A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

O objetivo geral deste experimento é reconstituir fielmente a condensação da cromatina como acontece no final da mitose na simplicidade de um ensaio sem células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da pesquisa de mitose, pois permite a caracterização do mecanismo molecular da cromatina, a descolonização e a identificação do fator envolvido na regulação. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser facilmente manipulada bioquimicamente e cromatina.

A descolonização pode ser estudada isoladamente separada de outros eventos do ciclo celular. Para começar, isole os aglomerados de cromatina mitótica das células heliológicas e prepare os tampões para a preparação do extrato de ovo de xenopus lavis IIC, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Depois de preparado, use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 27 para injetar 500 unidades internacionais de gonadotrofina coriônica humana em rãs induzidas pela ovulação.

Injete as rãs sob a pele do saco linfático dorsal na noite anterior ao experimento para induzir a liberação dos ovos Uma vez induzido, mantenha as rãs a 18 graus Celsius por 13 a 17 horas em tanques individuais contendo 1,2 litros de tampão de ringers modificado da marca. Depois que as rãs botarem seus ovos, remova os ovos que já estão ativados junto com os ovos de aparência ruim. Colete-os despejando os tanques em copos de vidro de 600 a 1000 mililitros corretamente.

A classificação dos ovos é fundamental, pois a qualidade extra geral depende da etapa. Remova os ovos fibrosos ativados e de aparência ruim. Também em etapas posteriores, continue a remover os ovos podres.

Transvase o sobrenadante S assim que os ovos assentarem e, em seguida, encha novamente o copo com tampão fresco. Repita esse processo quatro vezes para lavar os ovos após a última lavagem. Remova o supinato mais uma vez e encha o copo com uma solução de cisteína a 2% L para delinear os ovos.

Após dois a quatro minutos, mude para um tampão fresco contendo L cisteína. Considere o gel completo quando o volume dos ovos diminuir drasticamente e os ovos se tornarem mais densamente compactados após aproximadamente cinco a sete minutos. Em seguida, lave cuidadosamente os ovos no tampão de anelamento modificado da marca, decantando e reabastecendo o tampão supinado na parede do copo em vez de diretamente nos ovos.

Em seguida, ative os ovos em 100 mililitros de tampão de toque modificado Marx contendo oito microlitros de dois miligramas por mililitro. Íon cálcio. Quatro, pare a ativação quando a contração do chapéu do animal se tornar visível.

Ou após 10 minutos após a ativação, lave os ovos cuidadosamente na campainha modificada da marca, tampão decantando e reabastecendo o tampão supinado após a última lavagem. Incube os ovos em temperatura ambiente por 20 minutos no tampão de ringer modificado de Mark. Em seguida, prepare tubos de centrifugação de cinco mililitros com 50 microlitros de tampão de sacarose, 50 microlitros de inibidor de protease de 100 vezes.

Misture cinco microlitros de um molar DTT, 12,5 microlitros de cicloureto e 2,5 microlitros de citocito. B. Lave os ovos duas vezes com tampão de sacarose fria e, em seguida, transfira-os para os tubos de centrifugação. Usando uma pipeta de pastagem de plástico com uma abertura ampla, embale os ovos girando os tubos por um minuto a 130 G. Após a centrifugação, remova o excesso de tampão usando uma pipeta de pastagem de plástico e preencha a sala extra com mais ovos.

Em seguida, centrifugue os tubos cheios de ovos em um rotor oscilante de seis por cinco mililitros por 20 minutos a quatro graus Celsius e 21.000 vezes g. Com a solução agora separada em três camadas, empurre uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de calibre 16 pela lateral do tubo e na camada intermediária entre a gema amarela na parte superior e logo acima dos restos de ovo quebrados escuros na parte inferior. Transfira o extrato fásico de baixa velocidade para um tubo fresco no gelo e, em seguida, adicione 10 microlitros de um inibidor de protease de 100 vezes.

Misture um microlitro de um molar DTT, 2,5 microlitros de cicloureto a 20 miligramas por mililitro e 0,5 microlitros de cyto B. Adicione 10 miligramas por mililitro a cada mililitro do extrato de baixa velocidade. Gire o extrato fásico de baixa velocidade por 12 minutos a 355.000 vezes G em um rotor de 10 por dois mililitros. Em seguida, remova suavemente a camada lipídica por cima e transfira o supinato contendo o extrato de alta velocidade para um tubo novo.

Esta etapa é crítica para produzir uma amostra de alta qualidade. Tome cuidado para que o líquido removido não contenha contaminações da camada lipídica na parte superior ou da irritante camada inferior. Pipete 18 microlitros do extrato de alta velocidade em um tubo de reação de 1,5 mililitro e, em seguida, adicione 0,5 microlitros de glicogênio 0,5 microlitros da mistura energética.

Ponto três, microlitros de seis dimetil purina e 0,7 microlitros dos aglomerados mitóticos. Use pontas com uma abertura ampla para misturar a reação assim que a cromatina for adicionada, a fim de evitar o cisalhamento da cromatina descompensadora. Depois de misturado, incube a mistura de reação por até duas horas a 20 graus Celsius.

Em seguida, fixe a amostra adicionando 0,5 mililitros de fixador gelado contendo 4% de paraldeído, 0,5% de glutaraldeído e 0,1 miligrama por mililitro dpi. Usando pontas com uma abertura ampla, incube a amostra no gelo por 20 a 30 minutos. Em seguida, codifique lamínulas redondas de 12 milímetros com uma solução de poli L lisina de 0,1% de peso a volume e incube as lamínulas por cinco minutos para aumentar a afinidade das lamínulas.

Para secar as lamínulas em papel de filtro depois. Depois de seco, adicione as lamínulas revestidas ao fundo de seis tubos de centrifugação de fundo plano de mililitros para que o lado revestido fique para cima. Em seguida, adicione 800 microlitros da almofada de sacarose a 30% e coloque toda a amostra fixa por cima.

Gire a amostra por 15 minutos a quatro graus Celsius e 2.500 vezes G. Em seguida, retire o sobrenadante S e remova as lamínulas dos tubos cutucando cuidadosamente o fundo do tubo de centrifugação com uma agulha de calibre 16. Quando a lamínula for levantada pela agulha de um lado, use uma pinça para remover a lamínula, lave a lamínula rapidamente mergulhando-a em água deionizada e, em seguida, seque-a suavemente tocando na lateral do papel de filtro. Em seguida, coloque uma gota de mídia de montagem em uma lâmina de microscópio e abaixe o lado da amostra da tampa.

Deslize para a mídia de montagem. Seque a lamínula suavemente com um selo de papel ao redor da borda da lamínula com esmalte e mantenha a lâmina no escuro até que seja fotografada. Aqui está o curso de tempo típico do ensaio de descompensação.

O aglomerado de cromossomos visível no início da reação, decon, condensa-se e se funde em um único núcleo redondo e liso. Quando o extrato de ovo é substituído por tampão de sacarose, o aglomerado cromossômico permanece condensado, o que sugere que a atividade de descompensação está presente no extrato de ovo. No experimento mostrado aqui, análogos A TP ou GTP não hidrolisados foram adicionados à reação.

Ambos os aditivos inibem a descondensação, provando que esse processo ativo é dependente da hidrólise de A TP e GTP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas para a preparação do extrato de ovo dos níveis de Cingapura e três horas para o ensaio de promoção da colonização. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso depende criticamente da qualidade do extrato.

Especialmente para imunodepleções, recomenda-se o uso de extrato recém-preparado após este procedimento. Outros métodos, como imunodepleções e adição de proteínas recombinantes, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais fatores estão envolvidos. Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores nas áreas de mitose ou estrutura e função nuclear explorarem a desumanização da cromatina, como acontece no final da mitose em células animais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar extratos de óvulos de fígado ex xenopus e como aplicar o método para reconstituir a descolonização da cromatina. Não se esqueça de que trabalhar com Paraform Hyde, Hyde e DARPA pode ser perigoso e precauções devem ser tomadas, como usar luvas.