Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

O objetivo geral deste ensaio é detectar alterações na capacidade migratória das células estromais mesenquimais pulmonares após danos com extrato solúvel de fumaça de cigarro. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da biologia regenerativa pulmonar, incluindo como a capacidade migratória das células progenitoras pulmonares pode ser melhorada para ajudar no reparo pulmonar. A principal vantagem dessa técnica é que ela foi otimizada para fornecer melhores medições quantitativas para a migração celular, mantendo-se econômica de executar e fácil de personalizar.

Nesta demonstração, o ensaio de arranhões será usado para quantificar a capacidade migratória das células estromais mesenquimais do pulmão murino, ou MSCs. Após a exposição ao extrato solúvel de fumaça de cigarro, as MSCs são cultivadas em meio completo em placas de 60 milímetros e danificadas conforme descrito no texto do protocolo. Uma confluência apropriada é importante para o ensaio de arranhão porque garante que o software de imagem possa identificar corretamente os limites do arranhão.

Este exemplo mostra MSCs em 95% de confluência apropriada para arranhões em um ambiente estéril. Remova a tampa de uma placa de MSCs danificadas e coloque uma borda reta, como uma régua de plástico esterilizada na borda superior da placa. Uma borda reta minimiza a quantidade de ajustes rotacionais necessários para a placa quando ela é posteriormente colocada na platina do microscópio para geração de imagens.

Sem remover a mídia, use uma ponta de pipeta estéril de 200 microlitros guiada pela borda reta estéril para fazer quatro arranhões paralelos na placa, com aproximadamente cinco milímetros de distância e 50 milímetros de comprimento. A geração de vários arranhões em uma placa de 60 milímetros não altera o microambiente de uma forma que afete a migração celular para MSCs, mas pode ser uma consideração para outros tipos de células. Aspire o meio e lave suavemente a placa com dois mililitros de meio completo pré-aquecido.

Isso evita que as células adiram ao centro do arranhão e remove as células que foram soltas pelo arranhão. Substitua por quatro mililitros de mídia completa nova usando uma etiqueta de marcador estéril e permanente em cada arranhão de um a quatro na parte inferior da placa em locais que não interfiram na imagem. As imagens iniciais dos arranhões de cada arranhão devem ser tiradas, pois é importante que as imagens do mesmo arranhão sejam comparadas antes e depois da migração, pois pode haver variação na largura do arranhão.

Se o ensaio de arranhões for realizado em várias placas, recomenda-se que as imagens iniciais de todos os arranhões em uma única placa sejam tiradas antes que os arranhões sejam feitos na próxima placa. Use um microscópio de contraste de fase invertida com uma câmera para adquirir as imagens necessárias para análise. Posicione a placa de cultura no microscópio e use a objetiva de baixa potência para localizar arranhões.

Número um. É imperativo que o arranhão apareça completamente horizontal na tela, mantendo o arranhão completamente horizontal e no centro do campo de visão, obtenha quantas imagens forem necessárias para abranger 90% do comprimento do arranhão. Obtenha imagens de partes distintas do arranhão sem sobreposição entre as imagens.

Não tire imagens do primeiro e do último 5% do comprimento do arranhão, pois a refração da luz nas bordas da placa de cultura expõe demais as imagens, impossibilitando-as de analisar. Salve imagens do zero, número um em uma pasta. Obtenha imagens para arranhões dois, três e quatro da mesma maneira e salve as imagens de cada rascunho em uma pasta separada.

Retorne as placas à incubadora imediatamente após esta imagem inicial. Deixe as células migrarem por quatro a sete horas antes de iniciar este ensaio. Baixe o software Image J e instale o plug-in da ferramenta de cicatrização de feridas.

Abra o arquivo de imagem na imagem J, clique em processar e encontre bordas para destacar as células ao redor do arranhão para a ferramenta de cicatrização de feridas. Para calcular a área de risco, clique em ajuste de imagem e limite de cor e, no menu suspenso rotulado cor do limite, altere o valor para BNW no menu de limite de cor. Mova o controle deslizante inferior completamente para a direita para deixar a imagem completamente preta e, em seguida, ajuste o controle deslizante superior para gerar o máximo contraste entre o arranhão e a frente da célula.

Ajuste lentamente o controle deslizante de brilho superior da esquerda para a direita até que a imagem exiba claramente o contorno do arranhão. Depois que as bordas do arranhão forem identificadas, clique em mais ferramentas. Na barra de ferramentas J da imagem, selecione a ferramenta de cicatrização de feridas de ressonância magnética no menu suspenso e pressione o botão M para destacar a área de arranhões e gerar a área calculada.

Em uma janela pop-up de resultados, copie e cole todos os números da janela de resultados em uma planilha do Excel. Certifique-se de separar os dados de arranhões individuais. Depois que as células migrarem por quatro a sete horas, repita o procedimento de aquisição de imagem para a imagem de arranhões nas placas na mesma ordem em que foram riscadas, de modo que as células de cada placa tenham o mesmo tempo para migrar.

As células podem ser visualizadas em vários pontos de tempo, dependendo de sua sensibilidade às mudanças de temperatura e pH. As imagens de rascunho finais são então analisadas usando a Imagem J da mesma forma demonstrada para as imagens de rascunho iniciais. As áreas de rascunho também podem ser calculadas para quantificar a migração, correto.

O Confluence é fundamental para o sucesso do ensaio de arranhões. Um arranhão bem-sucedido de MSCs de pulmão murino a 95% de confluência é mostrado aqui. Em contraste, uma confluência de 70% é muito baixa para um arranhão bem-sucedido e pode produzir limites falsos.

Estas são imagens originais representativas pré e pós-migração com limites de área de risco correspondentes, conforme definido pelo software de imagem. Esses gráficos mostram a área média calculada em pixels para cada um dos quatro arranhões feitos em uma placa de MSCs de pulmão murino a 95% de confluência antes ou depois da migração com exposição a 0% ou 4% de extrato de fumaça de cigarro. Uma comparação da mudança média calculada na área de arranhões revelou menor migração de MSC de pulmão murino após a exposição ao extrato de fumaça de cigarro a 4%.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar e monitorar cuidadosamente a confluência celular para o tipo de célula específico com o qual estávamos trabalhando e praticar a geração dos arranhões para garantir que sejam o mais uniformes possível. Após este procedimento, outras técnicas como imuno-histoquímica podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre alterações e expressão de proteínas que podem afetar a migração celular.