Name: A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda a reconstituir a descondensação da cromatina no final da mitose usando um ensaio livre de células com extrato de ovo de Xenopus laevis e cromatina de células HeLa. Este método permite manipulações bioquímicas e estudo isolado dos eventos do ciclo celular.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa e da ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON para WA) e PhD Fellowship da Boehringer Ingelheim Fonds para AKS Figura 1 e 2 são reimpressos de Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB-como função ATPases na cromatina descondensação no final da mitose, 305-318, 2014, com a devida permissão de Elsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Xenopus laevis extractos de ovos são uma ferramenta muito útil para reproduzir fielmente processos celulares in vitro, e este sistema foi utilizado com sucesso na caracterização do ciclo celular e divisão celular eventos 2, 3,5,6,17. Devido a grandes lojas de componentes nucleares sequestrados no ovo durante a ovogênese, extratos de ovos são uma excelente fonte de componentes celulares. Em comparação com outras abordagens, como RNAi em linhas celulares de tecido de mamífero ou de ...

Xenopus laevis extrato de ovo é uma ferramenta poderosa e amplamente aplicada para estudar eventos celulares complicados na simplicidade de um ensaio livre de células. Desde a sua primeira descrição por Lohka &amp; Masui 1 eles têm sido amplamente utilizados para estudar a mitose, como condensação da cromatina 2, conjunto do eixo 3, desagregação envelope nuclear 4, mas também o transporte nucleocitoplasmático 5 ou 6 DNA replicação. Os eventos que ocorrem no final da mitose, necessários para a reforma do núcleo interphasic tais como reforma envelope nuclear e poro nuclear remontagem complexo são muito menos entendido, em comparação aos eventos mitóticas iniciais, mas pode ser estudada de forma semelhante usando Xenopus extrato do ovo 7. Temos recentemente estabelecido um ensaio baseado no extracto de ovo de Xenopus para estudar descondensação da cromatina no final da mitose 8, um processo investigado sob que aguarda-its caracterização detalhada. Em metazoários, é altamente cromatina condensada a entrada mitótico, a fim de executar fielmente a segregação do material genético. Para assegurar que a cromatina é acessível para a expressão de genes e replicação do ADN durante a interfase, ele precisa ser de-compactado no final da mitose. Nos vertebrados, a cromatina é até cinquenta vezes mais compactada durante a mitose em comparação com interfase 9, em contraste com leveduras, onde a compactação mitótica é normalmente muito inferior, por exemplo, apenas duas vezes em S. cerevisiae 10. Vertebrados descondensação da cromatina foi estudado principalmente no contexto da reorganização de ADN de esperma após a fertilização do ovo. Um mecanismo molecular, em que nucleoplasmin, uma proteína de oócito abundante, troca-protaminas específico para histonas H2A esperma e H2B armazenados no ovo. Este processo também foi elucidado utilizando extracto de ovo de Xenopus 11, 12. No entanto, a expressãode nucleoplasmin está limitado a 13 oócitos e cromatina mitótica não contém estas protaminas específicos de esperma. Portanto descondensação da cromatina no final da mitose é nucleoplasmin 8 independente. Para a reacção in vitro descondensação empregamos extracto gerado a partir de ovos activados X. laevis e aglomerados de cromatina isoladas a partir de células HeLa sincronizados. O tratamento de ovos com um ionóforo de cálcio imita a libertação de cálcio para o oócito gerado por entrada de esperma durante a fertilização. A onda de cálcio desencadeia a retomada do ciclo celular e do ovo, preso na segunda metáfase da meiose, progride para a primeira interfase 14. Portanto, extratos de ovos preparados forma ativada ovos representar o estado de saída / interfase mitótico e são competentes para induzir a eventos específicos para a saída mitótico como descondensação cromatina, envelope nuclear e pore reforma complexa. Para o isolamento de ch mitóticoromatin clusters de nós usou uma versão ligeiramente modificada do protocolo publicado pela Gasser e Laemmli 15, onde os conjuntos de cromossomos são liberados por lise de células HeLa sincronizados na mitose e isoladas em poliaminas contendo buffers por centrifugação de gradiente.

<table><tbody><tr><td>tetracloridrato de espermina</td><td>Fluka analytical</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>tricloridrato de espermidina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>digitonina de alta pureza</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td></td></tr><tr><td>timidina</td> tóxica <td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazol</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>solução tóxica</td></tr><tr><td>de formaldeído a 37% Solução tóxica de azul de</td> tripano <td>Roth</td><td>7398-1</td><td></td></tr><tr><td>(0,4% )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato AEBSF</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (partículas de sílica coloidal GE</td> <td>Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; frascos de cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino inativado por calor (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador (moedor de tecidos de 40 ml)</td> Assistente <td>de</td> câmara <td>Neubauer 357546</td><td></td>Wheaton</tr><tr><td></td><td></td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos de Centrífuga Oak Ridge, policarbonato (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro de células m, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>citocalasina B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td> tóxica <td>Roth</td><td>8682.3</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td> tóxica <td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG disponível como Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG disponível como Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (mistura de cálcio-magnésio-sal)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td></td></tr><tr><td>agulhas de seringa tóxica (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>sal dissódico de fosfato de creatina</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>creatina fosfoquinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Tubos</td> de centrifugação tóxicos Roche <td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>para TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pol.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (pontas com abertura ampla, 1.000 &micro; l)</td> <td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>solução de glutaraldeído a 50%, grau I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>0,1% (p / v) solução de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fundo plano (6 ml, 16,0 / 55 mm)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield meio de montagem</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>tubos para TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pol.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (pontas com abertura ampla, 200 &micro; l)</td> <td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de 12 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

a free cell ensaio para estudar chromatin descondensação no fim da mitose

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Durante o ciclo celular dos vertebrados, a cromatina sofre extensas mudanças estruturais e funcionais. Após a entrada mitótica, ele se condensa massivamente em cromossomos em forma de bastonete que são movidos individualmente pelo aparato do fuso mitótico. A condensação da cromatina mitótica produz cromossomos compactados cinquenta vezes mais densos como na interfase. Durante a saída da mitose, os cromossomos precisam restabelecer seu estado de interfase funcional, que é envolvido por um envelope nuclear e é competente para replicação e transcrição. O processo de descondensação é morfologicamente bem descrito, mas em termos moleculares mal compreendido: não temos conhecimento sobre os eventos moleculares subjacentes e, em grande medida, os fatores envolvidos, bem como sua regulação. Descrevemos aqui um sistema livre de células que recapitula fielmente a descondensação da cromatina in vitro, com base em aglomerados de cromatina mitótica purificados a partir de células HeLa sincronizadas e extrato de ovo de X. laevis. Nosso sistema livre de células fornece uma ferramenta importante para uma maior caracterização molecular da descondensação da cromatina e sua coordenação com processos que ocorrem simultaneamente durante a saída mitótica, como a remontagem do envelope nuclear e do complexo de poros.

Dependência do tempo da reação descondensação A Figura 1 mostra um típico campo de tempo do ensaio descondensação. O conjunto de cromossomas visíveis no início da reacção decondenses e funde-se com uma única volta e núcleo liso. Quando o extracto de ovo é substituído por tampão de sacarose a agrupar continua a ser condensado cromossoma, que sugerem que a actividade descondensação está presente no extracto de ovo. Descondensação cromatina é um pro...

Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

O objetivo geral deste experimento é reconstruir fielmente a descondensação da cromatina conforme ela ocorre ao final da mitose, na simplicidade de um ensaio livre de células. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de pesquisa da mitose, pois permite a caracterização do mecanismo molecular da cromatina, da descondensação e a identificação dos fatores envolvidos na regulação. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser facilmente manipulada bioquimicamente e a cromatina.A descolonização pode ser estudada isoladamente, separada de outros eventos do ciclo celular. Para começar, isole aglomerados de cromatina mitótica de células helo e prepare os tampões para a preparação do extrato de ovo de IIC Xenopus laevis conforme descrito no protocolo de texto complementar. Uma vez preparado, use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de 27 graus para injetar 500 unidades internacionais de gonadotrofina coriônica humana em rãs com ovulação induzida.Injete as rãs sob a pele do saco linfático dorsal na noite anterior ao experimento para induzir a liberação dos ovos. Uma vez induzidas, mantenha as rãs a 18 graus Celsius por 13 a 17 horas em tanques individuais contendo 1,2 litros de solução salina de Ringer modificada de Mark. Após as rãs depositarem os ovos, remova os ovos já ativados, juntamente com os ovos com aparência anormal. Colete-os despejando o conteúdo dos tanques em béqueres de vidro de 600 a 1000 mililitros corretamente.A separação dos ovos é essencial, pois a qualidade geral adicional depende dessa etapa. Remova os ovos ativados, esbranquiçados e com aparência inadequada. Além disso, nas etapas posteriores, continue removendo os ovos ruins.Decante o sobrenadante S assim que os ovos sedimentarem e, em seguida, reencha o béquer com tampão fresco. Repita este processo quatro vezes para lavar os ovos após a última lavagem. Remova o sobrenadante mais uma vez e, então, preencha o béquer com uma solução de cisteína a 2% para delinear os ovos.Após dois a quatro minutos, substitua pelo tampão fresco contendo L-cisteína. Considere a desovulação completa quando o volume dos ovos diminuir drasticamente e os ovos ficarem mais compactados após aproximadamente cinco a sete minutos. Em seguida, lave cuidadosamente os ovos com o tampão de Ringer modificado de Mark, decantando e reenchendo o tampão sobre a parede do béquer, em vez de diretamente sobre os ovos.Em seguida, ative os ovos em 100 mililitros de solução salina de Ringer modificada de Marx contendo oito microlitros de dois miligramas por mililitro de íon cálcio. Quatro, interrompa a ativação quando a contração do capuz animal se tornar visível.Ou após 10 minutos seguintes à ativação, lave cuidadosamente os ovos em solução salina de Ringer modificada de Mark, removendo e repondo o tampão por decantação após a última lavagem. Incube os ovos em temperatura ambiente por 20 minutos em solução salina de Ringer modificada de Mark. Em seguida, prepare tubos de centrifugação de cinco mililitros com 50 microlitros de tampão de sacarose e 50 microlitros de inibidor de protease em concentração 100 vezes maior.Misture cinco microlitros de DTT um molar, 12,5 microlitros de ciclo heida e 2,5 microlitros de cito. Lave os ovos duas vezes com tampão de sacarose frio e, em seguida, transfira-os para os tubos de centrifugação. Usando uma pipeta Pasteur de plástico com abertura larga, empacote os ovos centrifugando os tubos por um minuto a 130 ×g. Após a centrifugação, remova o excesso de tampão usando uma pipeta Pasteur de plástico e preencha o espaço adicional com mais ovos.Em seguida, centrifugue os tubos contendo o ovo em um rotor oscilante de seis por cinco mililitros durante 20 minutos a quatro graus Celsius e 21.000 vezes g. Com a solução agora separada em três camadas, insira uma seringa de cinco mililitros com agulha de calibre 16 pela lateral do tubo até a camada intermediária, entre a gema amarela na parte superior e logo acima dos detritos escuros de ovo quebrado na parte inferior. Transfira o extrato fásico de baixa velocidade para um tubo novo sobre gelo e, em seguida, adicione 10 microlitros de um inibidor de protease 100 vezes mais concentrado.Misture um microlitro de DTT um molar, 2,5 microlitros de ciclo-heide a 20 miligramas por mililitro e 0,5 microlitros de cito B. Adicione 10 miligramas por mililitro a cada mililitro do extrato de baixa velocidade. Centrifugue o extrato fásico de baixa velocidade por 12 minutos a 355.000 ×g em um rotor de 10 por 2 mililitros. Em seguida, remova cuidadosamente a camada lipídica superior e transfira o sobrenadante contendo o extrato de alta velocidade para um tubo novo.Esta etapa é fundamental para produzir uma amostra de alta qualidade. Tenha cuidado para que o líquido removido não contenha contaminações da camada lipídica superior ou da incômoda camada inferior. Pipete 18 microlitros do extrato de alta velocidade em um tubo de reação de 1,5 mililitro e, em seguida, adicione 0,5 microlitros de glicogênio e 0,5 microlitros da mistura energética.Ponto três, microlitros de seis dimetil purina e 0,7 microlitros dos aglomerados mitóticos. Use ponteiras com abertura larga para misturar a reação assim que a cromatina for adicionada, a fim de evitar a quebra da cromatina descompensada. Após a mistura, incube a mistura de reação por até duas horas a 20 graus Celsius.Em seguida, fixe a amostra adicionando 0,5 mililitros do fixador gelado contendo 4% de paraformaldeído, 0,5% de glutaraldeído e 0,1 miligrama por mililitro de DAPI. Usando ponteiras com abertura larga, incube a amostra em gelo por 20 a 30 minutos. Em seguida, cubra lâminas redondas de 12 milímetros com uma solução de poli-L-lisina a 0,1% peso por volume e incube as lâminas por cinco minutos para aumentar a afinidade das lâminas.Para o cromatina, seque as lamínulas sobre papel filtro posteriormente. Uma vez secas, adicione as lamínulas recobertas na base de tubos de centrifugação planos de seis mililitros, de modo que o lado recoberto fique voltado para cima. Em seguida, adicione 800 microlitros do amortecedor de sacarose a 30% e sobreponha toda a amostra fixada.Centrifugue a amostra por 15 minutos a quatro graus Celsius e 2.500 ×g. Em seguida, despreze o sobrenadante S e remova as lamínulas dos tubos perfurando cuidadosamente a base do tubo de centrífuga com uma agulha de calibre 16. Quando a lamínula for levantada por um dos lados pela agulha, use pinças para retirá-la, lave-a rapidamente mergulhando-a em água desionizada e, em seguida, seque-a suavemente tocando sua lateral em papel de filtro. A seguir, coloque uma gota de meio de montagem em uma lâmina de microscópio e posicione o lado da amostra da lamínula para baixo.Cole a lamínula sobre o meio de montagem. Seque a lamínula suavemente com um lenço de papel e selar as bordas da lamínula com esmalte, mantendo a lâmina no escuro até o momento da aquisição de imagem. Abaixo está o curso temporal típico do ensaio de descompensação.O agrupamento de cromossomos visível no início da reação, decon, condensa-se e funde-se em um único núcleo arredondado e liso. Quando o extrato de ovo é substituído por tampão de sacarose, o agrupamento de cromossomos permanece condensado, o que sugere que a atividade de descompensação está presente no extrato de ovo. No experimento mostrado aqui, análogos de A TP ou GTP não hidrolisáveis foram adicionados à reação.Esses dois aditivos inibem a descondensação, demonstrando que esse processo ativo depende da hidrólise de ATP e GTP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente duas horas para a preparação do extrato de ovos em níveis de Singapura e em três horas para o ensaio de promoção da descolonização. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso depende criticamente da qualidade do extrato.Principalmente para imunodepleções, recomenda-se utilizar extrato recém-preparado seguindo este procedimento. Outros métodos, como imunodepleções e a adição de proteínas recombinantes, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais fatores estão envolvidos. Esta técnica abrirá caminho para pesquisadores nas áreas de mitose ou estrutura e função nuclear explorarem a descondensação da cromatina conforme ela ocorre ao final da mitose em células animais.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar extratos de oócitos de fígado de Xenopus e como aplicar o método para reconstituir a descolonização da cromatina. Não se esqueça de que trabalhar com Paraformaldeído, Hidrazina e DARPA pode ser perigoso, e precauções devem ser tomadas, como o uso de luvas.

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