canal. Adiciona-se 100 ul de mistura reagente a cada amostra. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente e ler a absorvância a 490 nm num leitor de placas a 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analisar o conjunto de dados para o qual a absorvância da amostra de controlo de lise é elevada, mas ainda dentro da gama linear do leitor de placas (geralmente, 2-3 unidades de absorvância). </li><li> Expresso de resultados como% de citotoxicidade, usando a seguinte fórmula de conversão: <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Medição de adesão bacteriana: <ol><li> Em pontos de tempo indicados (por exemplo, 1 hr de infecção pós), remova a mídia da camada de células. </li><li> Lave completamente a camada de células com estéril, PBS pré-aquecido (pelo menos 3-4 lavagens de 1 ml de PBS de cada) para remover quaisquer células un-ligado. </li><li> As células hospedeiras de Lise por adição de 1 ml de uma solução estéril a 1% v / v de Triton X-100 em PBS por poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar cada amostra cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 diluições em série de amostrasem PBS estéril (por exemplo, utilizar 100 ml de amostra e 900 ml de PBS). </li><li> Placa de 100 ml de cada amostra em agar MLB e espalhado utilizando um espalhador de célula. Otimizar que diluições ao prato dependendo das estirpes bacterianas e ponto de tempo. Nota: Para a montagem experimental descrita, 10 5 ou 10 6 diluições dar um número adequado de UFCs. </li><li> Incubar as placas a 37 ° CO / N e enumerar as bactérias por contagem de colónias. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrevemos dois protocolos, que podem ser usados ​​para proteínas contendo tiol par de amine- ou esferas de poliestireno modificado por carboxilato de etilo, respectivamente. Devido à facilidade do processo, o acoplamento tiol-amina é preferível, mas dependendo da especificação grânulo desejado (diâmetro, propriedades de fluorescência), a utilização de grânulos funcionalizado com amina pode não ser possível e que têm, portanto, incluído um protocolo que vai converter o carboxilato - em um grupo amina para dar o pesquisador a maior flexibilidade possível na escolha de andaime. Embora ambos tiol-amina e tiol-carboxilo trabalho de acoplamento para qualquer cisteína contendo proteína, acoplamento direccional (por exemplo, a imobilização da proteína por seu N-terminal, que imita a exposição de superfície) requer uma proteína sem resíduos de cisteína, que é produzido como uma fusão de GST proteínas, ou que contém um resíduo de cisteína terminal único introduzido por mutagénese dirigida ao local. Se várias cisteínas reactivos estão contidosdentro da proteína, isto levará a imobilização aleatório que pode impedir a função da proteína. Muitos adesinas bacterianas não contêm cisteínas naturalmente. Para outros, estes podem ser removidos por mutagénese dirigida, embora isso exigiria ensaios extensivos para garantir que a estrutura e função nativa são retidos no mutante. Para as proteínas de fusão GST, GST-tag purificada acoplado a esferas pode ser utilizado como um controlo negativo adequado. Usando contas de desacoplados como um controle deve ser evitado, uma vez que estes muitas vezes têm uma maior tendência a se aglutinarem ou aderir a células não-especificamente. Uma versão simplificada do protocolo 1.2., Utilizando apenas EDC, pode ser utilizado para proteínas par de pérolas de polímero funcionalizado com carboxilo, no entanto, neste caso, o acoplamento ocorre através de aminas primárias na proteína e, portanto, não garante o acoplamento direccional. TCEP como um agente redutor não deve ser substituído por outros agentes de redução comercialmente disponíveis e vulgarmente utilizados, tais como dithiothreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol (BME), como os tióis contidos dentro delas irá competir com acoplamento de proteína no passo de acoplamento tiol-maleimida. PBS pode ser substituído com outros tampões, mas com as seguintes considerações: Os tampões não pode conter aminas primárias (SO-Tris contendo tampões não são adequados). O uso de tampões contendo concentrações de sal muito baixos (&lt;10 mm) leva a talão aglomeração e também devem ser evitados. A pureza da proteína é também um factor importante a considerar durante o procedimento, e para a obtenção de dados de elevada qualidade, as proteínas devem ser usados ​​puros. Rotineiramente purificar proteínas em vários passos, incluindo pelo menos um passo de purificação por afinidade e filtração em gel, mas em alguns casos, cromatografia de permuta iónica é realizada como um terceiro passo. Como resultado, a pureza das proteínas utilizadas para o acoplamento é geralmente de 90% ou superior, tal como avaliado por SDS-PAGE. Recomenda-se para determinar concentrações de proteína, tanto na mistura reaccional inicial, bem como de the sobrenadante após a conclusão da reacção. Isto irá ajudar a determinar a concentração de proteína acoplada aparente-grânulo, e assim a densidade de acoplamento. Determinação de ambos os valores também irá permitir o cálculo da eficiência de acoplamento. Esta pode ser tida em conta quando se prepara a solução de proteína inicial em reacções subsequentes, para obter a densidade e concentração de acoplamento final desejado. Bradford reagente é particularmente adequado para a determinação da concentração de proteína antes e após a reacção de acoplamento, uma vez que nenhuma das substâncias na reacção interfere com a formação de complexos de corante nas concentrações utilizadas. Se as concentrações de proteína inferiores são para ser usado, este método pode ter de ser substituído por um método de detecção mais sensível, porém, a atenção tem de ser pago para o facto de que tem que ser compatível com as substâncias contidas no interior da reacção de acoplamento. Também é recomendado usar reagentes recém-preparados e lidar com reagentes em pó com cuidado (por exemplo, lojasem um recipiente fechado e usá-grânulos de sílica, a fim de evitar os reagentes desenho humidade) desde a qualidade dos reagentes irão influenciar a eficiência de acoplamento. Se a eficiência de acoplamento é menor do que o esperado, possíveis soluções incluem o aumento da concentração inicial de contas e de proteína. Se estão a ser usadas concentrações mais elevadas, a concentração dos reagentes de acoplamento tem de ser aumentada proporcionalmente para garantir um excesso molar suficiente. Modificando concentrações talão / proteína é geralmente um melhor passo para a otimização em vez de aumentar os tempos de reação. Dado que os protocolos de acoplamento grânulo são longos, que vulgarmente se preparar um lote grande de material. Alíquotas da suspensão podem ser congeladas em azoto líquido e armazenado a -20 ° C durante vários meses. Descongeladas aliquotas não deve ser novamente congelada e deve ser mantida a 4 ° C e usadas dentro de 1-2 dias. No entanto, isto pode variar com a natureza e a estabilidade da proteína usada como deve ser testado em um pequeno lote inicialmente. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; adesinas Bead-acopladas podem ser usadas para muitas aplicações, tal como discutido abaixo. Este protocolo descrito um ensaio que é utilizada para medir a inibição da citotoxicidade mediada por ligação e agente patogénico em células hospedeiras. O ensaio é normalmente realizada para medir a capacidade de MAMs acoplado com pérolas para inibir competitivamente a infecção de células epiteliais HeLa com o marisco microrganismos patogénicos Vibrio parahaemolyticus, utilizando quer uma diminuição na fixação bacteriana às células hospedeiras ou reduzida citotoxicidade como uma leitura . Em ambos os casos, a preparação e ensaios de competição seguem o mesmo protocolo. Dependendo da leitura, diferentes estirpes de V. parahaemolyticus estão sendo usadas: a estirpe citotóxica POR1 é usado para as medições de citotoxicidade, ao passo que a estirpe não-citotóxica POR2 é usado para medir a adesão bacteriana, uma vez que a morte celular e destacamento celular compromete o procedimento para quantificar bactérias aderidas. Inicialmente, compeexperimentos foram concor- configurado como um protocolo de passo a passo, em que as células hospedeiras são primeiro pré-incubadas com os grânulos antes da adição de bactérias. Para V. parahaemolyticus e as especificações do talão (2 uM utilizados grânulos acoplados a MAM7), ambos os grânulos e as bactérias podem ser adicionados ao mesmo tempo, sem alterações na citotoxicidade resultante. Ou seja, neste sistema experimental, grânulos outcompete bactérias para a ligação da célula hospedeira. Dependendo da espécie bacteriana e talão geometria utilizada, pode haver boas razões para manter a adesão do grânulo e infecção bacteriana como dois passos separados. Por exemplo, para infectar as células com as bactérias não móveis, as placas são centrifugadas geralmente após a adição do meio de infecção. No entanto, a centrifugação das placas contendo suspensões talão deve ser evitado, uma vez que isto conduz a uma distribuição altamente irregular de pérolas sobre a camada de células. Se estão a ser utilizados tamanhos de partícula mais pequenos, grânulos levará mais tempo para resolver sobre a superfície da célula, no caso em que suficiente tempo deve ser permitida para fixação talão antes da infecção. Quando a aderência de bactérias é usado como um lido, as amostras devem ser tomadas em pontos de tempo em que as células hospedeiras não são significativamente danificados pela estirpe infectante, como descolamento celular e lise pode comprometer a quantificação de bactérias aderidas. Em vez de enumerar adesão bacteriana por diluição em placas, as amostras podem, alternativamente, ser processado para a imagem latente (Figura 5). Neste caso, as células de cultura de tecidos deve ser semeadas em lamelas de vidro, em vez de directamente em poços. Além disso, podem ser usadas pérolas fluorescentes e bactérias que expressam uma proteína fluorescente, juntamente com marcadores de células hospedeiras específicas da infecção. Por exemplo, experiências de competição são comumente fotografada usando vermelho fluorescente rodamina-faloidina para corar o citoesqueleto de actina das células hospedeiras e avaliar as alterações morfológicas resultantes de infecção, em conjunto com os grânulos azuis fluorescentes e fluorescenteverde (GFP expressando ou SYTO18 manchado) bactérias. Uma variedade de adesinas acoplado-grânulo, incluindo o Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 MID e Vibrio parahaemolyticus MAM, têm sido utilizados como materiais biomiméticos para estudar a adesão, a inibição da adesão e a contribuição de adesão ao mediada por patogénio citotoxicidade 1, 7, 8. Uma das vantagens da utilização desta abordagem é a facilidade de visualização de eventos de fixação, uma vez que as pérolas de polímero utilizadas como suportes estão disponíveis numa larga gama de cores (por exemplo, azul, vermelho fluorescente, azul, verde, laranja). Assim, a marcação directa de proteínas, a qual pode interferir com a função, pode ser evitada. Além disso, a superfície de acoplamento imita o visor multivalente de adesinas na superfície bacteriana, o que reflecte uma conformação mais fisiologicamente relevante em comparação com proteínas solúveis. Em comparação com estudos utilizando bactérias intactas ou bacterial mutantes, a abordagem grânulo contorna os problemas associados com o crescimento bacteriano. Por exemplo, a longo prazo (por exemplo, O / N) os estudos de adesão bacteriana às células hospedeiras utilizando bactérias intactas são frequentemente comprometida por fenómenos que acompanham o crescimento bacteriano - acidificação da depleção de meio de crescimento e nutrientes afectar negativamente células hospedeiras e replicação bacteriana, eventualmente, compromete qualidade de imagem. Mais recentemente, o uso de adesinas-coupled talão foi estendido para incluir o seu uso como ferramentas para purificações afinidade de acolhimento celular fatores envolvidos em processos a jusante de fixação bacteriana sinalização. V. parahaemolyticus MAM7, através da ligação a ácidos fosfatídicos na membrana da célula hospedeira, provoca a activação RhoA e actina rearranjos 1, 3. grânulos acoplado-MAM estão a ser usadas para purificar e identificar proteínas envolvidas nas plataformas de sinalização montados como uma consequência da célula MAM-hospedeiro obrigatório. Uma vez que os grânulos podefacilmente ser separados do sobrenadante por um passo de centrifugação curta, e a proteína de interesse é covalentemente acoplado, este é um bom método para conseguir a separação de proteínas contaminantes e enriquecer os complexos de proteína em causa, o qual pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a proteómica ou Western mata-borrão.

Dissecar as interações entre adesinas bacterianas e receptores de superfície do hospedeiro na interface patógeno-hospedeiro é um passo essencial para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes que impulsionam a adesão bacteriana. Em última análise, isso nos ajudará a identificar estratégias para interferir nesses processos durante as infecções. Na realização de tais estudos, muitas vezes enfrentamos um dilema: a análise bioquímica e biofísica dos mecanismos moleculares de ligação à adesina requer sua separação de outros componentes da parede celular, o que pode interferir nos eventos de adesão. Por outro lado, o uso de proteínas solúveis recombinantes simplifica demais o evento de adesão, desconsiderando a ancoragem da proteína na parede celular bacteriana e a multivalência da ligação alcançada por meio da exibição da superfície bacteriana. Da mesma forma, do ponto de vista da célula hospedeira, encontrar e se ligar a moléculas únicas de adesina nem sempre tem o mesmo impacto em termos de organização da membrana plasmática, fluidez da membrana e agrupamento de receptores1 e isso, em última análise, dificulta a avaliação do impacto da adesão na sinalização celular do hospedeiro e o resultado das interações bactéria-hospedeiro. 
Recentemente, foi desenvolvido um método pelo qual adesinas purificadas recombinantes ou fragmentos de adesina são acoplados direcional e covalentemente a partículas de polímero semelhantes em tamanho às bactérias, imitando assim a exibição da superfície bacteriana. Essa abordagem tem sido usada em uma variedade de adesinas diferentes, desde moléculas de adesão multivalente Gram-negativas (MAMs)2, 3, até adesinas Gram-positivas, incluindo a proteína de ligação à fibronectina Staphylococcus aureus (FnBPA)4, 5 e Streptococcus pyogenes F1 6, 7. Esse método permitiu a dissecação de fragmentos de adesina importantes para a ligação da célula hospedeira, a identificação dos receptores da superfície do hospedeiro e a determinação de seu comportamento na superfície da célula hospedeira, levando em consideração a afinidade e a avidez de ligação 1, 8. Além disso, essa abordagem tem sido usada para investigar a eficácia de adesinas e derivados imobilizados como inibidores das interações patógeno-hospedeiro 8, 9. Foi demonstrado que derivados acoplados à superfície da Molécula de Adesão Multivalente Vibrio parahaemolyticus (MAM) 7 podem ser usados para atenuar uma série de infecções bacterianas in vitro, incluindo aquelas causadas por patógenos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) 7, 9. 
Aqui, descrevemos diferentes produtos químicos que podem ser usados para imobilizar adesinas a partículas de poliestireno funcionalizadas disponíveis comercialmente. Devido à ampla gama de funcionalidades de superfície disponíveis, rótulos e tamanhos de partículas, estes são um andaime útil para a produção de materiais bacteriomimiméticos para investigar as interações adesina-hospedeiro. Descrevemos ainda métodos para a caracterização inicial da reação de acoplamento e para o cálculo de propriedades importantes dos materiais resultantes. Finalmente, o uso de adesinas acopladas a esferas como inibidores competitivos de infecções bacterianas in vitro é discutido como um exemplo de sua aplicação, bem como o escopo futuro e as limitações dessa abordagem.

<table><tbody><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)</td> <td>Sigma</td><td>646547</td><td>Perigo; corrosivo pode ser comprado como solução ou</td></tr><tr><td>recém preparado Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato (Sulfo-SMPB)</td> <td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Perigo;</td></tr><tr><td>tóxico L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Perigo; tóxico</td></tr><tr><td>Contas de látex, poliestireno modificado com amina, azul fluorescente - suspensão aquosa, 2.0&nbsp; &mu; m tamanho médio de partícula</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>nocivo; uma variedade de tamanhos e cores de partículas alternativos está disponível</td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de poliestireno modificados com carboxilato</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>prejudicial; uma variedade de tamanhos e cores de partículas alternativos está disponível</td></tr><tr><td>Etilenodiamina</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Perigo; inflamável, corrosivo, tóxico, sensibilizante</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Perigo; corrosivo e tóxico</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Glicose média - alta - Com 4.500 mg/L de glicose e bicarbonato de sódio, sem&nbsp; L-glutamina, piruvato de sódio e vermelho de fenol, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>para experimentos de infecção</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>para manutenção de células hospedeiras cultivadas</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, suplemento Sigma</td><td></td><td>F9665</td> inativado pelo calor <td>para meio</td></tr> <tr><td>de cultura de tecidosPenicilina-Estreptomicina - Solução estabilizada, com 10.000 unidades de penicilina e 10&nbsp; mg estreptomicina/mL, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células</td><td>Suplemento Sigma</td><td>F9665</td><td>para meio de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Kit de detecção de citotoxicidade</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes</td><td></td><td></td> de plástico (25ml)SLS F267660 <td></td></tr><tr><td></td> placas de 24 poços <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>leitor</td><td></td><td></td><td></td>de placas</tr><tr><td>instalações</td><td></td><td></td> <td>de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>pipeta</td><td></td><td></td><td></td> multicanal</tr></tbody></table>

materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

A ligação bacteriana às células hospedeiras é um dos primeiros eventos durante a colonização bacteriana dos tecidos do hospedeiro e, portanto, uma etapa fundamental durante a infecção. A caracterização bioquímica e funcional das adesinas que medeiam essas interações iniciais bactéria-hospedeiro é frequentemente comprometida pela presença de outros fatores bacterianos, como componentes da parede celular ou moléculas secretadas, que interferem na análise. Este protocolo descreve a produção e o uso de materiais biomiméticos, consistindo em adesinas recombinantes puras quimicamente acopladas a esferas de poliestireno funcionalizadas disponíveis comercialmente, que têm sido usadas com sucesso para dissecar as interações bioquímicas e funcionais entre adesinas bacterianas individuais e receptores de células hospedeiras. Protocolos para diferentes químicas de acoplamento, permitindo a imobilização direcional de adesinas recombinantes em scaffolds poliméricos, e para avaliação da eficiência de acoplamento dos materiais "bacteriomiméticos" resultantes também são discutidos. Descrevemos ainda como esses materiais podem ser usados como uma ferramenta para inibir a citotoxicidade mediada por patógenos e discutimos o escopo, as limitações e outras aplicações dessa abordagem no estudo das interações bactéria-hospedeiro.

O V. parahaemolyticus adesina MAM7 contém sete em tandem entrada de células de mamíferos (MCE) domínios envolvidos em reconhecimento de receptores de superfície de acolhimento. Utilizou-se esferas de poliestireno acoplado a recombinante, fragmentos purificados englobando tanto todos os domínios de sete em tandem (MCE MAM7) ou apenas o primeiro domínio de MCE (MAM1) para testar a capacidade destes materiais para competir com V. parahaemolyticus para ligação da célula hospedeira e a eficácia resultante destes materiais como inibidores da adesão. As células HeLa foram infectadas com V. parahaemolyticus estirpe POR1, e a citotoxicidade resultante da infecção in vitro foi avaliada após 4 horas (Figura 3). O tratamento de células HeLa com 0,1% de Triton X-100 (testemunha lise positiva) resultou em lise das células completas, células não infectadas apresentado níveis muito baixos de citotoxicidade. In vitro, a infecção de células não tratadas com POR1 resultou em níveis muito elevados de lise celular, e este foi inibida por co-MAM7upled grânulos mas não MAM1 acoplado ou grânulos de controlo acoplados à GST (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização de Vibrio parahaemolyticus citotoxicidade induzida em células epiteliais durante ensaios de competição. As células foram tratadas com V. parahaemolyticus (Vp), indicadas com (+), ou a presença de bactérias (-) na presença de diferentes entidades concorrentes (comp.), como indicado. Estes incluíram tanto no comp. (-), Grânulos (MAM7 MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST). Como controlos, as células foram tratadas com Triton X-100 (Triton, controlo de lise), ou para a esquerda não infectado (uninf). Liberação de LDH após 4 horas foi medida como descrito no capítulo 3, e os resultados normalizados para controles Triton (100%) e brancos (0%) como descrito acima. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Enumeração de V. parahaemolyticus ligado ou a células não tratadas ou células HeLa, incubadas com MAM7-, MAM1-, ou grânulos de controlo de GST, revelou que MAM7-grânulos, mas não MAM1- ou grânulos de controlo GST outcompete V. parahaemolyticus para ligação a receptores da superfície celular (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterização de fixação bacteriana durante experimentos de competição. Células Hela foram infectados com V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), na ausência (-) ou na presença de entidades competir como se segue: Grânulos MAM7 (MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST) (comp.). Adesão bacteriana foi medida após 1 hora, como<html> descrito na secção 3. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. Meios (FLTR em UFC / ml) são 2,3010 6, 5 1,5310, 2,0510 6, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Adesinas acoplados a gotas marcadas com fluoróforos resultar na geração de materiais que imitam a adesão bacteriana às células hospedeiras e são ferramentas poderosas para imagiologia celular (Figura 5). Usando contas azuis fluorescentes MAM7 acoplados, que caracterizou o processo de fixação MAM7 mediada para células epiteliais. A ligação de MAM7 a células hospedeiras que resultou na formação de actina e rearranjos de fibras de stress, que foram co-visualizada usando rodamina-faloidina para corar para F-actina (Figura 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Preparação e utilização de fluoróforo marcado grânulos biomiméticos para fins de imagem. (A) Suspensão de pérolas fluorescentes azuis biomiméticos (tubo direito, 10x estoque) e tampão de controlo (tubo de esquerda). (B) Penhora de contas de MAM7 acoplados a Hela células resulta em rearranjos de actina e formação de fibras de stress. Penhora de contas azuis fluorescentes e resultante de estresse actina fibras (vermelho, manchado com rodamina-faloidina) foram fotografadas por microscopia. Bar, a 10 uM. Imagens no painel B foram adaptados de Lim et al. 1 e reproduzida sob a licença Creative Commons Attribution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir materiais biomiméticos constituídos por adesinas recombinantes puras, ligadas covalentemente a microesferas de poliestireno, que podem então ser utilizadas para analisar as interações bioquímicas e funcionais entre adesinas bacterianas individuais e receptores de células hospedeiras. Este método pode auxiliar na resposta a questões fundamentais no campo das interações entre patógenos e hospedeiros, como a medição dos efeitos sobre a sinalização celular do hospedeiro e a inibição da citotoxicidade mediada pelo patógeno. A principal vantagem desta técnica é que adesinas purificadas, ou AEAs, são ligadas direcional e covalentemente a partículas poliméricas semelhantes em tamanho às bactérias, imitando assim a exposição na superfície bacteriana.Realizando o procedimento comigo estará TU A-C-E-D-A, estudante de doutorado do nosso laboratório. Será demonstrado aqui o acoplamento direcional por amina tio. Este protocolo é adequado para o acoplamento de proteínas contendo cisteína a esferas poliméricas funcionalizadas com amina, utilizando SUL succinil para p meli fenil butirato, ou SMPB como agente de ligação cruzada. Prepare todos os reagentes necessários logo antes do uso, conforme descrito no texto do protocolo, para iniciar o procedimento de ativação das esferas.Agite suavemente a suspensão de microesferas invertendo o recipiente e, em seguida, transfira a quantidade necessária da suspensão para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Contendo um mililitro de PBS estéril pH 7,0, pipete suavemente para cima e para baixo para lavar as microesferas e, depois, centrifugue em uma microcentrífuga para formar o pellet. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e uma escova.Resuspenda o pellet de esferas em um mililitro de PBS estéril fresco e repita a etapa de lavagem. Resuspenda o pellet de esferas. Em 0,8 mililitros de PBS, adicione 200 microlitros de SMPB 10 milimolar recém-preparado.Para obter uma concentração final de dois milimolares, incubar a suspensão de microesferas por uma hora a 25 graus Celsius em uma roda rotativa enquanto as microesferas estão em incubação. Preparar a proteína para a etapa de acoplamento seguinte, de modo que possa ser imediatamente adicionada às microesferas ativadas. Verificar a concentração da proteína e ajustá-la à concentração final necessária para a reação de acoplamento. Seis.Geralmente, micromolares de proteína e PBS e um volume de um mililitro são utilizados para a redução da proteína. Adicione uma solução estoque de TEP para obter uma concentração final de cinco milimolares. Incube a solução durante 30 minutos à temperatura ambiente, reservando alguns microlitros da solução de proteína para determinar a concentração inicial de proteína e para o cálculo da eficiência de acoplamento.Inicie o procedimento de acoplamento da proteína pela centrifugação das microesferas ativadas e lave o precipitado. Uma vez em um mililitro de PBS fresco e estéril, re-suspenda o precipitado na solução de proteína preparada para obter a concentração desejada de proteína. Incube a suspensão de microesferas com proteína por duas horas a 25 graus Celsius em rotação suave. Após duas horas, desative os grupos ativados remanescentes nas microesferas adicionando uma solução estoque de cisteína até uma concentração final de 50 milimolares e incube a suspensão por 30 minutos a 25 graus Celsius em rotação suave.Centrifugou-se para manter as esferas. Reserve o sobrenadante para determinação da concentração proteica e cálculo da eficiência de conjugação. Lave o pellet de esferas duas vezes com um mililitro de PBS e ressuspenda em um mililitro de PBS fresco para obter o produto final um dia antes do ensaio de competição. Sementeie cada poço de uma placa de 24 poços com um mililitro de células HeLa numa concentração de 150.000 células por mililitro.Isso permitirá que as células atinjam aproximadamente 80% de confluência antes de iniciar o experimento. Inocule uma cultura marinha de LB de cinco mililitros com uma colônia fresca de V. parahaemolyticus e cultive durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Prepare quantidade suficiente da molécula multivalente de adesão acoplada a microesferas conforme demonstrado anteriormente.Deixe 100 microlitros de estoque de 10 x de microesferas por poço ou uma concentração final de 500 nanomolar de proteína no dia do ensaio de competição. Meça a DO 600 da cultura bacteriana. Prepare o meio de infecção diluindo as culturas bacterianas em DMM incolor sem aditivos.Pré-aqueça a 37 graus Celsius contendo suspensão de soro a 10% volume por volume. Para obter uma MOI de 10, prepare um mililitro por poço e um volume em excesso de 10 a 20% por amostra. Remova o meio antigo dos poços e lave o cultivo.Recupere as células adicionando a cada poço um mililitro de PBS estéril pré-aquecido a 37 graus Celsius. Remova o PBS e adicione um mililitro de meio de infecção por poço. Adicione soluções contendo microesferas controle e bactérias como controles positivos e microesferas de adesão e nenhuma bactéria como controles negativos.Adicione DMM contendo 0,1% TRITON X-100 como controles de lise. Prepare cada condição experimental, incluindo os controles em triplicata. Incube a placa em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.Avalia-se a citotoxicidade. Quatro horas após a infecção, remova 200 microlitros de cada poço utilizado na placa de 24 poços e transfira para uma nova placa de 96 poços.Centrifugue a placa de 96 poços a 1.500 G durante cinco minutos e transfira 100 microlitros de cada poço para uma placa de 96 poços nova. Adicione 100 microlitros do meio utilizado durante os experimentos de infecção a três poços novos da placa de 96 poços para serem usados como brancos. Realize o ensaio de liberação de lactato desidrogenase utilizando um kit de detecção de citotoxicidade por LDH e siga as instruções do fabricante.Primeiro, calcule a quantidade de reagente necessária em incrementos de 25. Por exemplo, para 100 amostras. Misture 11,25 mililitros do reagente A com 250 microlitros do reagente B invertendo o tubo para evitar espuma; não vortex. Em seguida, coloque a mistura em um reservatório. Depois, adicione 100 microlitros da mistura de reagentes a cada amostra e incube a placa à temperatura ambiente por 10, 20 e 30 minutos. Leia a absorbância em 490 nanômetros em um leitor de placas.Posteriormente, calcule a porcentagem de citotoxicidade conforme descrito no manuscrito. As medidas de adesão bacteriana são realizadas uma hora após a infecção. Remova o meio do cultivo da camada celular e lave completamente a camada celular com PBS estéril pré-aquecido para remover quaisquer células não aderidas. Lave pelo menos três a quatro vezes com um mililitro de PBS a cada vez. Lisar as células hospedeiras adicionando a cada poço um mililitro de uma solução estéril de Triton X-100 1% (volume por volume) em PBS e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos.Pipete cada amostra para cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para tubos separados de 1,5 mililitro. Prepare diluições seriadas de dez vezes das amostras em PBS estéril, placa com 100 microlitros de cada amostra em ágar LB marinho e espalhe utilizando um espalhador celular, otimizando qual diluição será plaqueada dependendo das cepas bacterianas e do ponto temporal para esta configuração experimental.Uma diluição de 10 à quinta ou 10 à sexta potência fornecerá um número adequado de UFCs. Incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite e, no dia seguinte, enumere as bactérias por contagem de colônias. Em ensaios de competição, células HeLa foram infectadas com a cepa V para-hemolítica.Pobre um indicado com positivo ou deixado não infectado na presença de diferentes entidades competidoras. A infecção in vitro com pobre um resultou em níveis muito altos de lise celular, o que foi inibido por microesferas conjugadas com MAM sete, mas não por microesferas conjugadas com MA'AM um ou com GST. Enumeração de v paralítico ligado a células HELOC não tratadas ou a células incubadas com MAM.Sete MAM um ou perlas controle GST revelaram que MAM. Sete perlas, mas não MAM um ou perlas controle GST, superam v para hemolítico na ligação aos receptores da superfície celular do hospedeiro.Adesões acopladas à fluorescência. Quatro microesferas marcadas podem imitar a adesão bacteriana a células hospedeiras e são ferramentas poderosas para imagem celular. O tubo à direita contém uma suspensão de microesferas biomiméticas fluorescentes azuis.MAM.Sete microesferas fluorescentes azuis acopladas foram utilizadas para caracterizar o processo de adesão mediada por MAM sete a células epiteliais. A adesão de MAM sete às células hospedeiras resultou em rearranjos de actina e formação de fibras de estresse, que foram visualizados simultaneamente utilizando Rumine Phin para coloração da actina F. Após este procedimento, outros métodos, como purificação por afinidade acoplada à proteômica ou western blot, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais fatores celulares do hospedeiro estão envolvidos nos processos de sinalização downstream da adesão bacteriana.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Stones, D. H., et al. Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactéria-hospedeiro. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de esferas bacteriomimiméticas para quantificar a adesão bacteriana às células epiteliais hospedeiras em condições competitivas. Ele descreve as etapas envolvidas no tratamento das células, lisando-as e plaqueando diluições em série para medir unidades formadoras de colônias.

Avaliação das interações bactéria-célula hospedeira usando esferas biomiméticas

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a capacidade de Porphyromonas gingivalis, uma bactéria patogênica anaeróbica, de aderir e invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Depois de infectar as células hospedeiras com as bactérias, as células hospedeiras são lisadas para liberar bactérias aderidas e internalizadas. Quando o lisado é plaqueado em um meio apropriado, a presença de colônias indica interações bactéria-célula hospedeira bem-sucedidas.

Um ensaio de infecção bacteriana para estudar interações anaeróbicas bactérias-células hospedeiras

Este artigo apresenta dois protocolos: um para medir bactérias anaeróbicas que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro e outro para visualizar bactérias anaeróbicas interagindo com células hospedeiras. Este estudo pode ser aplicado a qualquer tipo de célula anaeróbia cultivável e a qualquer tipo de célula eucariótica.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

Este protocolo simplificado detalha um fluxo de trabalho para detectar e imaginar bactérias em amostras complexas de tecido, desde a fixação do tecido até micróbios de coloração com hibridização fluorescente in situ .

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Um novo método de preparação de amostras é demonstrado para a análise de macrocolônias bacterianas à base de ágar por meio de espectrometria de massa por imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

O presente protocolo descreve a aplicação de modelos de tecidos organotípicos para investigar as interações patógeno-hospedeiro in vitro. Especificamente, o sistema modelo descrito usa um epitélio oral multicamadas exposto a microrganismos associados a biofilmes (placa dentária) no contexto de saúde bucal versus doença.

Sistemas de Modelo de Tecido Organotípico para Investigação de Interações Patógeno-Hospedeiro In Vitro

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

Aprenda a produzir materiais biomiméticos com adesinas recombinantes acopladas a micropartículas para estudar interações bactérias-hospedeiro. Este método permite analisar a adesão bacteriana e seus efeitos na sinalização celular.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

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