Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

O objetivo geral deste protocolo de microdissecção de captura a laser é isolar o RNA total de populações puras de tipos de células epiteliais prostáticas de tecidos prostáticos congelados heterogêneos para análises de expressão gênica a jusante. Este método pode ajudar a analisar amostras de pacientes e responder a perguntas-chave no campo de pesquisa do câncer de próstata, como a forma como a expressão do RNA difere em amostras de tecido protético epitelial benigno e de doença ou em amostras de ensaios clínicos. A principal vantagem dessa técnica é que a microdissecção por captura a laser permite o isolamento de RNA de populações homogêneas de células epiteliais ou str do tecido prostático congelado.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em adquirir RNA de alta qualidade porque não sabem quais etapas são críticas para manter os RNAs. Condições livres Comece reunindo todos os reagentes e ferramentas necessárias para o procedimento. Depois de permitir que o tecido da próstata congelado se equilibre dentro do criostato por 30 minutos, esguiche o meio de montagem na parte inferior do e monte rapidamente o tecido usando uma pinça resfriada.

Coloque o no resfriador do criostato por cinco minutos para definir o meio de montagem. Uma vez definido, esguiche o meio de montagem congelado no mandril e pressione cuidadosamente o tecido montado nele. Lado inferior para cima.

Deixe a preparação endurecer por cinco minutos. Antes de colocar o mandril no suporte, trave a alça na posição e insira uma nova lâmina no criostato. Depois de destravar a alça, avance cuidadosamente a amostra até atingir a exposição desejada do tecido.

Quando estiver pronto, ajuste o criostato para cinco mícrons e corte uma ou duas seções. Coloque essas seções em uma lâmina de vidro carregada para coloração de hematina e eoína. Coloque imediatamente a lâmina no frio, 100% de etanol por dois minutos.

Após este tempo, retire a lâmina e deixe secar à temperatura ambiente. A lâmina corada com h e d proporciona melhor visualização das texturas nucleares e deve ser usada pelo patologista para marcar as áreas de interesse. Em seguida, coloque uma moldura de caneta em temperatura ambiente.

Deslize em um suporte de quadro, ajuste o criostato para 10 mícrons e crie seções. Uma a quatro seções podem ser colocadas em cada lâmina, dependendo do tamanho do tecido. Mergulhe imediatamente a corrediça em 100% de etanol frio.

Retire a lâmina após dois minutos e guarde no freezer para análise posterior. No mesmo dia da microdissecção de captura a laser, recupere as lâminas da moldura da caneta do freezer trabalhando em uma área livre de RNA. Hidrate as lâminas mergulhando-as suavemente em etanol a 90% por dois minutos e depois em etanol a 75% por dois minutos.

Depois de hidratado, manche o tecido da próstata mergulhando suavemente as lâminas em azul 0,5% de toína por cinco a 30 segundos. Deter o tecido lavando as lâminas duas vezes em água profunda por 15 segundos, seguido de etanol a 75% por 30 segundos a três minutos. Por fim, transfira as lâminas da moldura da caneta para um recipiente seco sem RNA no gelo.

Antes de iniciar o procedimento, coloque uma lâmina para secar em um aquecedor de lâminas por 15 minutos. Seque apenas a lâmina que será processada e guarde o restante no gelo até que seja necessário. Ative os componentes do LCM na seguinte ordem.

A energia do microscópio, a chave do laser, o interruptor do laser e depois o computador. Em seguida, inicie o software de microdissecção a laser usando o software. Solicite ao microscópio para carregar as lâminas e os tubos de coleta.

Clique em descarregar porta-amostras e carregue a lâmina no porta-lâminas com o tecido voltado para baixo. Insira o suporte de lâminas no slot apropriado no microscópio e clique em continuar. Em seguida, clique em descarregar tubos de coleta.

Rotule e carregue os tubos no suporte do tubo e insira no slot apropriado. Prenda as tampas e adicione 35 microlitros de tampão de lise. Tomando cuidado para evitar bolhas.

Depois que os limites de coleta estiverem carregados, clique em OK. Use o software para selecionar a posição da lâmina no suporte e, em seguida, selecione a tampa de coleta para coletar a amostra. Visualize e focalize o slide através do computador com ampliação de 10x.

Use o software para calibrar o laser selecionando o laser. Em seguida, calibre, ajuste a abertura de potência e a velocidade do laser selecionando o laser e, em seguida, controle. Continue a fazer ajustes até que o laser corte completamente o tecido.

É crucial delinear as áreas de interesse normalmente feitas por um patologista certificado pelo conselho, a fim de dissecar com precisão as áreas desejadas do tecido submetido ao LCM Usando a marcação de oito por 11 h e patologista como um guia visual. Use a ferramenta desenhar forma no software para circunscrever as áreas desejadas do epitélio na visualização e evitar a coleta de estroma. Clique em cortar para iniciar o laser.

Se uma área não estiver completamente cortada, use a ferramenta mover e cortar para passar por cima dela manualmente. Continue movendo a objetiva para novas visualizações e repita o corte a laser até que a lâmina seja completamente dissecada ou a quantidade desejada de tecido tenha sido coletada. Quando terminar, remova cuidadosamente os tubos do suporte de coleta e feche as tampas, tendo em atenção a lise, o tampão e o tecido nas tampas.

Resumidamente, centrifugue por 30 segundos para coletar o líquido e o tecido no fundo do tubo. Incube as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos e armazene a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para o isolamento do RNA. Esses exemplos mostram seções representativas da próstata coradas com azul de toluidina em uma lâmina de armação de caneta antes e depois da captura a laser de controles específicos do tipo de célula de epitélio benigno.

Confirme a especificidade da área capturada a laser do tecido. Epitélio e estroma benignos. Não expresse o gene específico do câncer de próstata, A-M-A-C-R.

O estroma não expressou o gene epitelial específico e KX 3.1 ao tentar este procedimento. É importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de RNA para evitar a degradação do RNA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o RNA de populações homogêneas de células epiteliais ou de tempestade de tecido congelado para várias técnicas de análise a jusante.

Não se esqueça de que trabalhar com um criostato pode ser extremamente perigoso em precauções, como um bom treinamento e uma atenção extremamente boa à lâmina devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.