Name: Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprenda protocolos para avaliar a interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro usando Porphyromonas gingivalis. Este método permite medir invasão bacteriana e visualizar mecanismos de sobrevivência microbiana em condições controladas.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dra. Catherine Jauregui e Collin R. Berry. Este trabalho foi apoiado por bolsas NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 e R01DE023304 para JP Lewis.
A microscopia foi realizada no Departamento de Anatomia e Neurobiologia da VCU, apoiada, em parte, com financiamento da bolsa principal do NIH-NINDS Center (5P30NS047463).

Os seguintes protocolos vai descrever métodos para a cultura e estudar a invasão pelas espécies anaeróbicas, P. gingivalis; No entanto, estes protocolos podem ser utilizados para uma série de agentes patogénicos anaeróbios. Embora HUVECs são usados, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas tanto imunes e não-imunes. 1. Anaerobic Chamber Uso e Manutenção Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos níveis normais de oxigénio encontradas no ar ambiente. Um ambiente anaeróbio controlado é vital para o cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aqui, manter uma atmosfera artificial designado como gás anaeróbico misto (80% de N2, 10% de H 2, 10% de CO 2) numa câmara anaeróbia de vinilo (Figura 1A). Usar uma câmara de vácuo (Figura 1B) para a transferência de itens a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. A câmara de compressão opera manualmente, twpurga de gelo com gás N2 antes de introduzir o gás anaeróbico misto. </li><li> Utilizar uma coluna de remoção de sulfureto de hidrogénio (Figura 1C) para a remoção livre de manutenção do sulfureto de hidrogénio indesejável. Coloque um desumidificador dentro da câmara para remover H2O criada pelo catalisador e aerossóis para evitar que facilitam a propagação da contaminação. Nota: Sulfeto de hidrogênio é um subproduto metabólico natural de muitas bactérias anaeróbias e sua acumulação é tóxica para bactérias e pode resultar em danos à eletrônica e diminuir o tempo de vida de um catalisador. </li><li> Utilize uma caixa de ventilador fazer circular a atmosfera da câmara, através de um catalisador de paládio, que remove o oxigénio na presença de hidrogénio (Figura 1D). Nota: Uma recirculação atmosférica (HEPA) remove os contaminantes transportados pelo ar com um tamanho de 0,22 mm ou maior. </li><li> Cultura de bactérias anaeróbicas num banho a 37 ° C incubadora que está localizado dentro do anaeróbiocâmara. Use técnicas assépticas padrão quando se trabalha dentro da câmara anaeróbia. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. câmara anaeróbia de vinilo e os seus componentes. (A) uma câmara anaeróbica vinilo selado completamente a partir de oxigénio atmosférico proporciona espaço de trabalho para dois indivíduos de cada vez (32 em x 78 em). Ele contém uma incubadora ajustada a 37 ° C (de volta do meio). (B) Uma câmara de compressão é utilizado para a transferência de objectos a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. Na foto é uma câmara automática operada através de um controlador que pode ser programado para executar automaticamente os procedimentos de vácuo e purga necessários para criar um ambiente anaeróbico. (C) A sulfeto de hidrogênio Coluna Remoção fornece remoção de alta capacidade livre de manutenção de sulfeto de hidrogênio indesejável. (D) Duas caixas de ventilador catalisador sãocolocado ao longo da câmara anaeróbica para ajudar a circular a atmosfera da câmara, através do catalisador paládio, o qual, na presença de hidrogénio, remove o oxigénio. A câmara anaeróbia é configurado de acordo com as instruções do fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Preparação de bactérias anaeróbicas Nota: P. gingivalis é aerotolerant e pode ser armazenado em condições aeróbias mas não crescerão na presença de oxigénio em níveis mais elevados do que 6% 17,18. Uma câmara de anaerobiose é necessária para o cultivo adequado de P. gingivalis e outras espécies anaeróbicas (Figura 1). Formação adequada e educação sobre o uso anaeróbio câmara é necessária antes de trabalhar com microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos os meios líquidos e placas para condit anaeróbioiões durante pelo menos 12 horas antes da experimentação para remover o oxigénio residual. </li><li> Transferir P. gingivalis de -80 ° C freezer para câmara anaeróbia, deixe descongelar. </li><li> Streak P. gingivalis em placas de ágar sangue de tripticase de soja (TSA II com 5% de sangue de carneiro). Enrole placas em parafilme e armazenar a 37 ° C numa incubadora anaeróbica durante 4-7 dias. </li><li> Inocular P. gingivalis em 3 ml de infusão cérebro coração (BHI) suplementado com hemina e menadiona, um meio líquido enriquecido não selectivos para o isolamento e cultivo de anaeróbios e microorganismos exigentes, usando loops estéreis. Nota: Para armazenamento a longo prazo, misturar culturas bacterianas preparados em BHI com glicerol ou DMSO (concentração final de 10-20%) e colocar num congelador de -80 ° C. </li><li> Prepare uma cultura inicial de P. gingivalis, fazendo uma diluição de 1:10 e permitindo que as bactérias a crescer até fase mid-log. </li></ol> Nota: A densidade óptica da BACterial de suspensão é determinada e a concentração de bactérias para cada estirpe a ser examinada é ajustado. Para P. gingivalis uma suspensão a DO660 de 0,7 corresponde à fase mid-log e 7 x 10 ~ 8 células / ml. As condições de crescimento descritas no protocolo acima são específicos para P. gingivalis e pode precisar ser adaptado para outras estirpes bacterianas. 3. endotelial Cultura de Células Nota: Compra HUVEC reunidas primárias e cultura em meio basal contendo factores de crescimento endotelial vascular (VEGF), a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> HUVECs de sementes em frascos T-75 em 2.5 x 10 5 células / balão em 15 ml de mídia VEGF. Nota: Verificar a viabilidade através de uma diluição de 1: 1 com 4,0% de azul de tripano. As células com uma membrana comprometida manterá azul de tripano, as células saudáveis ​​com membranas íntegras aparece branco quando visto sob uma luz microscópio binocular. Councélulas T 100, garantir que mais de 80% das células são viáveis ​​20. </li><li> Substituir mídia a cada 2 dias com a mídia VEGF fresco pré-aquecido até que as células chegar a ~ 80% de confluência. </li><li> Lave as células uma vez com PBS, pré-aquecido. Libertar células do frasco T75 por incubação com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de solução de 2 ml de tripsina de neutralização. </li><li> Recolhe HUVEC suspensas num tubo cónico de 50 ml. Lavar as células extras a partir de frascos T-75 com PBS e transferir para tubos de 50 ml cônico. </li><li> Centrifugar células a 200 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante, suspende sedimento celular em 10 ml de meio de VEGF pré-aquecido. </li><li> Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro ou dispositivo de contagem de células semelhantes. </li><li> Calcular quantidade de suspensão de células para adicionar a qualquer placa de 6 poços (400.000 / poço) ou placa de 12 poços com lamelas (50.000 / poço). HUVECs estará pronto para a experimentação no dia seguinte. </li></ol> 4. Survival ensaio de invasão / Interação(Chapeamento) Nota: Quando a realização deste ensaio, preparar duas placas de 6 poços de células endoteliais semeadas a 400.000 células / poço. Uma placa será usado para avaliar bactérias aderidas para e internalizadas pelas células hospedeiras. A outra placa serão responsáveis ​​por bactérias intracelulares. A placa de 6 poços permite triplicados de duas amostras para ser executado em um experimento. Para um esboço deste protocolo por favor consulte o fluxograma ensaio de sobrevivência (Figura 2). <ol><li> Prepare bactérias anaeróbicas, como descrito acima (ver secção 1) até atingirem crescimento mid-log (DO660 0,5-0,7). </li><li> Bactérias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Se centrífuga é câmara anaeróbia fora, transportar amostras bacterianas em um tubo de 15 ml hermeticamente fechado, enrole a tampa com parafilme para evitar o vazamento de oxigênio. </li><li> Coloque peletizada P. gingivalis de volta na câmara, elimine o sobrenadante. Lavar com PBS, as bactérias da pelota de novo antes de ressuspensão em VEGF-media. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a ser testado em OD 660 de 0,7 o que corresponde a fase mid-log (~ 7 x 10 8 culas / ml). As bactérias estão agora prontos para a infecção. </li><li> Transferência de placas de 6 poços contendo células HUVEC incubadora de cultura de tecidos a partir de dentro da câmara anaeróbia. Remova a mídia e lavar três vezes com PBS anaeróbio. Adicionar 2 ml de meio anaeróbio VEGF a cada poço e colocar as placas a 37 ° C na incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar a temperatura durante a infecção. Nota: as bactérias da placa em placas de agar de sangue para garantir que as utilizadas para a infecção são homogêneas e não contaminada por infecção. </li><li> Infectar as células hospedeiras com as bactérias a uma multiplicidade de infecção (MOI: bactérias hospedeiras) de 100: 1. Nota: o número de células HUVEC é determinada através da realização de um teste de exclusão de tripano num único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinada por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 x 10 5 = 8 células / mL). Bacterial concentração é ajustada para MOI adequado com base na concentração HUVECs 21. </li><li> Coloque placas de 6 poços com células HUVEC infectados na incubadora anaeróbica e permitir que as bactérias para interagir com as células hospedeiras durante 30 min. </li><li> Prepare saponina em BHI (1,0% w / v) dentro da câmara de anaerobiose e filtrar através de um filtro de 0,2 um. </li><li> A sobrevivência de ambas as bactérias aderidas e internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador, meios aspirado, lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de filtrado de 1,0% de saponina (preparada tal como descrito no passo 4.8). Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poço com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição a 1: 1 em BHI. </li><li> Proceder para fazer diluições em série das amostras. Dependendo da espécie e da concentração bacteriana, ajustar as diluições em série. Comece com 1: 100 ou 1: 1.000 diluições. </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Envoltório tele placas em parafilme e lugar na incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Na sequência de sete dias de incubação a 37 ° C, retire as placas e contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) usando uma caixa de luz para contar manualmente colônias. Nota: as UFC são enumerados. Para maiores quantidades de CFUs, as imagens podem ser tomadas e software de computador pode ser utilizado para facilitar a contagem de CFU. </li></ol></li><li> A sobrevivência das bactérias internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador. Lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de VEGF meios suplementados com antibióticos (300 ug / ml de gentamicina e 400 ug / ml) de metronidazol. </li><li> Incubar durante 1 h. Certifique-se de testar os antibióticos assim que eles são 100% eficaz em matar a estirpe bacteriana desejada e certifique-se de que eles não penetram células do hospedeiro 22,23. </li><li> Aspirar a mídia, adicione 2 ml de filtrado 1,0% de saponina. Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poçol com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer diluição 1: 1 em BHI. </li><li> Preparar diluições em série da amostra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Embrulhe em filme plástico e placas lugar na incubadora anaeróbica. </li><li> Depois de sete dias de incubação a 37 ° C, remover as placas e contagem de UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática de um protocolo usado para a sobrevivência de bactérias anaeróbias com células eucarióticas. Ambos os ensaios para a sobrevivência bacteriana total e sobrevivência de bactérias internalizadas pode ser realizada ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Interiorização de bactérias em Ce Anfitriãolls (Microscopia fluorescente) Nota: P. gingivalis é rotulado com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, éster acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM é um corante não fluorescente membrana permeável; a sua conversão em BCECF fluoresceína através da acção de esterases intracelulares pode indicar a viabilidade celular. P. gingivalis é marcado com o corante BCECF-AM e então utilizado para infectar as células eucarióticas. Após a infecção, as células são fixadas e marcadas com DAPI e TRITC-faloidina. A mancha DAPI utilizado para corar o núcleo da célula eucariótica também irá rotular núcleo da célula bacteriana, que fornece uma contra-medida para identificar as bactérias não-viáveis ​​que podem não se apegam metabolicamente BCECF-AM. As células hospedeiras são realçadas com TRITC-phalloidin, um corante vermelho actina. <ol><li> Lamelas autoclave. Adicionar assepticamente lamelas para placas de 12 poços antes de semear as células endoteliais a 5 x 10 4 células / poço. (Preparado dia antes da experiência) </li><li&gt; têm células endoteliais preparadas em 18 mm de espessura (# 1.5) lamelas circulares em placas de 12 poços como descrito acima. </li><li> Prepare bactérias anaeróbias cultivadas até à fase semi-log (OD 660 = 0,5-0,7), conforme descrito na seção 1. </li><li> Lavar 2x com bactérias anaeróbias PBS por centrifugação a 5.000 xg e suspensão da pelota em PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Adicionar 20 uL de 0,2 mM de BCECF-AM a 2 ml de suspensão bacteriana (5-7 x 10 8 culas / ml) para uma concentração final de BCECF-AM 2 uM de. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min no escuro. </li><li> Placas de transferência com células endoteliais semeadas em 18 mm (# 1.5 espessura) lamelas circulares de cultura de tecidos incubadora na câmara anaeróbia. Lavar com PBS e intercâmbio com a mídia VEGF anaeróbia. Nota: Verifique se HUVECs são saudáveis ​​sob um microscópio de luz. HUVECS deve ser ~ 80% confluentes, morfologia devem ser comparáveis ​​aos fabricantes. </li><li> Centrífuga marcado bactérias na5.000 xg durante 10 min para remover o corante BCECF-AM residual. Suspender em 2 ml de mídia VEGF anaeróbia. </li><li> Infectar células hospedeiras com bactérias marcadas na MOI de 100: 1 (bactérias: host). </li><li> Incubar em câmara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após infecção de células de lavagem três vezes com PBS e fixar em recém-preparado 4,0% de paraformaldeído durante 10 min. Nota: Depois de consertar as células, experimento pode ser realizado fora da câmara de anaerobiose. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,2% de Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 50 ul de TRITC-faloidina (50 ug / ml) para lamelas durante 45 min. </li><li> Wash lamelas três vezes, remover da placa de 12 poços e coloque em um slide com soft-set meio de montagem contendo DAPI. Selar os lados com unha polonês. Nota: As lâminas podem ser armazenadas por um par de meses no escuro. Evite a exposição à luz para evitar a foto-branqueamento. </li><li> Visualização de diapositivosutilizando um microscópio confocal. <ol><li> Aqui, use um sistema de 34 canais espectrais (detector de conjunto de 32 canais e dois detectores PMT lado, além de um detector de luz transmitida) configurado em torno de um AxioObserver (invertido) estar com um palco motorizado XY. O sistema tem cinco lasers de diodo: azul (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe vermelho (633 nm) e um laser pulsado nm 440. Equipar um sistema de imagem Lifetime fluorescência com 2 detectores GaAsP híbridos (para FRET-FLIM). </li><li> Detectar a fluorescência a partir de DAPI e TRITC em um canal utilizando um filtro de banda dupla, com comprimentos de onda de excitação de 340-380 nm e 540-560 nm, e um filtro de emissão de 435-485 nm e 570-590 nm, respectivamente. Detectar a fluorescência de BCECF-AM, utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 440-500 nm e um filtro de emissão de 510-590 nm. Nota: Os controles para BCECF-AM deve ser feito em cada estirpe bacteriana sendo estudadas para garantir uma rotulagem adequada de bactérias viáveis. Em primeiro lugar validar que nonviable bactérias são DAPI-positivas e BCECF-negativo. Em segundo lugar, garantir que as bactérias vivas pode metabolizar BCECF-AM em fluoresceína BCECF. Concentrações variáveis ​​de as bactérias ou corante BCECF-AM podem precisar de ser testado para rotulagem óptima. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Todos os métodos acima podem ser utilizados para conceber ensaios específicas para avaliar a interacção de bactérias anaeróbicas com células eucarióticas. No entanto, há várias considerações para realizar com sucesso experiências. Primeiro são as estirpes microbianas para ser utilizados num estudo. É crucial para a comparação de duas estirpes com ambos o ensaio de sobrevivência, bem como por análise de microscopia de que eles estão em fases de crescimento semelhantes e atingir as concentraçõ...

As bactérias anaeróbicas colonizar quase todas as superfícies do corpo humano. Embora predominante na flora do trato intestinal e genito-urinário, onde as concentrações de oxigênio são baixos, eles também existem em níveis elevados na pele, boca, nariz e garganta 1. As bactérias anaeróbicas são uma causa comum de infecções endógenas e frequentemente são isoladas de sítios doentes. No entanto, devido à sua natureza fastidiosa, anaeróbios podem ser difíceis de isolar e cultivar. Estudos envolvendo bactérias anaeróbias deve ser feito sob condições restritas. Técnicas anaeróbio-cultura moderna permitem aos pesquisadores para imitar as configurações anaeróbias necessárias para estudar muitas cepas laboratoriais anaeróbia ou mesmo isolados clínicos 2,3. Bactérias anaeróbicas patogénicas têm desenvolvido uma relação dinâmica e co-evolução com as células hospedeiras em que residem. A maioria dos anaeróbios são susceptíveis à morte pela resposta imunitária do hospedeiro antes de atingir infectiníveis OUs. No entanto, algumas bactérias patogénicas desenvolveram mecanismos para escapar ou subverter a resposta imune do hospedeiro. Eles alcançar este objetivo através de mecanismos como a evasão de reconhecimento imunológico, neutralização de mediadores do sistema imunológico, alteração de imunidade mediada por células, invasão de células hospedeiras, e alteração da imunológico sinalizando 4. Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbia Gram-negativo implicado em ambos oral e doenças extra-orais, é um exemplo de um agente patogénico bacteriano altamente adaptado capaz de causar alterações patogénicas no hospedeiro 5-7. Bolsões de biofilme placa acumulado em fendas profundas formadas entre os dentes e tecido da mucosa gengival pode abrigar bactérias anaeróbias que são protegidos de oxigênio atmosférico 8. Estas bolsas periodontais servir como um nicho para vários patógenos anaeróbicos, como P. gingivalis 9. P. gingivalis é um agente patogénico da distorção que é capaz de remodelaçãoing a comunidade microbiana oral, de forma a promover o desenvolvimento e progressão de doenças periodontais 10. Ela produz um grande número de fatores de virulência que são ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro e fornece mecanismos para a evasão de defesas do hospedeiro 11. É também capaz de invadir epiteliais, endoteliais, fibroblastos e células do ligamento periodontal in vitro e in vivo 12-14 15. Por eficazmente invadir as células hospedeiras, P. gingivalis pode escapar imunidade do hospedeiro. Invasão efectiva de células hospedeiras não só permite que a bactéria de escapar defesas do hospedeiro, mas também serve como um reservatório para o futuro re-infecção, bem como a célula hospedeira altera. São necessários estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na adesão e internalização da bactéria por células hospedeiras. Pesquisa em vários laboratórios está focada na compreensão dos eventos moleculares associados com a internalização de P. gingivalis pelas células hospedeirasbem como os mecanismos utilizados para suprimir e sequestrar a resposta imune e sobreviver a mecanismos de defesa do hospedeiro hostis. Existem muitos ensaios capazes de identificar e caracterizar agentes patogénicos que são capazes de invadir as células hospedeiras. No entanto, estudos in vitro com agentes patogénicos anaeróbios apresentam muitos problemas experimentais para o investigador, principalmente porque é difícil realizar estudos que dependem de instrumentos volumosos, na ausência de oxigénio. Esta situação é agravada pelo fato de que as células eucarióticas necessitam de oxigênio para crescer e, portanto, deve ser preparado separadamente em incubadoras de cultura de tecidos. Uma maneira de evitar tais obstáculos seria realizar os estudos sob o oxigénio atmosférico, mas que iria tornar o crescimento de bactérias anaeróbicas impossível. Outro método seria a utilização de bactérias mortas por calor para infectar e estudar interacções célula-hospedeiro. No entanto, existem diferenças entre as bactérias mortas pelo calor e viáveis ​​que diminuem a relevância do interacti patógeno-hospedeirono dia 16. Ele é central para estudar bactérias viáveis ​​com expressão inalterada interagindo com células hospedeiras; Assim, os métodos para a cultura de P. gingivalis em um ambiente anaeróbico são dadas. Além disso, dois protocolos de baixo custo simples são demonstrados para avaliar a capacidade do P. gingivalis para ser internalizada pelas células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC). O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico populares. Embora o ensaio é simples, as considerações ao usar microrganismos anaeróbios são dadas. O segundo protocolo requer a utilização de um microscópio de varrimento de fluorescência para visualizar a interagir e internalizado P. gingivalis. Cada ensaio tem as suas limitações e vantagens que serão discutidos para fornecer o pesquisador um esboço para estudar a invasão de bactérias anaeróbicas. Embora o manuscrito atual estuda P. gingivalis e HUVEC, estes protocolos podem ser utilizados para muitos outros tipos de bactérias anaeróbicas, bemcomo para outros tipos de células hospedeiras.

<table><tbody><tr><td>Incubadora de Vinil Anaeróbico Tipo B</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Modelo 2000&nbsp;</td></tr><tr><td>Ágar de soja tripticase TSA II com 5% de sangue de ovelha</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>células endoteliais da veia umbilical humana Pool de 10 doadores</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Sal de Sulfato de Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Faloidina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 milímetros de lamínulas</td><td>circulares Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Montagem Medium com DAPI</td><td>Vector</td><td>Laboratories H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a avaliação da interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

As bactérias anaeróbicas longe superam os aeróbios em muitos nichos humanos, tais como o intestino, boca e vagina. Além disso, infecções anaeróbias são comuns e frequentemente de origem indígena. A capacidade de alguns agentes patogénicos anaeróbios de invadir células humanas lhes dá as medidas de adaptação para escapar imunidade inata, bem como para modular o comportamento da célula hospedeira. No entanto, assegurar que as bactérias anaeróbias são vivo durante a investigação experimental dos eventos pode representar desafios. Porphyromonas gingivalis, um anaeróbio Gram-negativos, é capaz de invadir uma variedade de células não fagocíticas eucarióticas. Este artigo descreve como para com êxito a cultura e avaliar a capacidade do P. gingivalis de invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Dois protocolos foram desenvolvidos: um para medir as bactérias que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro, e a outra para visualizar as bactérias que interagem com as células hospedeiras. Estas técnicas requerem a utilização de um anaecâmara para fornecer P. Robic gingivalis com um ambiente anaeróbico para o crescimento ideal. O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico, que é largamente utilizada para estudar a invasão das células hospedeiras por bactérias. No entanto, o ensaio de protecção de antibiótico é limitada; apenas bactérias intracelulares que são cultiváveis ​​após o tratamento antibiótico e a lise da célula hospedeira são medidos. Para avaliar todas as bactérias interagem com células hospedeiras, tanto vivos e mortos, desenvolvemos um protocolo que utiliza a microscopia fluorescente para examinar interação patógeno-hospedeiro. As bactérias são marcado por fluorescência com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetoximetil éster (BCECF-AM) e utilizados para infectar células eucarióticas em condições anaeróbias. Após fixação com paraformaldeído e permeabilização com 0,2% de Triton X-100, as células hospedeiras são marcados com TRITC-faloidina e DAPI para marcar o citoesqueleto da célula e do núcleo, respectivamente. Multiple images tomadas em diferentes pontos focais (Z-stack) são obtidos para visualização temporal e espacial das bactérias. Os métodos usados ​​neste estudo pode ser aplicada a qualquer bactéria anaeróbia cultiváveis ​​e qualquer tipo de célula eucariótica.

Protocolos descritas acima foram usadas no estudo de interação patógeno-hospedeiro entre P. gingivalis e células endoteliais. P. gingivalis W83 e um P. gingivalis V3150 transportando uma deleção de PG0228 foram utilizados no estudo. O PG0228 está previsto para codificar uma proteína que podem alterar os níveis de RNA e proteínas, o que pode em última análise afectar a interacção de P. gingivalis com células hospedeiras. Para investigar o efeito da PG0228 em P. , foi ...

Este artigo apresenta dois protocolos: um para medir bactérias anaeróbicas que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro e outro para visualizar bactérias anaeróbicas interagindo com células hospedeiras. Este estudo pode ser aplicado a qualquer tipo de célula anaeróbia cultivável e a qualquer tipo de célula eucariótica.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar protocolos para avaliar a interação de bactérias anaeróbias com células hospedeiras. As condições utilizadas para cultivar células hospedeiras são tóxicas para bactérias anaeróbias e vice-versa. Isso representa um desafio para o estudo de suas interações, e condições ideais para ambas devem ser alcançadas para que permaneçam metabolicamente ativas durante o período de estudo.Essas condições refletirão com maior precisão o cenário de interação entre patógeno e hospedeiro encontrado in vivo. O método apresentado aqui ajudará a responder perguntas sobre os mecanismos envolvidos na sobrevivência microbiana, bem como na ligação e internalização de células bacterianas anaeróbias durante a infecção. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades, pois o trabalho com bactérias anaeróbias exige conhecimento sobre câmara anaeróbica e boas técnicas assépticas.A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos que envolvem o uso de uma câmara anaeróbica são difíceis de aprender. Além disso, é necessário ter cautela ao realizar experimentos com câmaras anaeróbicas para cultura e experimentação com por ominous gingiss. Uma câmara anaeróbica de vinil é mantida com uma atmosfera artificial contendo 80%nitrogênio, 10%hidrogênio e 10%dióxido de carbono; coloque 30 placas de ágar sangue, 500 mililitros de PBS e 30 mililitros de meio de fator de crescimento endotelial vascular ou VEGF dentro da câmara anaeróbica.24 horas antes, para equilibrar os reagentes, semeie quatro vezes 10 elevado a cinco células endoteliais de veia umbilical humana ou VE por poço em placas de seis poços em meio VEGF e deixe-as no incubador de cultura celular durante a noite para adesão. Prepare culturas de Porphyromonas gingivalis em caldo cérebro-coração, ou meio BHI, conforme descrito no texto acompanhante, e permita que as culturas atinjam a fase logarítmica, enquanto a densidade óptica do cultivo a 660 nanômetros varia entre 0,5 e 0,7. Transfira as bactérias para um tubo de 15 mililitros e enrole um pedaço de parafina ao redor da tampa para evitar fechamento aeróbico.Em seguida, centrifugue as bactérias a 5.000 × g por 10 minutos dentro da câmara anaeróbica. Lave as bactérias sedimentadas com PBS anaeróbico e centrifugue novamente a 5.000 × g por 10 minutos. Reese coloca as bactérias em meio VEGF para infectar o HU X com transferência por ominosa.Transfira as placas de seis poços do incubador para a câmara anaeróbia, aspire o meio dos poços de teste e lave três vezes com PBS anaeróbio. Determine o número de células de um poço representativo por meio do ensaio de exclusão com azul de tripano. Em seguida, adicione dois mililitros por poço de meio VEGF anaeróbio e coloque as placas a 37 graus Celsius no incubador anaeróbio por 20 minutos, para equilibrar. Determine a densidade óptica das bactérias e ressuspenda.Suspenda-os em um volume adequado de meio VEGF para infectar as células com uma multiplicidade de infecção de 100, na proporção de uma bactéria para uma célula. Adicione a suspensão bacteriana às células e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius para infecção com lise celular dentro da câmara anaeróbica. Prepare uma solução de saponina a 1% peso por volume em meio BHI e filtre através de um filtro de 0,2 mícron para estudar as interações bacterianas com as células hospedeiras.Retire a placa de seis poços do incubador e aspire o meio de infecção. Lave três vezes com PBS anaeróbio. Em seguida, adicione dois mililitros da solução de saponina a cada poço e incube por 15 minutos para permitir a lise celular.Em seguida, raspe as células do fundo do poço e dilua o lisado celular na proporção de um para um com meio BHI. Em seguida, faça diluições seriadas a partir de um para 100, plaque 200 microlitros de uma diluição apropriada em placas de ágar sangue. Envolva as placas com perfil e incube-as em um incubador anaeróbio a 37 graus Celsius por sete dias para permitir a formação de colônias.Em seguida, utilizando uma caixa de luz, conte as unidades formadoras de colônia ou UFCs em cada placa após a infecção de células HU E. Lave as células três vezes com PBS anaeróbico. A seguir, adicione dois mililitros de meio VEGF suplementado com concentrações pré-otimizadas de antibióticos às células HU E.Incube as células por uma hora, aspire o meio e adicione dois mililitros de solução de esponina 1% em BHI a cada poço, incubando por 15 minutos. Em seguida, raspe as células lisadas e colete o lisado em um tubo de centrífuga. Dilua o lisado na proporção de um para um com meio BHI e, então, prepare diluições seriadas a partir de um para 100.Plaque 200 microlitros das concentrações adequadas em sangue. Placas de ágar. Deixe as bactérias crescerem por sete dias em uma câmara anaeróbica e, em seguida, conte as colônias.O método de plaqueamento descrito leva em consideração apenas as bactérias vivas que interagem com as células. Para superar essa limitação, utilizamos microscopia, na qual tanto bactérias vivas quanto mortas associadas à célula podem ser visualizadas para observar as bactérias internalizadas. Primeiro, transfira de forma asséptica para a autoclave.Os lamínulas de vidro dentro de cada poço de uma placa de 12 poços, cinco vezes 10 à quarta hve por poço sobre o lamínula e incubar por 24 horas para rotular as bactérias, centrifugar, fase média das bactérias e ressuspender o pellet com PBS anaeróbico, centrifugar novamente e repetir a etapa de lavagem. Adicione 20 microlitros de 0,2 milimolar B-C-E-C-F-A-M a dois mililitros de PBS anaeróbico contendo cinco a sete vezes 10 à oitava.Bactérias por mililitro incubadas a 37 graus Celsius por 30 minutos no escuro. O corante fluorescente que utilizamos pode corar a maioria das bactérias anaeróbicas, portanto nenhum outro reagente, como um anticorpo específico, é necessário. Centrifugue a suspensão bacteriana a 5.000 vezes G por 10 minutos para remover o reagente de marcação não ligado e re-suspenda as bactérias em meio VEGF.Em seguida, infecte as células UIC numa proporção de 100 bactérias para uma célula e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova o meio de infecção e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione paraldeído 4% e incube à temperatura ambiente por 10 minutos.Para fixar as células na câmara anaeróbia, remova as células fixadas da câmara e, em seguida, lave as lamínulas com PBS 3 vezes. Incube as lamínulas em um mililitro de Triton X-100 0,2% por 10 minutos para permeabilizar as células. Em seguida, lave as lamínulas com PBS 3 vezes agora. Adicione 50 microlitros de 50 microgramas por mililitro de T-R-I-T-C foidin a cada lamínula e incube por 45 minutos à temperatura ambiente para corar a actina oligomérica celular.Após a incubação, lave a lamínula com PBS 3 vezes. Inverta a lamínula sobre uma lâmina de vidro com meio de montagem suave contendo um micrograma por mililitro de dappy para coloração nuclear. Em seguida, selar a periferia da lamínula com esmalte e observar ao microscópio confocal a interação da bactéria anaeróbia.Gingis porosos com uve são mostrados nestes resultados. A diluição seriada da célula, lisado contendo bactérias aderidas ou internalizadas em até 100 vezes, resultou em um número contável de UFC em placas de ágar sangue. Sete dias após a incubação, é mostrada aqui a comparação do rendimento de UFC em placas de ágar entre a infecção com o tipo selvagem porus vallis W 83 e a infecção com o mutante de deleção V 315.A mutação afeta a capacidade da bactéria de infectar. O VE mostrado aqui é uma representação gráfica das colônias bacterianas obtidas a partir de células infectadas. Quando a interação foi avaliada, um número menor de bactérias mutantes foi recuperado das células infectadas em comparação com a linhagem selvagem.Os resultados obtidos após a eliminação das bactérias extracelulares por tratamento com antibiótico são mostrados nas colunas da direita. Novamente, a linhagem mutante foi ineficiente na invasão de células uveais vivas. As bactérias são observadas após marcação com BCE CFAM.A coloração adicional dos filamentos de actina e do núcleo celular é visível com fluorescência vermelha e azul, respectivamente. Após dominar, cada uma dessas técnicas pode ser realizada em seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as bactérias em condições anaeróbicas, bem como equalizar todos os meios e materiais na câmara anaeróbica por até 24 horas antes da experimentação.Não se esqueça de que trabalhar com patógenos anaeróbicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas, a lavagem das mãos e a utilização de técnicas assépticas devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento. Assim, este método pode fornecer informações sobre patógenos pré-dentais. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como aspiração, pneumonia, infecções intra-abdominais, infecções ginecológicas e muitas outras infecções anaeróbicas encontradas em diversos locais do corpo humano.As implicações desta técnica estendem-se à nossa terapia medicamentosa para diversos patógenos anaeróbios, pois medidas inibitórias podem ser facilmente adicionadas ao protocolo e a internalização pode ser diretamente medida após o tratamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar bactérias anaeróbias e avaliar sua capacidade de interagir com células hospedeiras.

porphyromonas-gingivalis-as-model-organism-for-assessing-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco...

Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a capacidade de Porphyromonas gingivalis, uma bactéria patogênica anaeróbica, de aderir e invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Depois de infectar as células hospedeiras com as bactérias, as células hospedeiras são lisadas para liberar bactérias aderidas e internalizadas. Quando o lisado é plaqueado em um meio apropriado, a presença de colônias indica interações bactéria-célula hospedeira bem-sucedidas.

Um ensaio de infecção bacteriana para estudar interações anaeróbicas bactérias-células hospedeiras

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para visualizar Porphyromonas gingivalis internalizada, uma bactéria patogênica anaeróbica, dentro de células endoteliais humanas usando microscopia confocal. As bactérias são coradas com um corante fluorescente, enquanto o citoesqueleto de actina da célula endotelial do hospedeiro é marcado com um corante fluorescente diferente. As Porphyromonas gingivalis internalizadas no interior das células endoteliais são visualizadas por microscopia confocal.

Visualização de bactérias anaeróbicas internalizadas dentro das células endoteliais do hospedeiro

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para avaliar a sobrevivência de Porphyromonas gingivalis dentro de células endoteliais humanas. A medida de sobrevivência e crescimento de Porphyromonas gingivalis internalizadas é avaliada pelo número de colônias na placa de ágar sangue.

Avaliação de Porphyromonas gingivalis internalizadas em células endoteliais hospedeiras

Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Interações do anfitrião-micróbio de intestino foram avaliadas usando uma nova abordagem que combina uma comunidade oral sintética, em vitro digestão gastrointestinal e um modelo do epitélio do intestino delgado. Apresentamos um método que pode ser adaptado para avaliar a invasão celular dos micróbios patogénicos e biofilmes de várias espécies, ou mesmo para testar a capacidade de sobrevivência dos probióticos formulações.

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

O presente protocolo descreve a aplicação de modelos de tecidos organotípicos para investigar as interações patógeno-hospedeiro in vitro. Especificamente, o sistema modelo descrito usa um epitélio oral multicamadas exposto a microrganismos associados a biofilmes (placa dentária) no contexto de saúde bucal versus doença.

Sistemas de Modelo de Tecido Organotípico para Investigação de Interações Patógeno-Hospedeiro In Vitro

Nós descrevemos um protocolo para identificar papéis fundamentais de moléculas de sinalização de acolhimento na replicação lítica de um herpesvírus modelo, gama herpesvírus 68 (γHV68). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos embrionárias para γHV68 replicação lítica, o protocolo permite tanto caracterização fenotípica e molecular de interrogatório vírus-hospedeiro interações em replicação lítica viral.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

Aprenda protocolos para avaliar a interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro usando Porphyromonas gingivalis. Este método permite medir invasão bacteriana e visualizar mecanismos de sobrevivência microbiana em condições controladas.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro (Vídeo) | JoVE Journal

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

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