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17 de março de 2016
Aqui apresentamos metodologia para a produção de um AVC focal na substância branca murina por injeção local de um inibidor irreversível da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (L-Nio). São apresentadas duas variações estereotáxicas, traçado neuronal retrógrado e marcação e dissecção de tecidos frescos que expandem as aplicações potenciais dessa técnica.
O objetivo geral deste procedimento é localizar com precisão um pequeno acidente vascular cerebral na substância branca murina, a fim de modelar essa forma comum de acidente vascular cerebral subcortical da substância branca. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do acidente vascular cerebral, como os mecanismos de lesão axonal, a resposta neuronal ao acidente vascular cerebral subcortical e como os elementos celulares da substância branca respondem tanto nas fases aguda quanto de reparo do acidente vascular cerebral. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para localizar com precisão um acidente vascular cerebral na substância branca e pode ser empregada com uma ampla variedade de modelos murinos de camundongos.
Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido à pequena quantidade de substância branca, o que pode levar à má localização do acidente vascular cerebral. Pequenos ajustes no ângulo de injeção ou nas coordenadas estereotáxicas para cada linhagem de camundongo, ou no equipamento estereotáxico, podem ser necessários. Comece primeiro fixando uma pipeta de vidro puxada a um tubo conectado a uma linha de vácuo.
Insira a extremidade puxada na solução de L-Nio, ou L-Nio mais traçador fluorescente. Inicie o vácuo e aplique sucção até que pelo menos dois milímetros da porção com diâmetro de 0,5 milímetro da pipeta estejam preenchidos. Coloque a pipeta preenchida de lado.
Em seguida, posicione o camundongo em um aparelho estereotáxico equipado com um microscópio estereotáxico. Após anestesiar e preparar o camundongo para cirurgia conforme os procedimentos aprovados, verifique a profundidade da anestesia com um aperto no dedo da pata. Não deve haver nenhuma resposta.
Em seguida, ajuste o braço de injeção para 36 graus. Fixe um suporte para pipeta de vidro puxada na extremidade distal de um sistema de injeção por pressão de baixo volume e o conecte ao braço de injeção. Após fazer uma incisão mediana no couro cabeludo de 1,5 centímetro para expor o crânio, seque a superfície do crânio com um cotonete.
Em seguida, observando por meio de um microscópio estereotáxico, com aumento de uma a três vezes, utilize uma ferramenta de microponto para remover qualquer tecido periostal sobrejacente. Marque o bregma com uma caneta de ponta fina. Em seguida, utilize uma broca cirúrgica equipada com uma ponteira cirúrgica de ponta fina para realizar uma craniotomia elíptica de dois milímetros, iniciando posteriormente no bregma e estendendo-se anteriormente logo à esquerda da linha média.
Remova os fragmentos ósseos e os tecidos moles sobrejacentes para que a córtex cerebral possa ser visualizada. Mantenha a superfície cortical úmida aplicando intermitentemente gotas de solução salina estéril. Em seguida, fixe a pipeta cheia ao braço do injetor.
Alinhe a extremidade distal da pipeta com o bregma e zere as coordenadas estereotáxicas. Avance a pipeta até o primeiro ponto de injeção utilizando as coordenadas anterior, posterior e medial-lateral listadas na tabela um. Em seguida, avance a pipeta até a superfície cortical e zere a medida dorsal-ventral.
Abaixe lentamente a pipeta até as coordenadas dorso-ventral. Certifique-se de que a ampliação do microscópio estereotáxico esteja ajustada em três vezes e de que a retícula calibrada possa ser visualizada com clareza. Observe a pipeta em ângulo lateralmente, de modo que o menisco ar-líquido tenha uma visão sagital.
O menisco deve aparecer no mesmo plano focal tanto da parede interna quanto da externa da pipeta. Agora, utilizando um sistema de injeção por pressão local ajustado em 20 PSI para pulsos de 20 milissegundos, injete 100 nanolitros de L-Nio no cérebro. Após injetar o volume total, aguarde cinco minutos para prevenir refluxo ao longo do trajeto da pipeta.
Em seguida, retire a pipeta e repita o procedimento de injeção nos segundo e terceiro conjuntos de coordenadas fornecidos na Tabela 1. Após a injeção final, remova a pipeta e aplique cera óssea suficiente para preencher o local da craniotomia. Por fim, aproxime as bordas da ferida no couro cabeludo e fixe com adesivo dérmico.
Após administrar analgesia pós-operatória, coloque o animal em uma gaiola limpa. Forneça antibióticos pós-operatórios na água de beber por cinco dias, ou até o sacrifício, se for um período inferior a cinco dias. Após sacrificar e decapitar o camundongo conforme procedimentos aprovados, use tesoura estéril para abrir o crânio posteriormente e, em seguida, use uma espátula para remover suavemente o crânio sobrejacente.
A seguir, insira uma espátula estéril de quatro milímetros na parte frontal do cérebro para seccionar o bulbo olfatório e os nervos ópticos. Em seguida, levante cuidadosamente o cérebro da calota craniana e coloque-o em tampão de dissecção gelado. Utilizando um suporte para cérebro e lâminas de barbear estéreis, corte fatias de dois a três milímetros contendo a região afetada e coloque-as em tampão de dissecção frio.
Sob um microscópio estereoscópico, identifique a substância branca subjacente à córtex motor no hemisfério injetado. Em intervalos pós-acidente vascular cerebral mais curtos, a injeção de L-Nio misturado com corantes laboratoriais comuns, como verde rápido, pode permitir a identificação visual do acidente vascular cerebral. Em intervalos pós-acidente vascular cerebral mais longos, a região pode ser identificada visualmente por necrose focal e palidez da mielina.
Uma vez identificada, utilize um bisturi para dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o acidente vascular cerebral. Remova o córtex sobrejacente e o estriado subjacente, conforme desejado. Como mostrado aqui, a marcação por imunofluorescência para filamentos neurais, mostrada em vermelho, demonstra o grau de perda axonal sete dias após o acidente vascular cerebral, utilizando a abordagem medial.
Usando a abordagem angulada posterior, a lesão da apoplexia na substância branca é direcionada logo acima do ventrículo lateral e mostra intensa reatividade microglial, conforme detectado por imunomarcação para IBA-1. Dois marcadores de filamentos intermediários de astrócitos, vimentina, mostrada em vermelho, e proteína ácida fibrilar da glia, mostrada em verde, revelam alterações na morfologia dos astrócitos da substância branca após a apoplexia. A coinjeção de anelina fluorescente de dextrano no momento da indução da apoplexia permite a identificação de neurônios individuais com axônios lesados pela apoplexia.
A maioria da marcação ocorre em axônios dentro das camadas cinco e seis de neurônios nas cortes sensorimotoras primárias sobrepostas ao acidente vascular cerebral. Esta imagem representa sete dias após o acidente vascular cerebral. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos, se for executada corretamente.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um acidente vascular encefálico focal na substância branca em um camundongo e preparar o cérebro para uma variedade de processamentos posteriores, úteis para responder perguntas importantes sobre acidente vascular encefálico e reparo neural.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia para produzir um acidente vascular cerebral focal na substância branca de camundongos por meio da injeção local de um inibidor irreversível da eNOS (L-Nio). A técnica inclui variações estereotáxicas e marcação de tecido fresco para ampliar suas aplicações na pesquisa de acidente vascular cerebral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre AVC
- Modelos Murinos
Antecedentes
- Acidentes isquêmicos focais na substância branca são comuns em modelos de acidente vascular cerebral subcortical.
- Compreender a lesão axonal e as respostas neuronais é essencial na pesquisa sobre acidente vascular cerebral.
- A localização precisa dos acidentes isquêmicos pode melhorar os resultados experimentais.
- Variações entre linhagens de camundongos podem exigir ajustes na técnica.
Objetivo do Estudo
- Modelar com precisão o acidente vascular cerebral em substância branca subcortical em camundongos.
- Investigar os mecanismos de lesão axonal e as respostas neuronais.
- Explorar as respostas celulares durante as fases aguda e de reparo do acidente vascular cerebral.
Métodos Utilizados
- Injeção de L-Nio utilizando um aparelho estereotáxico.
- Preparação do camundongo e procedimentos cirúrgicos para indução de acidente vascular cerebral.
- Dissecção e rotulagem do tecido cerebral para análise.
- Rotulagem imunofluorescente para avaliar perda axonal e reatividade microglial.
Resultados Principais
- Localização bem-sucedida de lesões por acidente vascular cerebral na substância branca de camundongos.
- Identificação de lesão axonal e ativação microglial após acidente vascular cerebral.
- Identificação visual de acidente vascular cerebral mediante traçadores fluorescentes.
- Demonstração de alterações astrocíticas em resposta ao acidente vascular cerebral.
Conclusões
- Essa técnica permite a modelagem precisa de acidentes vasculares na substância branca.
- Ela fornece insights sobre os mecanismos celulares da lesão causada pelo acidente vascular.
- Aplicações futuras podem aprimorar a compreensão dos processos de recuperação após acidente vascular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem do acidente vascular cerebral focal na substância branca em camundongos aborda uma lacuna crítica na pesquisa pré-clínica de AVC, permitindo a desmistificação mecanicista das vias de degeneração axonal. Este modelo apoia a validação de alvos ao fornecer um sistema relevante à doença para estudar respostas neuroinflamatórias e de reparo relacionadas à demência vascular e à carga de infartos silenciosos. A localização precisa da lesão aumenta a confiança preditiva na descoberta precoce, reduzindo a variabilidade biológica nas leituras dos ensaios subsequentes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas aos mecanismos de lesão axonal em patologias da substância branca.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma compatível com camundongos para a validação funcional de alvos utilizando ferramentas neurobiológicas estabelecidas.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao modelar as contribuições de infartos silenciosos para a progressão da demência vascular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera pontos finais histológicos quantificáveis, como perda axonal e reatividade microglial, para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Facilita a preparação de cortes de tecido validados para análises reprodutíveis de imunofluorescência e com base em traçadores.
- Valor Científico: Permite prontidão para triagem mediante indução de lesão focal compatível com rastreamento neuronal retrógrado e marcação de tecido fresco.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar acidente vascular cerebral na substância branca subcortical, que contribui para a demência vascular.
- Valor Operacional: Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de entrega estereotáxica padronizada e processamento de tecidos.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular a localização da lesão a perfis de resposta celular nas fases aguda e de reparo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a testagem de hipóteses sobre mecanismos de acidente vascular cerebral específicos da substância branca antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias por meio da indução direcionada de lesões em tractos de substância branca em camundongos.
- Triagem: Fornece tecido pronto para ensaios com resultados quantificáveis, como ativação de micróglias IBA-1+ e perda de filamentos axonais.
- Análises: Oferece variáveis dependentes mensuráveis, incluindo intensidade de fluorescência de marcadores de filamentos neurais e astrócitos, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da modelagem de fases do acidente vascular cerebral relevantes para o comprometimento cognitivo vascular.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma estrutura estereotáxica reutilizável, adaptável entre linhagens de camundongos e combinações de traçadores, para estudos longitudinais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de lesão da substância branca.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de coordenadas padronizadas, parâmetros de injeção e protocolos de dissecação tecidual.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao permitir a avaliação precoce do engajamento do alvo nas vias de degeneração axonal.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao modelar um subtipo de acidente vascular cerebral altamente prevalente, porém pouco estudado, associado ao risco de demência.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica e neuroanatomia murina para um direcionamento preciso da substância branca.
- Depende de sistemas de injeção com pressão calibrada e ferramentas microcirúrgicas estéreis para indução consistente de lesões.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coloração histológica e de imagens para reprodutibilidade em múltiplos locais.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo em diferentes backgrounds genéticos murinos ou condições comórbidas.
- As limitações práticas incluem o pequeno tamanho do alvo, exigindo ajustes de coordenadas específicos para cada linhagem, e cuidados pós-operatórios minuciosos para garantir a sobrevivência.
