Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

O objetivo geral deste procedimento é produzir materiais biomiméticos que consistem em aderências recombinantes puras, acopladas a esferas de poliestireno, que podem então ser usadas para dissecar as interações bioquímicas e funcionais entre aderências bacterianas individuais e receptores de células hospedeiras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações patógeno hospedeiro, como medir os efeitos na sinalização da célula hospedeira e inibição da citotoxicidade mediada por patógenos. A principal vantagem desta técnica é que as aderências purificadas, um AEAs são acopladas direcional e covalentemente a partículas de polímero que são semelhantes em tamanho às bactérias e, portanto, imitam a exibição da superfície bacteriana.

Demonstrando o procedimento comigo estará TU A-C-E-D-A PhD estudante de nosso laboratório. O acoplamento direcional de amina de talamina será demonstrado aqui. Este protocolo é adequado para o acoplamento de proteínas contendo cistina a esferas de polímero funcionalizadas de amina usando succinil SUL para butirato de fenil p meli ou SMPB Como agente de reticulação, prepare todos os reagentes necessários antes de usar, conforme descrito no texto do protocolo para iniciar o procedimento de ativação do grânulo.

Misturou uma suspensão de talão invertendo suavemente e, em seguida, transfira a quantidade necessária de suspensão de talão para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Contendo um mililitro de PBS estéril pH 7,0, pipete suavemente para cima e para baixo para lavar os grânulos e pellets por centrifugação em uma microcentrífuga. Enorme remova cuidadosamente o snat com uma pipeta e uma cicatriz.

Reese suspende o pellet de contas em um mililitro de PBS fresco estéril e repita a etapa de lavagem. Ressuspenda o pellet do cordão. Em 0,8 mililitros de PBS, adicione 200 microlitros de SFO SMPB de 10 milimolares recém-preparados.

Para obter uma concentração final de dois milimolares, incube a suspensão do grânulo por uma hora a 25 graus Celsius em uma roda giratória enquanto os grânulos estão incubando. Prepare a proteína para a etapa de acoplamento seguinte, para que possa ser imediatamente adicionada às esferas ativadas. Verificar a concentração de proteínas e ajustá-la à concentração final necessária para a reacção de acoplamento. Seis.

Micromolar de proteína e PBS e um volume de um mililitro são geralmente usados para redução de proteínas. Adicionar uma solução-mãe de TEP para obter uma concentração final de cinco milimolares. Incubar a solução durante 30 minutos À temperatura ambiente, reter alguns microlitros da solução proteica para determinar a concentração proteica inicial e um cálculo da eficiência de acoplamento.

Inicie o procedimento de acoplamento de proteínas peletizando os grânulos ativados e lavando o pellet. Uma vez em um mililitro de PBS fresco e estéril, suspenda novamente o pellet na solução de proteína preparada para obter a concentração de proteína desejada. Incubar a suspensão de esferas de proteína por duas horas a 25 graus Celsius em uma roda giratória Após duas horas, desative os grupos ativados restantes nas esferas adicionando uma solução estoque de Sistina a uma concentração final de 50 milimolares e incubando em suspensão por 30 minutos a 25 graus Celsius em uma roda giratória.

Segurou as contas por centrifugação. Manter o snat para determinar a concentração de proteínas e calcular a eficiência de acoplamento. Lave o pellet de grânulo duas vezes com um mililitro de PBS e Resus bend e um mililitro de PBS fresco para dar o produto final um dia antes da competição ensaio semeie cada poço de uma placa de 24 poços com um mililitro de células hela a uma concentração de 150.000 células por mililitro.

Isso permitirá que as células atinjam aproximadamente 80% de fluência antes de iniciar o experimento. Inocule uma cultura de LB marinha de cinco mililitros com uma colônia fresca de V para hemolítico e cresça durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Prepare uma molécula de adesão multivalente acoplada a grânulos suficiente, conforme demonstrado anteriormente.

Permita 100 microlitros de 10 x estoque de grânulos por poço ou uma concentração final de 500 nanomolares de proteína no dia do ensaio de competição. Meça o OD 600 da cultura bacteriana. Prepare o meio de infecção diluindo culturas bacterianas em DMM incolor sem aditivos.

Pré-aqueça a 37 graus Celsius contendo 10% de suspensão de volume a batimento de volume. Para dar um MOI de 10, prepare um mililitro por poço e 10 a 20% de excesso de volume por amostra. Remova o meio antigo dos poços e lave o cultivado.

Cure as células adicionando a cada poço um mililitro de PBS estéril pré-aquecido a 37 graus Celsius. Remova o PBS e adicione um mililitro de meio de infecção por poço. Adicione soluções contendo grânulos de controle e bactérias como controles positivos e grânulos de adesão e nenhuma bactéria como negativo. Controles.

Adicione DMM contendo 0,1% TRITTON X 100 como controles de lise. Configure cada condição experimental, incluindo os controles triplicados. Incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.

A citotoxicidade é avaliada. Quatro horas após a infecção. Remova 200 microlitros de cada poço usado na placa de 24 poços e transfira para uma nova placa de 96 poços.

Gire a placa de 96 poços a 1.500 G por cinco minutos e transfira 100 microlitros de cada poço para uma nova placa de 96 poços. Adicione 100 microlitros do meio usado durante os experimentos de infecção a três poços novos da placa de 96 poços para serem usados como blanks. Realize o ensaio de liberação de lactato desidrogenase usando um kit de detecção de citotoxicidade LDH e seguindo as instruções do fabricante.

Primeiro, calcule a quantidade de reagente necessária em incrementos de 25. Por exemplo, para 100 amostras. Misture 11,25 mililitros de reagente A com 250 microlitros de reagente B invertido para evitar a formação de espuma, não vórtice.

Em seguida, coloque a mistura em um reservatório. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de reagentes a cada amostra e incube a placa em temperatura ambiente em 10, 20 e 30 minutos. Leia a absorbância a 490 nanômetros em um leitor de placas.

Posteriormente, calcule a porcentagem de citotoxicidade, conforme descrito no manuscrito, as medições da adesão bacteriana são feitas uma hora após a infecção. Remova a mídia da camada de células e lave bem a camada de células com PBS pré-aquecido estéril para remover quaisquer células soltas. Lave pelo menos três a quatro vezes com um mililitro de PBS de cada vez para as células hospedeiras, adicionando a cada poço um mililitro de uma solução estéril de Triton X 100 a volume a volume em PBS e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Pipete cada amostra para cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para cada um separar. Tubos de 1,5 mililitro. Prepare diluições seriais dez vezes maiores das amostras em placa PBS estéril, 100 microlitros de cada amostra em ágar LB marinho e espalhe usando um espalhador de células para otimizar qual diluição na placa dependendo das cepas bacterianas e do ponto de tempo para esta configuração experimental.

Uma diluição de 10 elevado a quinto ou de 10 elevado a sexta vezes resultará num número adequado de UFC. Incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite do dia seguinte, enumere as bactérias por contagem de colônias. Em ensaios de competição, as células heela foram infectadas com a cepa hemolítica V para.

Pobre indicado com positivo ou não infectado na presença de diferentes entidades concorrentes. A infecção in vitro com um pobre resultou em níveis muito altos de lise celular que foi inibida por MAM sete grânulos acoplados, mas não MA'AM um acoplado ou grânulos acoplados GST. Enumeração de v paralítico ligado a células HELOC não tratadas ou células incubadas com MAM.

Sete contas de controle MAM one ou GST revelaram que o MAM. Sete contas, mas não uma MAM ou contas de controle GST. Superam v para hemolítico pela ligação aos receptores da superfície da célula hospedeira.

Aderências acopladas ao flúor. Quatro grânulos marcados podem imitar a adesão bacteriana às células hospedeiras e são ferramentas poderosas para imagens celulares. O tubo à direita contém uma suspensão de esferas biomiméticas azuis fluorescentes. Mam.

Sete esferas azuis fluorescentes acopladas foram usadas para caracterizar o processo de ligação mediada por MAM sete às células epiteliais. A ligação de MAM seven às células hospedeiras resultou em rearranjos de actina e formação de fibras de estresse que foram co-visualizadas usando Rumine Phin para corar para f actina. Após este procedimento, outros métodos, como purificação de afinidade acoplada a proteômica ou western blot, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais fatores celulares do hospedeiro estão envolvidos nos processos de sinalização a jusante da ligação bacteriana.