Emulsões água em óleo: Um novo sistema para a montagem de proteínas de ligação de clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos

O objetivo geral desta técnica é permitir a incorporação de clorofilas insolúveis em água nos locais de ligação de proteínas solúveis em água. Este método permite a montagem de clorofilas com proteínas recombinantes, o que permite estudos rigorosos das interações clorofila-proteína e abre novas possibilidades para a construção de novos complexos clorofila-proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer marcação ou imobilização das proteínas.

Assim, é adequado para ensaios de triagem. Demonstrando o procedimento estará Dominica Bednarczyk, pós-doutoranda do meu grupo de pesquisa. Ao preparar as seguintes soluções-mãe, execute todas as etapas de preparação da clorofila sob uma capa química sob luz verde ou no escuro para minimizar os danos causados pela foto.

Sempre adicione nitrogênio ou argônio antes de congelar os pigmentos para armazenamento e certifique-se de que todos os solventes sejam de grau analítico. Para começar, pese cerca de cinco gramas de células liofilizadas de Spirulina platensis ou outras células de cianobactéria contendo apenas clorofila a ou clorofila-a nas membranas tilacóides e use um almofariz e pilão para esmagá-la. A etapa crítica durante a extração da clorofila é garantir que as células das cianobactérias sejam completamente liofilizadas e garantir a remoção completa da água da DEAE-Sepharose por várias lavagens com acetona.

Carregue as células esmagadas em uma coluna de vidro e com cerca de 50-100 mililitros de acetona 100% lave o tecido para remover os carotenóides. Após a lavagem, rejeitar a fracção verde-alaranjada eluída. A cor real pode variar de verde-alaranjado a verde, dependendo da cultura de cianobactérias e das condições de crescimento.

Troque a acetona por 100% de metanol e colete a fração verde contendo clorofila a. Quando a cor da fração eluída muda de verde escuro para verde pálido, pare a eluição. Em seguida, usando um evaporador rotativo com banho-maria que não exceda 30 graus Celsius, evapore o metanol até que o extrato esteja completamente seco, em seguida, use um pequeno volume de éter dietílico para dissolver completamente os pigmentos dos extratos secos e filtre a solução através de algodão, usando um pequeno volume adicional de éter para lavar os pigmentos do algodão.

Evaporar o éter dietílico até que os pigmentos estejam completamente secos. Se parar neste ponto, mantenha os pigmentos secos sob nitrogênio ou argônio a 20 graus Celsius no escuro até o processamento posterior. Para prosseguir com a clorofila uma preparação, dissolva parcialmente os pigmentos secos no menor volume possível de 100% de acetona, adicione 4 mililitros de acetona à suspensão e gire o frasco para dissolver completamente os pigmentos.

Usando uma pipeta Pasteur, carregue suavemente a amostra em uma coluna de DEAE-Sepharose equilibrada em 100% de acetona e, com 100% de acetona, elua os carotenóides. Em seguida, use uma mistura de acetona-metanol volume a volume 3:1 para eluir a clorofila a. Você pode usar uma lanterna para iluminar brevemente a coluna durante a eluição, a fim de observar as cores reais do pigmento.

Com cromatografia em camada fina, verifique a pureza da clorofila a usando uma proporção volume-volume de 68:25:5:2 de diclorometano e hexano, isopropanol e metanol para eluir a amostra. Em seguida, usando um evaporador rotativo, evaporar o solvente até que a clorofila a esteja completamente seca. Para preparar uma clorofila, uma solução estoque dissolve novamente a clorofila a seca em 2-4 mililitros de metanol a 100%.

Para preparar a fase orgânica da emulsão, em um tubo de 50 mililitros, pesar 0,2 gramas de Tween 80, 1,8 gramas de Span 80 e 38 gramas de óleo mineral. Misture bem os componentes e coloque a solução no gelo para esfriar. Para preparar uma fase aquosa contendo proteína de ligação à clorofila solúvel em água purificada, ou WSCP, cultive bactérias E.coli BL21 contendo o gene WSCP em 1 litro de meio LB a 37 graus Celsius para um OD600 de 0,3 a 0,6.

Adicione 1 IPTG milimolar para induzir a expressão de proteínas e cultive as bactérias a 30 graus Celsius por 12-16 horas, depois colha as bactérias por centrifugação a 5000 G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Com um tampão adequado para a cromatografia de afinidade, dissolver o pellet, transferir a suspensão bacteriana para tubos menores e sonicar no gelo. Depois de centrifugar o lisado, purificar as proteínas WSCP marcadas recombinantes utilizando o sistema de cromatografia de afinidade comercialmente disponível para a purificação das proteínas, de acordo com as instruções do fabricante.

Preparar a fase aquosa da emulsão trocando o tampão por tampão fosfato a 50 milimolares pH 7,8 e ajustando a concentração purificada de WSCP a 0,5 a 1 miligrama por mililitro. Para preparar uma fase aquosa contendo lisado bacteriano bruto com WSCP, cultive células E.coli BL21 contendo um plasmídeo expressando WSCP em 250 mililitros de LB a 37 graus Celsius para a fase logarítmica. Adicione 1 IPTG milimolar para induzir a expressão de proteínas e cultive as bactérias a 30 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, após a colheita, as células bacterianas usam 1-2 mililitros de tampão fosfato de sódio 50 milimolares pH 7,8 para dissolver o pellet. Em seguida, após a sonicação, centrifugar o lisado a 12 000 g e a 4 graus Celsius durante 30 minutos. Prepare a fase aquosa da emulsão misturando 0,125 mililitros de sobrenadante com 0,875 mililitros de tampão fosfato de sódio 50 milimolar pH 7,8.

Para montar o WSCP com clorofila a em emulsão, transfira 5 mililitros de uma mistura de óleo e surfactante bem misturada para um frasco de vidro e deixe esfriar com gelo. Adicione 1 mililitro de fase aquosa gelada recém-preparada e use um homogeneizador de tecidos a 9.500 RPM no gelo por dois minutos para misturar as duas fases. Deste ponto em diante, realizando todas as etapas sob luz verde para minimizar o fotodano, adicione 20 microlitros de clorofila 25 milimolar uma solução estoque à emulsão.

Disperse sacudindo e invertendo o frasco de vidro, garantindo que a clorofila a seja distribuída uniformemente na emulsão, depois incube no gelo no escuro por 1-2 horas. A etapa crítica durante a preparação da emulsão é resfriar a fase aquosa e a fase orgânica antes de misturar. Em seguida, para quebrar a emulsão e separar as gotículas de água da fase orgânica, transfira a emulsão para tubos de plástico de 1,5 mililitro e centrifugue a 14.000 G em temperatura ambiente por cinco minutos.

Descarte a fase oleosa superior e adicione 1 mililitro de óleo mineral à fase inferior, depois misture bem por vórtice ou virando o tubo. Depois de centrifugar a amostra, remover a fase oleosa superior e repetir a adição de óleo mineral e a centrifugação até obter um menisco límpido que separa as fases aquosa e mineral sem uma emulsão intermédia. Agora, à fase aquosa, adicione 1 mililitro de éter dietílico saturado de água.

Em seguida, após o vórtice da amostra, gire-a a 14.000 G por 5 minutos à temperatura ambiente. Após a terceira centrifugação, no exaustor, remova o éter dietílico e deixe os tubos abertos por 5-20 minutos. Finalmente, carregar a fase aquosa contendo o complexo WSCP-clorofila a em uma coluna de dessalinização e eluir com um tampão apropriado para experimentos futuros.

Armazene a amostra a 4 graus Celsius longe da luz por até um mês. Usando o protocolo descrito neste vídeo, apoproteínas WSCP recombinantes foram montadas com clorofila a em emulsões de água e óleo. Aqui são mostradas as absorbâncias e espectros de CD de complexos de clorofila a com quatro variantes WSCP recombinantes.

Os resultados são semelhantes na posição final em forma de banda aos espectros relatados anteriormente dos respectivos complexos nativos. Esta figura mostra a montagem positiva de WSCP com clorofila a em lisados de células que expressam WSCP, conforme visto pela cor verde da fase aquosa. Este resultado demonstra o potencial das emulsões de água e óleo como um sistema de triagem rápida para montagem positiva de WSCPs com clorofilas.

Como demonstrado aqui, gotículas de lisados contendo WSCP apresentam fluorescência distinta de clorofila a em imagens de microscópio confocal. Isso implica que a montagem bem-sucedida de complexos WSCP-clorofila pode ser detectada diretamente nas gotículas de água e pode fornecer uma base para sistemas de triagem baseados em emulsão de água e óleo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita por cinco horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o trabalho com clorofilas deve ser feito rapidamente, sem expor a clorofila à luz e ao oxigênio. Após seu desenvolvimento, essa técnica nos permitiu preparar uma ampla gama de proteínas de ligação à clorofila solúveis em água que são usadas para explorar o efeito do ambiente proteico nas propriedades eletrolíticas e espectrais das clorofilas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair e purificar clorofilas de cianobactérias e montá-las em proteínas solúveis em água usando emulsões de água e óleo.

Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos, como éter, metanol ou acetona, pode ser prejudicial e devem ser sempre tomadas precauções, como trabalhar com uma coifa química, durante a realização deste procedimento.