Name: A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a produzir acidente vascular cerebral focal na substância branca murina usando injeção estereotáxica de L-Nio. Este método permite estudar lesões axonais, ativação microglial e respostas astrocitárias em modelos de AVC subcortical.

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SN e MDD receberam apoio do NIH K08 NS083740 e do Departamento de Neurologia UCLA. AJG reconhece o apoio do Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Pesquisa Médica e da L. Hillblom Fundação Larry. KLN agradece o apoio da Stroke Center American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS e STC foram apoiados pelo NIH R01 NS071481. JDH reconhece o apoio do NIH K08 NS083740.

O uso de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pela University of California Los Angeles Animal Care e do Comitê Use. Nota: Comece identificando a população murina alvo. Em estudos anteriores, do tipo selvagem ratinhos C57 / Bl6 machos única têm sido utilizadas, no entanto vários ratinhos transgénicos ou knockout também pode ser usado. Note-se que as coordenadas estereotáxicas baseiam-se em murganhos C57 / BL6 anatomia. Recomenda-se que cada usuário inicialmente verificar a localização do curso de substância branca. 1. Branco Matéria curso de indução - Medial Abordagem angular <ol><li> Comece a preparação de uma pipeta de vidro removido utilizando tubo capilar 0,5 milímetros de tal modo que o diâmetro distai é entre 15-25 uM 11. </li><li> Prepara-se uma alíquota de 10 ul estéril de L-NIO (N (5) - de HCl (1) -iminoethyl-L-ornitina) a 27,4 mg / ml (130 ^ M) em solução salina normal a 0,9% estéril. </li><li> Pré-encher a pipeta de vidro puxadocom um pequeno volume de L-NIO (2-5 ul) por meio da fixação do pipeta de vidro para a tubagem ligada a uma linha de vácuo. Deite o pipeta sobre a bancada de trabalho e inserir a extremidade puxado para dentro da solução de L-Nio. <ol><li> Aplicar o vácuo até pelo menos 2 mm da porção de 0,5 mm da pipeta é preenchido. Desligue o vácuo e retirar a pipeta. Colocá-lo de lado até Passo 1,12. </li></ol></li><li> Colocar o rato numa câmara de indução e induzir anestesia do rato utilizando isoflurano padrão de 32% fluiu através de um vaporizador (5 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min de N2) durante 1 minuto ou até profundamente anestesiados. Transferir o rato a um aparelho de estereotaxia equipado com um microscópio estereotáxica. Proporcionar a manutenção da anestesia utilizando 32% de isoflurano fluiu através de um vaporizador (2 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min de N2) e um cone de nariz. Verifique a profundidade da anestesia com uma pitada dedo do pé. </li><li> Ajustar o braço de injecção para 36 °. </li><li> AffiXA puxado titular pipeta de vidro para a extremidade distal de um sistema de injecção de baixa pressão de volume e anexar ao braço de injecção da configuração estereotáxica. </li><li> Brasão bigodes do animal anestesiado com vaselina e colocar pomada lágrima artificial sobre ambos os olhos. Prepare um campo cirúrgico estéril, colocando uma cortina estéril sobre a cabeça do animal com um 5-10 cm de abertura sobre a cabeça. Prepare uma superfície cirúrgica aspetic raspando o pêlo que cobre o crânio. Limpar o couro cabeludo com a alternância de betadine e 70% compressas com álcool. </li><li> Adicione uma 1,5 centímetros incisão na linha média do couro cabeludo com uma tesoura fina estéreis para expor a superfície do crânio. Seca-se o crânio com uma mecha de algodão estéril e usando um microscópio de ampliação estereotáxica em 1-3X, remover qualquer tecido periostal sobrejacente usando uma ferramenta de micro ponto de estéril. </li><li> Marcar o bregma como ponto de referência usando um marcador de ponta fina. </li><li> Perfurar uma craniotomia ellipitical 2 mm, utilizando uma fina broca cirúrgica stip estéril0; começando posteriormente ao bregma e estendendo anteriormente apenas à esquerda da linha média. Retirar os fragmentos de osso e tecido mole sobrejacente de modo que o córtex cerebral pode ser visualizado. </li><li> Manter o campo cirúrgico e superfície cortical úmida, aplicando de forma intermitente gotas de solução salina estéril. </li><li> Juntar uma pipeta de vidro puxado para o braço do injector do aparelho estereotáxico. Alinhar a extremidade distal da pipeta com a bregma e zero as coordenadas estereotáxicas. </li><li> Avançar a pipeta para o primeiro anterior / posterior (A / P) e medial / lateral (M / L) coordenadas fornecidas na Tabela 1. </li><li> Avançar a pipeta para a superfície cortical e zerar o ventral (A / V D) Medição dorsal /. </li><li> Lentamente passar a pipeta no cérebro até atingir o primeiro D / V de coordenadas na Tabela 1. </li><li> Usando um sistema de injecção de baixa pressão de volume ajustado a 20 psi durante 20 pulsos ms, injectar 100 nl de L-NIO no cérebro e esperar cinco minutos para evitar o refluxoa pista pipeta. <ol><li> Use um retículo calibrado na ocular do microscópio estereotáxica e uma ampliação de 3X. </li><li> Por conseguinte, deslocar um total de 0.100 mm 3 (comprimento com 0,5 mm de diâmetro de uma pipeta de 0,5 mm, correspondendo a 100 nl) a partir da pipeta de vidro puxado para cada conjunto de coordenadas. Usando uma bolsa, medir e padronizar uma vez que cada configurar varia dependendo da ampliação e escalas usadas. </li><li> Para a medição do volume precisas durante cada injecção, a abordagem da pipeta em ângulo com o microscópio do lado de modo que o menisco hidroaéreo tem uma vista sagital. O menisco deve aparecer no mesmo plano focal de tanto a parede interior e exterior da pipeta. </li></ol></li><li> Lentamente, retirar a pipeta e repita os passos 1.13-1.16.3 no segundo e terceiro conjunto de coordenadas fornecidas na Tabela 1. </li><li> Após a injecção final, remover a pipeta e colocar cera de osso suficiente para encher o local craniotomia. UMApproximate as bordas da ferida couro cabeludo e ligam-se com adesivo dérmico. </li><li> Injectar 0,1 mL de 0,5% Marcaine nas margens da ferida, usando uma agulha 30 G estéril para evitar a prevenir a dor associada com o local de incisão no couro cabeludo. </li><li> Devolver o animal para habitação e abastecimento de pós-operatório de antibióticos (0,48 mg / ml sulfametoxazoltrimetoprim, ou 0,5 mg / ml levofloxacina) na água de beber durante 5 dias. </li></ol> 2. Branco Matéria curso de indução - Posterior Abordagem angular <ol><li> Execute os passos 1,1-1,12 como no protocolo de abordagem em ângulo medial, exceto ajustar o braço para injeções da configuração estereotáxica a 45 graus orientados anterior para posterior. </li><li> Avançar a pipeta para o primeiro A / P e M / L coordenadas fornecidas na Tabela 2. </li><li> Conclua as etapas restantes 1.14-1.20 como no protocolo de abordagem em ângulo lateral. </li></ol> 3. neuronal retrógrada Labeling <ol><li> Prepare uma estéril 10aliquota ul de L-NIO a 54,8 mg / ml em 0,9% de solução salina normal. </li><li> Prepara-se uma aliquota de 20% estéril Fluororuby (ou 20% de amina dextrano biotinilado ou 2% de Fluorogold) em 0,9% de solução salina normal. </li><li> Dilui-se em conjunto 1: 1, para concentrações finais de 27,4 mg / ml de L-NIO e 10% Fluororuby. </li><li> Execute o protocolo de acidente vascular cerebral como acima nas etapas 1.3-1.23. </li><li> Visualizar o marcador nativamente fluorescente na secção de tecido por meio da fixação de perfusão, cryosectioning e microscopia, como descrito anteriormente 8. </li></ol> 4. Processamento de tecido por imunofluorescência <ol><li> Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia ratos através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado. </li><li> Abrir a cavidade torácica com uma tesoura em ângulo e inserir uma agulha G 23 borboleta para o ventrículo esquerdo. </li><li> Coloque um pequeno corte no átrio direito com uma tesoura fina para permitir uma via de saída para o fluido de perfusão. </li><li> Transcardialmente perfundir com 30-40 ml de solução salina tamponada com fosfato fria seguido de 30-40 ml de paraformaldeído a 4% frio, a uma taxa de 10 ml / min à temperatura ambiente. </li><li> Decapitar o mouse e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula, coloque o cérebro em frio PFA 4% durante 24 h, e depois transferir para 30% de sacarose em PBS durante 48 horas . </li><li> Prepare secções de quarenta micron flutuante usando um criostato e executa o processamento de anticorpo, tal como anteriormente descrito 6-8. Neste estudo, utilizar os seguintes anticorpos: (: diluição 1 500); de coelho anti-neurofilamento 200 de coelho anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); de coelho anti-Iba-1 (1: 1,000). </li></ol> 5. Processamento de Tecidos para a proteína ou RNA Análise <ol><li> Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado. </li><li> decapitar orato e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula. </li><li> Inserir uma espátula estéril 4 milímetros na parte frontal do cérebro para cortar o bolbo olfactivo e os nervos ópticos. Suavemente levantar o cérebro para fora da calvária e colocar em tampão de dissecção gelado (Solução Salina Equilibrada de 1x Hank, 25 mM de HEPES-KOH, pH 7,4, glicose 35 mM, bicarbonato de sódio 4 mM, e 0,01 mg / ml de ciclo-hexamida). </li><li> Usando um bloco cérebro e novas lâminas de barbear estéreis, prepare lajes 2-3 mm contendo o curso e colocar em buffer de dissecção fria. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, identificar o assunto córtex motor subjacente branca no hemisfério injetado. Em intervalos mais longos de pós-acidente vascular cerebral, a região pode ser visualmente identificado por necrose focal e palidez mielina. Nota: Em intervalos pós-AVC anteriores, a injecção de L-NIO misturado com 1 ul de 10% Fast Green pode permitir a identificação visual do acidente vascular cerebral ( <strong&gt; Figura 4A). </li><li> Sob a orientação de um microscópio de dissecação e utilizando uma nova bisturi, dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o acidente vascular cerebral, identificado por qualquer rotulagem Verde Rápido ou perda de tecido. Remover córtex sobrejacente e subjacente estriado como desejado. </li></ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+stroke%3A+not+listened+to+rather+than+silent%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li>
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<li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li>
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<li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity%3A+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li>
<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

Um número de modelos anteriores de acidente vascular cerebral subcorticais tenham sido descritos incluindo injecções focais de endotelina-1 para a cápsula interna, matéria branca subcortical e corpo estriado do rato 6,15 12-14 e rato. Modelos mais recentes de pequenos acidentes vasculares cerebrais focais têm utilizado a injeção microembolias colesterol na artéria carótida 16 e oclusão photothrombotic de um único arteríolas penetrantes 17. Cada um destes modelos tem vantagens ...

O AVC que afeta a substância branca subcortical é uma entidade clínica comum, responsável por até 25% dos AVCs clínicos anualmente nos EUA 1. O dano isquêmico à substância branca também ocorre silenciosamente a uma taxa significativamente maior e contribui para o desenvolvimento de demência vascular 2,3. Atualmente, os pacientes com essa forma de isquemia cerebral têm poucas ou nenhuma opção de tratamento. Apesar da importância clínica dessa doença, existem poucos modelos animais clinicamente relevantes 4,5. 
O objetivo deste protocolo é produzir uma lesão isquêmica focal dentro da substância branca murina. Este modelo murino de doença humana permite o estudo específico da resposta da lesão axonal ao AVC e como os elementos celulares da substância branca, nomeadamente oligodendrócitos e astrócitos juntamente com axônios, respondem e se reparam após o AVC.
Relatórios anteriores descreveram um modelo de acidente vascular cerebral da substância branca subcortical usando endotelina-1 (ET-1) 6 que é semelhante ao descrito aqui. Várias mudanças importantes no protocolo experimental foram feitas, portanto, os usos potenciais desse modelo se expandiram 7,8. Este protocolo fornece uma estratégia confiável e modificável para produzir um traço focal na substância branca do cérebro de camundongos. 
As principais vantagens deste modelo são o uso de um inibidor químico da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina HCl (L-Nio) 9 sem efeitos parácrinos conhecidos sobre elementos celulares da substância branca, que tem sido uma complicação de modelos usando endotelina-1 10. Além disso, o direcionamento estereotáxico da substância branca no camundongo permite o uso de qualquer variedade de cepas transgênicas ou nocaute, expandindo muito as ferramentas disponíveis para determinar o efeito do derrame na substância branca do cérebro. Aqui, duas variações dessa técnica são descritas e demonstram algumas das variações adicionais que podem ser utilizadas para melhorar a compreensão dos danos axonais e da substância branca e do reparo após o AVC.

<table><tbody><tr><td>L-N5- (1-Iminoetil) ornitina, dicloridrato</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>World Precision Instruments</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instrumentação</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>Configuração estereotáxica</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Modelo KOPF</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps curvo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de dissecação sem corte</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>Brocas</td><td>finas Ferramentas Científicas</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaína</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim-Sulfametaxol</td><td>STI Farmácia</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>Slides de vidro</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green&nbsp;</td>Microscópio de dissecação <td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agulha borboleta Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Solução salina balanceada Hank's</td><td>Life Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ciclohexaídeo</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

a stroke versátil modelo murino de subcortical branco matéria para o estudo da axonal degeneration e branco matéria neurobiology

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Acidente vascular cerebral que afecte contas de matéria branca para até 25% das apresentações clínicas acidente vascular cerebral, ocorre silenciosamente em taxas que podem ser 5-10 vezes maior, e contribui significativamente para o desenvolvimento de demência vascular. Alguns modelos de acidente vascular cerebral focal substância branca existir e esta falta de modelos apropriados tem dificultado a compreensão dos mecanismos neurobiológicos envolvidos na resposta a uma lesão e reparação após este tipo de acidente vascular cerebral. A principal limitação de outros modelos de acidente vascular cerebral subcorticais é que eles não focalmente restringir o enfarte e a substância branca ou foram validados principalmente em espécies não murinas. Isto limita a capacidade de aplicar a grande variedade de ferramentas de investigação para estudar o murino de acidente vascular cerebral neurobiologia substância branca. Aqui apresenta-se uma metodologia para a produção fiável de um acidente vascular cerebral focal em matéria branca murino utilizando uma injecção local de um inibidor de eNOS irreversível. Apresentamos também diversas variações no protocolo geral, incluindo dois estereotáxica únicavariações, traçando retrógrada neuronal, bem como de rotulagem tecido fresco e dissecação que expandir muito as potenciais aplicações desta técnica. Estas variações permitem múltiplas abordagens para analisar os efeitos neurobiológicos desta forma comum e pouco estudado de acidente vascular cerebral.

Usando o modelo apresentado, a matéria branca forelimb subjacente córtex sensório-motor confiável pode ser alvo. Este modelo de acidente vascular cerebral induzida quimicamente produz axonal focal e a perda de mielina, astrocitose e microgliose (Figura 1), como é tipicamente visto nos enfartes lacunares humanos. Usando três injeções, um modelo clinicamente útil é estabelecida com comprometimento precoce em tarefas motoras membro anterior 7 e uma pequena, mas s...

Aqui apresentamos metodologia para a produção de um AVC focal na substância branca murina por injeção local de um inibidor irreversível da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (L-Nio). São apresentadas duas variações estereotáxicas, traçado neuronal retrógrado e marcação e dissecção de tecidos frescos que expandem as aplicações potenciais dessa técnica.

A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

O objetivo geral deste procedimento é localizar com precisão um pequeno acidente vascular cerebral na substância branca murina, a fim de modelar essa forma comum de acidente vascular cerebral subcortical da substância branca. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do acidente vascular cerebral, como os mecanismos de lesão axonal, a resposta neuronal ao acidente vascular cerebral subcortical e como os elementos celulares da substância branca respondem tanto nas fases aguda quanto de reparo do acidente vascular cerebral. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para localizar com precisão um acidente vascular cerebral na substância branca e pode ser empregada com uma ampla variedade de modelos murinos de camundongos.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido à pequena quantidade de substância branca, o que pode levar à má localização do acidente vascular cerebral. Pequenos ajustes no ângulo de injeção ou nas coordenadas estereotáxicas para cada linhagem de camundongo, ou no equipamento estereotáxico, podem ser necessários. Comece primeiro fixando uma pipeta de vidro puxada a um tubo conectado a uma linha de vácuo.Insira a extremidade puxada na solução de L-Nio, ou L-Nio mais traçador fluorescente. Inicie o vácuo e aplique sucção até que pelo menos dois milímetros da porção com diâmetro de 0,5 milímetro da pipeta estejam preenchidos. Coloque a pipeta preenchida de lado.Em seguida, posicione o camundongo em um aparelho estereotáxico equipado com um microscópio estereotáxico. Após anestesiar e preparar o camundongo para cirurgia conforme os procedimentos aprovados, verifique a profundidade da anestesia com um aperto no dedo da pata. Não deve haver nenhuma resposta.Em seguida, ajuste o braço de injeção para 36 graus. Fixe um suporte para pipeta de vidro puxada na extremidade distal de um sistema de injeção por pressão de baixo volume e o conecte ao braço de injeção. Após fazer uma incisão mediana no couro cabeludo de 1,5 centímetro para expor o crânio, seque a superfície do crânio com um cotonete.Em seguida, observando por meio de um microscópio estereotáxico, com aumento de uma a três vezes, utilize uma ferramenta de microponto para remover qualquer tecido periostal sobrejacente. Marque o bregma com uma caneta de ponta fina. Em seguida, utilize uma broca cirúrgica equipada com uma ponteira cirúrgica de ponta fina para realizar uma craniotomia elíptica de dois milímetros, iniciando posteriormente no bregma e estendendo-se anteriormente logo à esquerda da linha média.Remova os fragmentos ósseos e os tecidos moles sobrejacentes para que a córtex cerebral possa ser visualizada. Mantenha a superfície cortical úmida aplicando intermitentemente gotas de solução salina estéril. Em seguida, fixe a pipeta cheia ao braço do injetor.Alinhe a extremidade distal da pipeta com o bregma e zere as coordenadas estereotáxicas. Avance a pipeta até o primeiro ponto de injeção utilizando as coordenadas anterior, posterior e medial-lateral listadas na tabela um. Em seguida, avance a pipeta até a superfície cortical e zere a medida dorsal-ventral.Abaixe lentamente a pipeta até as coordenadas dorso-ventral. Certifique-se de que a ampliação do microscópio estereotáxico esteja ajustada em três vezes e de que a retícula calibrada possa ser visualizada com clareza. Observe a pipeta em ângulo lateralmente, de modo que o menisco ar-líquido tenha uma visão sagital.O menisco deve aparecer no mesmo plano focal tanto da parede interna quanto da externa da pipeta. Agora, utilizando um sistema de injeção por pressão local ajustado em 20 PSI para pulsos de 20 milissegundos, injete 100 nanolitros de L-Nio no cérebro. Após injetar o volume total, aguarde cinco minutos para prevenir refluxo ao longo do trajeto da pipeta.Em seguida, retire a pipeta e repita o procedimento de injeção nos segundo e terceiro conjuntos de coordenadas fornecidos na Tabela 1. Após a injeção final, remova a pipeta e aplique cera óssea suficiente para preencher o local da craniotomia. Por fim, aproxime as bordas da ferida no couro cabeludo e fixe com adesivo dérmico.Após administrar analgesia pós-operatória, coloque o animal em uma gaiola limpa. Forneça antibióticos pós-operatórios na água de beber por cinco dias, ou até o sacrifício, se for um período inferior a cinco dias. Após sacrificar e decapitar o camundongo conforme procedimentos aprovados, use tesoura estéril para abrir o crânio posteriormente e, em seguida, use uma espátula para remover suavemente o crânio sobrejacente.A seguir, insira uma espátula estéril de quatro milímetros na parte frontal do cérebro para seccionar o bulbo olfatório e os nervos ópticos. Em seguida, levante cuidadosamente o cérebro da calota craniana e coloque-o em tampão de dissecção gelado. Utilizando um suporte para cérebro e lâminas de barbear estéreis, corte fatias de dois a três milímetros contendo a região afetada e coloque-as em tampão de dissecção frio.Sob um microscópio estereoscópico, identifique a substância branca subjacente à córtex motor no hemisfério injetado. Em intervalos pós-acidente vascular cerebral mais curtos, a injeção de L-Nio misturado com corantes laboratoriais comuns, como verde rápido, pode permitir a identificação visual do acidente vascular cerebral. Em intervalos pós-acidente vascular cerebral mais longos, a região pode ser identificada visualmente por necrose focal e palidez da mielina.Uma vez identificada, utilize um bisturi para dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o acidente vascular cerebral. Remova o córtex sobrejacente e o estriado subjacente, conforme desejado. Como mostrado aqui, a marcação por imunofluorescência para filamentos neurais, mostrada em vermelho, demonstra o grau de perda axonal sete dias após o acidente vascular cerebral, utilizando a abordagem medial.Usando a abordagem angulada posterior, a lesão da apoplexia na substância branca é direcionada logo acima do ventrículo lateral e mostra intensa reatividade microglial, conforme detectado por imunomarcação para IBA-1. Dois marcadores de filamentos intermediários de astrócitos, vimentina, mostrada em vermelho, e proteína ácida fibrilar da glia, mostrada em verde, revelam alterações na morfologia dos astrócitos da substância branca após a apoplexia. A coinjeção de anelina fluorescente de dextrano no momento da indução da apoplexia permite a identificação de neurônios individuais com axônios lesados pela apoplexia.A maioria da marcação ocorre em axônios dentro das camadas cinco e seis de neurônios nas cortes sensorimotoras primárias sobrepostas ao acidente vascular cerebral. Esta imagem representa sete dias após o acidente vascular cerebral. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um acidente vascular encefálico focal na substância branca em um camundongo e preparar o cérebro para uma variedade de processamentos posteriores, úteis para responder perguntas importantes sobre acidente vascular encefálico e reparo neural.

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Medicine

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Este vídeo demonstra a técnica precisa para induzir um derrame da substância branca em um camundongo anestesiado, injetando um inibidor de óxido nítrico nas coordenadas cerebrais específicas dentro da substância branca. Isso leva à constrição dos vasos sanguíneos e à inibição do suprimento sanguíneo, resultando em danos neuronais e derrame cerebral.

Induzindo acidente vascular cerebral da substância branca em um modelo murino usando um inibidor de óxido nítrico

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular. Aqui utilizamos uma técnica photothrombotic modificado com baixa intensidade de luz após o mapeamento de destino pré-cirurgia. Usando esta técnica, criamos um modelo de enfarte capsular circunscrito com comprometimento motor persistente.

Circunscrito capsular infarto Modelagem usando uma técnica Photothrombotic

Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

oclusão cirúrgica de um ramo distal da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo usado com freqüência em pesquisa acidente vascular cerebral experimental. Este manuscrito descreve a técnica básica de MCAo permanente, combinada com a inserção de uma janela craniana lateral, que oferece a oportunidade para microscopia intravital longitudinal em ratinhos.

Lateral Crônica Cranial Janela Preparação Ativa In Vivo Observação Após Distal Middle Cerebral Oclusão da Artéria em Ratos

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

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Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

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Um modelo de camundongo para comprometimento cognitivo vascular e demência baseado em estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum guiada por agulha

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

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A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology (Vídeo) | JoVE Journal

A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology

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