Name: Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda microdisseção por captura a laser para isolar RNA de epitélio prostático humano em tecidos congelados heterogêneos. Este método permite análises precisas de expressão gênica em pesquisa de câncer de próstata.

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Agradecemos à Dra. Vicky Macias, Angeline Giangreco e Avani Vaishnav pela assistência na otimização dessa metodologia ao longo dos anos e a Yang Zhang e ao Dr. Jian Ma da Universidade de Illinois em Urbana-Champaign pela análise de sequência de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH / NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) e uma bolsa da Prevent Cancer Foundation (Zhou).

Todos os tecidos humanos utilizados para estas experiências foram adquiridas através de um protocolo aprovado Institutional Review Board e / ou isenção na Universidade de Illinois em Chicago. 1. Seção Fresco Congelado próstata para PEN-slide e para Cobrado placa de vidro <ol><li> No dia anterior ou poucas horas antes do corte da amostra, ferramentas limpas (isto é, escova, fórceps, coplins, lâminas, lâminas PEN-emoldurados (se já não estiver RNase livre), um marcador ETOH seguro e um lápis) e no interior de um RT criostato com uma solução de RNase-descontaminação usando um frasco de spray e LAB-toalhetes. <ol><li> Permita que a solução de descontaminação RNase-a descansar por 5 minutos antes de enxugar, enxaguar com DEPCH 2 0 para remover sobra solução e uma lavagem final com 70% EtOH (preparado com DEPCH 2 0) RNase-descontaminação. Nota: É essencial para manter um espaço de trabalho livre de RNase. Todos os coplins, ferramentas, meio de montagem congelados, lâminas e slides utilizados devem ser usados ​​apenas para RNase de trabalho livree nunca usado em um ambiente livre não-RNase padrão. Todos os instrumentos têm de ser tratada com uma solução de descontaminação de RNase antes de cada experiência. </li></ol></li><li> Cryostat legal a -24 ° C. </li><li> Coloque os seguintes instrumentos RNase gratuitas limpos dentro cryostat esfriar por pelo menos 30 min antes do corte: slide com etanol a 100%, as ferramentas, as pequenas cassetes de tecido congelado e chuck montagem cheio de coplin. </li><li> Recuperar a partir de tecido da próstata congelado cryostorage e lugar em um balde espuma seca-cheia de gelo para o transporte. Colocar em criostato de tecido equilibrar à criostato temperatura durante pelo menos 30 min. Nota: tecidos da próstata humanos para a captura de laser de micro-dissecção pode ser fresco congelado ou formalina-fixados em parafina (FFPE). As limitações de tempo e preparação da lâmina são ligeiramente diferentes entre fontes de tecido. Aqui nós descrevemos os passos para cortes congelados. </li><li> Trabalhar com um tecido de cada vez, e esguichar meio de montagem congelado no bottom da cassete e rapidamente montar o tecido prostático congelado para o meio de montagem congelado utilizando a pinça refrigerados. </li><li> Coloque a gaveta com o tecido em resfriador em criostato durante 5 min para definir meio de montagem congelado. </li><li> Tutuca uma pequena quantidade de meio de montagem congelada para o chuck e pressione cuidadosamente tecido montado lado de baixo para cima do meio de montagem congelada. Deixe definido no criostato durante 5 min para permitir que o meio de montagem congelados para solidificar completamente. </li><li> Coloque chuck no suporte e aperte. </li><li> Trave a manivela na posição de bloqueio e coloque uma lâmina nova para o criostato. Para terminais moleculares a jusante que incluem um passo de amplificação (ou seja, qPCR), é aconselhável a utilização de uma lâmina nova para cada paciente para evitar a contaminação (ou mover a lâmina através de utilização da área da lâmina para a amostra seguinte). </li><li> Destravar a alça e cuidadosamente avançar o tecido à mão ou com um pedal para uniformizar e expor o tecido com 50 μsecções M até a exposição do tecido desejado seja alcançado. </li><li> Ajuste cryostat a 5 um, cortar uma ou duas seções e colocá-los em cobrados lâmina de vidro para hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração (ver Passo 2). </li><li> Colocar imediatamente a deslizar para o etanol frio a 100% durante 2 min. </li><li> Remover a lâmina de vidro carregada a partir de etanol e deixar secar à RT, antes de prosseguir para a coloração com H &amp; E (Passo 2). </li><li> Coloque RT PEN-quadro de slide em um torcedor do quadro. </li><li> Ajuste cryostat 10 seções um e lugar para os slides quadro RT PEN. Um a quatro secções pode ser colocado em cada corrediça, dependendo do tamanho do tecido. </li><li> Mergulhar imediatamente a deslizar para o etanol frio a 100% durante 2 min. </li><li> Retirar as lâminas PEN-quadro a partir de etanol e armazenar o slide em uma caixa de slide em uma caixa de secador em um freezer -80 ° C até que esteja pronto para LCM. Três dias é o tempo máximo de armazenamento para recuperação de RNA ideal. </li><li> Prossiga com a Etapa 2 para apenas o vidro cobrado deslizoue. Prossiga com a Etapa 3 para PEN-quadro de slide. </li></ol> 2. Hematoxilina e Eosina-Y (H &amp; E) da mancha por histológica Mark-up Nota: Este caso para o tecido sobre a lâmina de vidro carregada e não o slide PEN-quadro para LCM. <ol><li> Hidratar as secções sobre lâminas de vidro carregada mergulhando a lâmina por meio de etanol graduada como segue: mergulha o slide duas vezes em etanol a 100% durante 3 min, duas vezes em etanol a 95% durante 3 min, uma vez em etanol a 70% durante 3 min e dois vezes em H2O destilada durante 3 min. <ol><li> Preparar a solução de álcool de ácido: 99 ml de etanol a 70% + 1 ml de 1% de HCl e solução de bicarbonato de sódio a 0,1%: 0,1 g de bicarbonato de sódio em 100 ml de H2O destilada </li></ol></li><li> Mergulhe as lâminas em hematoxilina Gill II (0,4%) por 5 min. </li><li> Lavar o excesso de corante em constante funcionamento torneira H2O por 3 min. </li><li> Mergulhe o slide 10 vezes em álcool ácido </li><li> Lave o slide no corrente da torneira H2O por 3 min. </li><li> Mergulhe o slidenuma solução de bicarbonato de sódio a 0,1% durante 30-60 seg para transformar a cor púrpura para azul. </li><li> Lave o slide no corrente da torneira H2O por 3 min. </li><li> Lavar as lâminas em etanol a 95%, com 10 mergulhos. </li><li> Mergulhe o slide no Eosina-Y 2-3 vezes 15 seg total. </li><li> Desidratar o slide através de etanol classificados da seguinte forma: mergulhe a lâmina duas vezes em etanol a 95%, duas vezes em etanol a 100%, e duas vezes em xileno (certifique-se o tecido parece claro o que indica desidratação completa). </li><li> Montar o slide com não aquoso difícil montagem médio e tampa de deslizamento permanente. </li><li> Deixe que a corrediça seco durante 30 min. </li><li> Digitalização de slides com qualquer scanner de slides todo e imprimir uma imagem grande, de alta resolução para 8 &quot;x 11&quot; papel. </li><li> Esboço áreas de interesse (normalmente feito por um patologista certificado bordo) com um marcador. Essa marcação é o guia para o procedimento LCM. </li></ol> 3. Azul de Toluidina coloração das lâminas PEN-quadro Nota: Thestá é feito o mesmo dia como o LCM. Use DEPCH 2 O de água para todas as soluções. Conclua todas as etapas em área livre de RNase. Todos os coplins devem ser limpas com uma solução de RNase-descontaminação. <ol><li> O dia de LCM remover as lâminas PEN-quadro de -80 ° C e hidrato de congelador por lâminas inclinadas em declive em EtOH a 90% durante 2 minutos, em seguida, 75% de EtOH durante 2 min. <ol><li> Prepare 0,5% azul de toluidina por dissolução em água biologia molecular grau em seguida, filtrar através de um filtro de esterilizar e armazenar 0,2 m à temperatura ambiente. Esta solução pode ser reutilizada durante até 6 meses. Nota: É altamente aconselhável para preparar a solução antes que a filtração pode levar algumas horas. </li></ol></li><li> Manchar o tecido da próstata mergulhando suavemente slides em 0,5% azul de toluidina para 5-30 seg. Destain o tecido desliza por lavagem 2 vezes em DEPCH 2 O durante 15 segundos seguido por 75% de EtOH durante 30 segundos a 3 minutos. Nota: mancha e destain tempos podem ser ajustados para assegurar uma boa coloração. Próstata tende a sobre a mancha. </li><li&gt; Transferir as lâminas PEN-quadro para recipiente seco RNAase-livre no gelo. </li></ol> Captura Laser-4. Micro-dissecção (LCM) <ol><li> Imediatamente antes de LCM, a corrediça seco sobre uma lâmina quente a 42 ° C durante 15 min. Dry apenas o slide que será processado e armazenar o resto em gelo até estar pronto para eles. </li><li> Ligue o computador e LCM, por esta ordem, o poder do microscópio, a chave de laser, o interruptor do laser e, em seguida, o computador. O lançamento do software Laser Microdissection. </li><li> Use o software para controlar o microscópio para carregar os slides e tubos de coleta. Clique em &quot;suporte de amostras de descarga&quot;, carregue o slide com as seções no suporte de slides do microscópio com o tecido voltado para baixo e insira o suporte de slides na ranhura apropriada no microscópio, em seguida, clique em &quot;continuar&quot;. <ol><li> Clique em &quot;tubos de coleta de descarregamento&quot;, rótulo e carregar 0,5 ml tubos no suporte do tubo e inseri-lo no slot apropriado no instrumento. Uma veztampas estão garantidos, adicionar 35 ul de tampão de lise para as tampas de coleta e tentar evitar bolhas. Em seguida, clique em &quot;OK&quot;. Nota: Se a evaporação é um problema, dilui-se o tampão da seguinte forma: 25 ul de tampão de lise com 10 ul depcH2O. </li></ol></li><li> No software, seleccionar a posição em que a corrediça tem sido colocada no suporte da lâmina. Selecione a tampa de cobrança para recolher a amostra LCM. </li><li> Visualize e focar o slide através do computador em 10X. Use o software para calibrar o laser, selecionando &quot;Laser&quot; e depois &quot;calibrar&quot;. Ajustar a potência, a abertura ea velocidade do laser, escolhendo por &quot;laser&quot;, em seguida, &quot;controlo&quot; para permitir que o feixe de laser para cortar a área seleccionada completa e eficiente. Repetir até que os ajustes cortes a laser completamente através do tecido. </li><li> Usando o patologista mark-up 8 &quot;x 11&quot; como um guia, use a ferramenta de &quot;chamar a forma&quot; de circunscrever as áreas desejadas de Epítetoslium na vista e evitar a coleta de qualquer estroma. Nota: Várias áreas podem ser selecionadas dentro de um ponto de vista, mas não se movem para outra vista sem primeiro corte clicando a ferramenta &quot;cortar forma&quot;. <ol><li> Se uma área não fica completamente cortada pelo laser de usar a ferramenta &quot;mover e cortar&quot; para passar por isso manualmente. Continue a mover o objetivo de novos pontos de vista e repita o corte a laser até slide é completamente dissecado ou a quantidade desejada de tecido foi coletada (tipicamente 100 glândulas benignas produzir 150-500 ng de RNA). (ver o exemplo na Figura 1A). </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente os tubos de suporte à recolha e fechar as tampas, lembrando do tampão de lise e tecido nas calotas. Resumidamente, centrifugar durante 30 segundos para recolher o líquido e o tecido na parte inferior do tubo. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e armazenar a -80 ° C até estar pronto para o isolamento de ARN. </li></ol> 5. Isolamento de ARN total com um FilKit baseada em ter e Análise de Qualidade <ol><li> Descongelar os tubos em gelo e levar o volume da solução para 100 uL. </li><li> Pré-molhou a micro filtro de um kit de isolamento de ARN através da aplicação de 30 ul ofLysis Solução para o centro do filtro e deixe de molho whileperforming os dois passos seguintes (pelo menos, 5 min). </li><li> Adicionar 3 ml de solução de LCM Aditivo (fornecido no kit) ao lisado e misturar em vortex durante 5 segundos. Centrifugar durante 30 segundos para recolher o fluido na parte inferior do tubo. </li><li> Centrifugar o filtro pré-humedecido para ~ 30 segundos na velocidade superior para remover o líquido. </li><li> Adicionar 1,25 volumes (neste caso 129 ul) de etanol a 100% para a mistura de lisado, suavemente vórtice ou pipeta cima e para baixo. ** Este método irá recuperar as duas espécies de RNA grandes e pequenos. </li><li> Carregar a amostra sobre o micro-filtro pré-humedecido, e centrifuga-se a 10.000 xg durante 1 minuto para se ligarem a ARN ao filtro. Em seguida, lave o filtro micro com 180 ul de &quot;solução de lavagem 1, R21; centrifugar a 10000 xg durante 1 min. Nota: Deste ponto em diante todas as centrifugações deve ser feito a 13.000 xg, ou velocidade máxima. </li><li> Lavar duas vezes com filtrar 180 ul de &quot;soluções de lavagem 2 e 3&quot;, respectivamente, conforme indicado pelo protocolo do kit. Centrifugar durante 30 segundos, em seguida, descartar o fluxo através de, e girar o filtro durante 1 min para remover o líquido residual e para secar o filtro. </li><li> De transferência do filtro para um novo tubo de recolha. </li><li> Solução quente de eluição a -95 ° C (fornecido com o kit). </li><li> Aplicar 10 ul de solução de eluição pré-aquecido para o centro do filtro, fechar a tampa e armazenar durante 5 min à TA. Em seguida centrifugar durante 1 min para eluir o ARN, e repetir este passo de cada vez, para se obter ~ 20 ul de ARN. </li><li> Realizar o tratamento de DNase I durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Quantificar o ARN com um espectrof otómetro de absorvência a 260 nm. A relação de densidade óptica no comprimento de onda de 260 nm e 280 nm é utilizado para avaliar a pureza deo RNA (ver Tabela 1) 15. </li></ol> 6. Análise da expressão gênica Nota: A expressão dos genes de espécies de ARN de comprimento (como mRNAs e lncRNAs) é mostrado no passo 6.1 e de espécies de RNA curtas (como microARNs) é mostrado no passo 6.2. Diferentes kits estão disponíveis para RT-qPCR e da quantidade de RNA necessário varia de acordo com kit (tão pouco quanto 10 ng). A análise de sequenciação de ARN é descrito em 6.3. <ol><li> Transcrever reversa (RT) do ARN para ADNc da mistura de 5 mL de 20 ng / ul de amostra de ARN com 5 uL da mistura principal RT (tampão RT, dNTP, iniciadores aleatórios, enzima RT, inibidor de RNase). Incubar a reacção durante 25 min a 25 ° C, em seguida, 120 min a 37 ° C e 5 min a 85 ° C. </li><li> Dilui-se a reacção de RT 1:10 com RNase isenta de água e usar 2,5 mL por 10 jil de reacção qPCR com iniciadores ou conjuntos iniciador / sonda para os genes de interesse. Nota: Para facilitar a análise de RNA parcialmente degradada É aconselhável a utilização de primers for amplicões mais curtos (menos do que 100 pb) 16. (Tabela 2B) <ol><li> Para análise de expressão microARN executar a reacção de RT através da mistura de 5 mL de 2-10 ng / ul de amostra de ARN com 5 uL da mistura principal RT. Nota: cada tecnologia de detecção com base em PCR microARN disponível comercialmente requer a utilização de iniciadores de RT e de propriedade específicos. </li></ol></li><li> Alternativamente ou em adição a RT-PCR, utilizar sequenciação geração seguinte (SEQ ARN-ARN ou de pequena-SEQ) para quantificar diferentes espécies de ARN. Tipicamente, usar 500 ng de ARN para este procedimento (Tabela 3) e levar a cabo o método tal como indicado pelo fabricante e detecção instrumento. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A expressão do gene de perfis a partir de amostras humanas pode ser um desafio, não só para a qualidade ou quantidade de tecido disponível, mas também para as várias entidades histológicas presentes numa determinada amostra de tecido. Isto é particularmente difícil na próstata em que os tecidos benignos são em grande parte tecidos estromais e áreas de cancro são desprovidos de estroma. LCM facilita a separação física do estroma prostático e ARN epitélio para uma assinatura mais preciso dos dois tipos de células diferent...

A próstata é um tecido heterogéneo composto por epitélio secretor dispostos em ácinos glandular rodeado por estroma fibromuscular composto principalmente de músculo liso 1. O compartimento epitelial é composto por cinco tipos de células diferentes, mas organizados: células basais, células secretoras, células neuroendócrinas, células amplificadoras de trânsito e células-tronco 2. No cancro da próstata (CaP), que surge a partir de células epiteliais luminais, o crescimento do adenocarcinoma provoca um declínio progressivo evidente do compartimento estromal 3. Por estas razões, as amostras de tecido terá diferenças distintas na proporção de estroma e tipo de célula epitelial com base na extensão de CaP. Estas diferenças podem levar a pressupostos enviesada dos dados de expressão de genes adquiridos a partir de tecidos inteiros sem ter em conta a microdissecação de o tipo de célula desejado. Portanto, para eliminar esta polarização é essencial para separar tipos de células antes da extracção de ARN eAnálise da expressão do gene. Macrodissection microdissecação ou pode ser usado para separar fisicamente as áreas epiteliais bem caracterizadas do estroma circundante 4 -6. Macrodissection é tipicamente feito com uma lâmina de barbear sob um microscópio de dissecação e funciona bem para a separação de grandes CaP nódulos de estroma, mas não é capaz de remover a partir de epitélio benigna estroma circundante (ver exemplo de histologia benigna da próstata na Figura 1). Microdissection com um laser (LCM) é significativamente mais trabalho intensivo do que macrodissection, mas pode dissecar com muita precisão epitélio benigno 4. Publicações recentes de nosso laboratório demonstraram que o RNA pode ser extraído com sucesso por LCM de qualquer um (FFPE) biópsias embebidos em parafina fixadas em formalina ou tecido congelado 4,7-9. Os principais desafios na extracção LCM-ARN são: 1) para dissecar com precisão as áreas desejadas do tecido, e 2) para preservar RNA integridade durante o processo de LCM 4,10 e isolamento. ARN isolado a partir de populações de células puras podem ser utilizados para análise da expressão do gene através de vários métodos, incluindo a transcrição reversa-PCR quantitativo (RT-qPCR) 7,8, 11 microarray, e profunda -sequencing 12-14. O objetivo deste protocolo é para isolar RNA total de LCM prostática epitélio de tecido congelado para análise de expressão de genes a jusante.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrana 4.0 mm slides&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de vidro, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 à prova</td><td>de laboratórios Decon.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (dietil pirocarbonato)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Frasco de coloração)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Rack de coloração)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>Sistema de</tr><tr><td>microdissecção a laser</td> CS <td></td><td></td> Toluidine Blue Fluka 89640-5G Leica LMD7000 <td></td></tr> tubos <tr><td>de paredes finas de 0,5 ml para LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Kit de isolamento de RNA total</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> NanoDrop Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td> Kit de <td></td></tr><tr><td>Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade</td> da Marca Thermo Fisher Scientific Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade da <td>Marca Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Marca Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Coloração de hematoxilina&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&nbsp;</td><td>Nº 7111</td><td></td></tr></tbody></table>

captura de laser microdissection de próstata humano epithelium para análise de rna

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

A próstata contém um ambiente heterogêneo de tipos de células estromais, epiteliais, neuroendócrinas e imunes. A próstata saudável é composta por estroma fibromuscular em torno de lúmens secretores revestidos de epitelial discretos e uma população muito pequena de células imunes e neuroendócrinas. Em contraste, as áreas de câncer de próstata têm epitélio luminal displásico aumentado com população estromal muito reduzida ou ausente. Dada a profunda diferença entre os tipos de células estromais e epiteliais, é imperativo separar os tipos de células para qualquer tipo de análise molecular a jusante. Apesar desse conhecimento, a maior parte dos estudos de expressão gênica compara a próstata benigna ao câncer sem microdissecção, levando a um viés estromal nas amostras benignas. A microdissecção por captura a laser (LCM) é um método eficaz para separar fisicamente diferentes tipos de células de uma seção de amostra. O objetivo deste protocolo é mostrar que o RNA pode ser isolado com sucesso do epitélio prostático humano coletado por LCM e usado para estudos de expressão gênica a jusante, como RT-qPCR e RNAseq.

Num estudo anterior demonstrou que a utilização de LCM para recolher os tecidos epiteliais e do estroma para comparar perfis de expressão por RT-qPCR de ARNm e microARNs de tecidos da próstata e congelados FFPE a partir do mesmo paciente 4. LCM é demorado, especialmente se grande quantidade de RNA deve ser recolhida para análise de sequenciamento de próxima geração. Portanto, é crucial manter o espaço de trabalho e ferramentas de RNase livre. Recomenda-se para analisar os controlos de qualidade e célula-espec...

O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

O objetivo geral deste protocolo de microdissecção a laser é isolar RNA total de populações puras de tipos celulares epiteliais prostáticos a partir de tecidos prostáticos congelados heterogêneos para análises de expressão gênica downstream. Este método pode auxiliar na análise de espécimes de pacientes e responder perguntas-chave na área de pesquisa do câncer de próstata, como as diferenças na expressão de RNA em amostras de tecido epitelial prostático benigno e patológico, ou em espécimes de ensaios clínicos. A principal vantagem desta técnica é que a microdissecção a laser permite o isolamento de RNA de populações homogêneas de células epiteliais ou estromais a partir de tecido prostático congelado.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade para obter RNA de alta qualidade porque não sabem quais etapas são críticas para manter os RNAs. Condições livres Comece reunindo todos os reagentes e ferramentas necessários para o procedimento. Após permitir que o tecido prostático congelado equilibre dentro do criostato por 30 minutos, borrife meio de montagem no fundo da cassete e monte rapidamente o tecido usando pinças geladas.Coloque a cassete no refrigerador do criostato por cinco minutos para solidificar o meio de montagem. Após a solidificação, aplique o meio de montagem congelado sobre o porta-objetos e pressione cuidadosamente o tecido montado contra ele. Com o lado inferior voltado para cima.Deixe a preparação repousar por cinco minutos. Antes de colocar o porta-bloco no suporte, fixe a alavanca na posição e insira uma lâmina nova no criostato. Após destravar a alavanca, avance cuidadosamente a amostra até atingir a exposição tecidual desejada.Quando pronto, ajuste o criostato para cinco mícrons e corte uma ou duas seções. Coloque essas seções sobre uma lâmina de vidro carregada para coloração com hematina e eosina. Coloque imediatamente a lâmina em etanol a 100%, frio, por dois minutos.Após esse período, remova a lâmina e deixe secar à temperatura ambiente. A lâmina corada com h e d proporciona uma melhor visualização das texturas nucleares e deve ser utilizada pelo patologista para marcar as áreas de interesse. Em seguida, coloque uma moldura de caneta à temperatura ambiente.Coloque no porta-objetos um suporte de quadro, ajuste o criostato para 10 mícrons e crie cortes. De um a quatro cortes podem ser colocados em cada lâmina, dependendo do tamanho do tecido. Mergulhe imediatamente a lâmina em etanol a 100% frio.Remova a lâmina após dois minutos e armazene no congelador para análise posterior. No mesmo dia da microdissecção a laser, retire as lâminas com quadro de caneta do congelador, trabalhando em uma área livre de RNase. Hidrate as lâminas mergulhando-as suavemente em etanol 90% por dois minutos, seguido de etanol 75% por dois minutos.Uma vez hidratado, corar o tecido prostático mergulhando suavemente as lâminas em azul de toína 0,5% por cinco a 30 segundos. Fixar o tecido lavando as lâminas duas vezes em água destilada por 15 segundos, seguido por etanol 75% por 30 segundos a três minutos. Por fim, transferir as lâminas com quadro de caneta para um recipiente seco livre de RNA sobre gelo.Antes de iniciar o procedimento, coloque uma lâmina para secar em um aquecedor de lâminas por 15 minutos. Seque apenas a lâmina que será processada e armazene as demais em gelo até o momento do uso. Ligue os componentes do LCM na seguinte ordem.Potência do microscópio, a chave do laser, o interruptor do laser e, em seguida, o computador. Em seguida, inicie o software de microdissecção a laser usando o software. Solicite ao microscópio que carregue as lâminas e os tubos de coleta.Clique em descarregar o suporte da amostra e coloque a lâmina no suporte com o tecido voltado para baixo. Insira o suporte da lâmina no slot apropriado do microscópio e clique em continuar. Em seguida, clique em descarregar os tubos de coleta.Rotule e coloque os tubos no suporte de tubos e insira-os no compartimento apropriado. Fixe as tampas e adicione 35 microlitros de tampão de lise. Tendo o cuidado de evitar bolhas.Uma vez que as tampas de coleta estejam carregadas, clique em ok. Utilize o software para selecionar a posição da lâmina no porta-lâminas e, em seguida, selecione a tampa de coleta para coletar o espécime. Visualize e foque a lâmina pelo computador com ampliação de 10 x.Use o software para calibrar o laser selecionando laser. Em seguida, calibre, ajuste a abertura de potência e a velocidade do laser selecionando laser e depois controle. Continue fazendo ajustes até que o laser corte completamente o tecido.É fundamental delinear as áreas de interesse, geralmente feito por um patologista certificado, para dissecar com precisão as áreas desejadas do tecido submetido à MCL, utilizando a marcação histológica e coloração com hematoxilina e eosina em papel tamanho oito por onze como guia visual. Use a ferramenta de desenho de formas no software para circunscrever as áreas desejadas de epitélio na imagem, evitando coletar qualquer estroma. Clique em cortar para iniciar o laser.Se uma área não for completamente cortada, use a ferramenta de movimentação e corte para passar manualmente sobre ela. Continue movendo o objetivo para novas visualizações e repita o corte a laser até que o lâmina seja completamente dissecada ou a quantidade desejada de tecido tenha sido coletada. Ao finalizar, remova cuidadosamente os tubos do suporte de coleta e feche as tampas, atentando-se à lise, ao tampão e ao tecido presentes nas tampas.Resumidamente, centrifugue por 30 segundos para recolher o líquido e o tecido no fundo do tubo. Incube as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento do isolamento de RNA. Esses exemplos mostram cortes representativos de próstata corados com azul de toluidina em lâminas com moldura de caneta antes e depois da captura a laser de controles específicos do tipo celular epitélio benigno.Confirme a especificidade da área do tecido capturada pelo laser. Epitélio benigno e estroma. Não expressam o gene específico do câncer de próstata, A-M-A-C-R.O estroma não expressou o gene específico epitelial nem KX 3.1 durante a tentativa deste procedimento. É importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de RNase para prevenir a degradação do RNA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar RNA de populações homogêneas de células epiteliais ou estromais a partir de tecido congelado para diversas técnicas de análises downstream.Não se esqueça de que trabalhar com um criostato pode ser extremamente perigoso; precauções, como boa capacitação e extrema atenção à lâmina, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Retrovírus humanos endógenos (HERV), que ocupam a 8% do genoma humano, manter reduzidas capacidades de codificação, mas a centenas de milhares de repetições terminais longas (LTRs). Um costume microarray Affymetrix foi desenhado para identificar indivíduo expressão HERV lugar e foi usado em tecidos de câncer de próstata como uma prova de conceito para futuros estudos clínicos.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Aqui descrevemos um protocolo simplificado para análises de expressão de microRNA (miRNA) em tecidos clínicos arquivados de câncer de próstata (CaP) fixados em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou frescos congelados empregando PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridização in situ (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda microdisseção por captura a laser para isolar RNA de epitélio prostático humano em tecidos congelados heterogêneos. Este método permite análises precisas de expressão gênica em pesquisa de câncer de próstata.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

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