A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology

O objetivo geral deste procedimento é localizar com precisão um pequeno traço dentro da substância branca murina para modelar essa forma comum de traço subcortical da substância branca. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do AVC, como mecanismos de lesão axonal, resposta neuronal ao AVC subcortical e como os elementos celulares da substância branca respondem durante as fases aguda e de reparo do AVC. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para localizar com precisão um traço na substância branca e pode ser usada com uma ampla variedade de modelos de camundongos murinos.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido à pequena quantidade de substância branca que leva à localização incorreta do traço. Podem ser necessários pequenos ajustes no ângulo de injeção ou nas coordenadas estereotáxicas para cada cepa de camundongo, ou configuração estereotáxica. Comece fixando primeiro uma pipeta de vidro puxado em um tubo conectado a uma linha de vácuo.

Insira a extremidade puxada na solução de L-Nio ou L-Nio mais marcador fluorescente. Inicie o vácuo e aplique sucção até que pelo menos dois milímetros da porção de 0,5 milímetros de diâmetro da pipeta estejam cheias. Coloque a pipeta cheia de lado.

Em seguida, coloque o mouse em um aparelho estereotáxico equipado com um microscópio estereotáxico. Depois de anestesiar e preparar o camundongo para a cirurgia de acordo com os procedimentos aprovados, verifique a profundidade da anestesia com um beliscão no dedo do pé. Não deve haver resposta.

Em seguida, ajuste o braço de injeção para 36 graus. Fixe um porta-pipetas de vidro puxado na extremidade distal de um sistema de injeção de pressão de baixo volume e conecte-o ao braço de injeção. Depois de fazer uma incisão no couro cabeludo na linha média de 1,5 centímetro para expor o crânio, seque a superfície do crânio com um cotonete.

Em seguida, enquanto olha através de um microscópio estereotáxico, com ampliação de um a três X, use uma ferramenta de microponto para remover qualquer tecido periosteal sobrejacente. Marque bregma com um marcador de ponta fina. Em seguida, use uma broca cirúrgica equipada com uma broca cirúrgica de ponta fina para perfurar uma craniotomia elíptica de dois milímetros, começando posteriormente na bregma e estendendo-se anteriormente à esquerda da linha média.

Remova fragmentos ósseos e tecidos moles sobrejacentes para que o córtex cerebral possa ser visualizado. Mantenha a superfície cortical úmida aplicando intermitentemente gotas de solução salina estéril. Em seguida, fixe a pipeta cheia no braço injetor.

Alinhe a extremidade distal da pipeta com bregma e zere as coordenadas estereotáxicas. Avance a pipeta para o primeiro ponto de injeção usando as coordenadas anterior, posterior e médio-lateral listadas na tabela um. Em seguida, avance a pipeta para a superfície cortical e zere a medida dorsal-ventral.

Abaixe lentamente a pipeta até as coordenadas dorsais-ventrais. Certifique-se de que a ampliação do microscópio estereotáxico esteja definida para três X e que o retículo calibrado possa ser claramente viewed. View a pipeta inclinada de lado para que o menisco fluido de ar tenha uma visão sagital.

O menisco deve aparecer no mesmo plano focal da parede interna e externa da pipeta. Agora, usando um sistema de injeção de pressão local ajustado em 20 PSI para pulsos de 20 milissegundos, injete 100 nanolitros de L-Nio no cérebro. Depois de injetar o volume total, aguarde cinco minutos para evitar o refluxo pela trilha da pipeta.

Em seguida, retire a pipeta e repita o procedimento de injeção no segundo e terceiro conjuntos de coordenadas fornecidos na tabela um. Após a injeção final, remova a pipeta e coloque cera óssea suficiente para preencher o local da craniotomia. Por fim, aproxime as bordas da ferida no couro cabeludo e prenda com adesivo dérmico.

Após a administração de analgesia pós-operatória, coloque o animal em uma gaiola limpa. Fornecer antibióticos pós-operatórios na água de beber por cinco dias, ou até o sacrifício se menos de cinco dias. Depois de sacrificar e decapitar o camundongo de acordo com os procedimentos aprovados, use uma tesoura estéril para abrir o crânio posteriormente e, em seguida, use uma espátula para remover suavemente o crânio sobrejacente.

Em seguida, insira uma espátula estéril de quatro milímetros na frente do cérebro para cortar o bulbo olfatório e os nervos ópticos. Em seguida, levante suavemente o cérebro para fora da calvária e coloque-o em um tampão de dissecação gelado. Usando um bloqueio cerebral e lâminas de barbear estéreis, corte fatias de dois a três milímetros contendo a região afetada e coloque em tampão de dissecção a frio.

Sob um microscópio de dissecação, identifique a substância branca subjacente ao córtex motor no hemisfério injetado. Em intervalos anteriores pós-AVC, a injeção de L-Nio misturada com corantes laboratoriais comuns, como verde rápido, pode permitir a identificação visual do AVC. Em intervalos mais longos pós-AVC, a região pode ser identificada visualmente por necrose focal e palidez da mielina.

Uma vez identificado, use um bisturi para dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o traço. Remova o córtex sobrejacente e o estriado subjacente, conforme desejado. Como mostrado aqui, a marcação imunofluorescente para filamentos neurais, mostrada em vermelho, demonstra o grau de perda axonal sete dias após o AVC, usando a abordagem medial.

Usando a abordagem de ângulo posterior, a lesão de AVC da substância branca é direcionada logo acima do ventrículo lateral e mostra intensa reatividade microglial, detectada pela imunomarcação para IBA-1. Dois marcadores de filamentos intermediários de astrócitos, vimentina, mostrada em vermelho, e proteína ácida fibrilar glial, mostrada em verde, revelam alterações na morfologia dos astrócitos da substância branca após o AVC. A coinjeção de dextrana amina fluorescente no momento da indução do AVC permite a identificação de neurônios individuais com axônios lesionados por AVC.

A maior parte da marcação ocorre em axônios dentro dos neurônios das camadas cinco e seis nos córtices sensório-motores primários que recobrem o derrame. Esta imagem representa sete dias após o AVC. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 45 minutos, se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um derrame focal da substância branca em um camundongo e preparar o cérebro para uma variedade de processamento a jusante, útil para responder a perguntas importantes sobre derrame e reparo neurológico.