Name: Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de wound healing otimizado para quantificar a migração de células-tronco mesenquimais pulmonares murinas após exposição a extrato solúvel de fumaça de cigarro. Este método econômico e personalizável oferece medições quantitativas precisas para estudos de biologia regenerativa pulmonar.

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Somos gratos aos outros membros do laboratório por sua assistência técnica no desenvolvimento do ensaio de danos CSE e seu apoio e aconselhamento durante o desenvolvimento deste ensaio. Além disso, somos gratos ao Comitê Acadêmico da Santa Cruz Fenwick por seu apoio a Nicholas Cormier e ao programa Holy Cross College Honors por seu apoio a Alexander Yeo.

Nota: Para este estudo, as células estromais mesenquimatosas do pulmão (LR-MSC) a partir de tecido de pulmão distai foram isoladas, quer com base na sua expressão de marcadores de superfície celular (CD45 negativo, CD31 negativo, Sca-1 elevada, EpCAM neg) 14,15, usando explante out-crescimento de 16, ou usando a digestão enzimática 17. Aderente LR-MSC foram cultivadas em DMEM com glucose elevada e sem glutamina, 15% de FBS, glutamina mM de antibiótico / antimicótico 1x e 2 (meio completo daqui em diante) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO 2. LR-MSC foram passadas 3-4 vezes para assegurar uma população de células com características de crescimento relativamente homogéneas para o ensaio de migração. 1. Preparar uma monocamada confluente <ol><li> Para separar as MSCs a partir de placas de cultura padrão de 100 mm, lavar as células com 10 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS, aspirar o PBS e adicionar 4 ml de tripsina (0,25%). Incubar em 3-5 min a 37 ° C incubadora. Aspirar o cells para um tubo cónico, adicionar um volume igual de meio completo e centrifugação a 300 g durante 5 min para sedimentar as células para baixo. Nota: de incubação mais longo em tripsina pode alterar os receptores da superfície celular e, potencialmente, afectar a migração. </li><li> Aspirar media e células ressuspender em meio completo fresco. Contagem de células, excluindo as células mortas usando exclusão com azul de tripano e as células do estroma placa 500.000 mesenquimais em 4 ml de meio completo numa célula de 60 mm de cultura prato. Nota: Dependendo da fonte das células, os testes podem ser necessários para determinar o número óptimo de células necessárias. </li><li> Incubar as células até placas são 90% confluentes para fixação celular ideal e proliferação, normalmente 48-72 horas para MSC. Nota: 100% de confluência não é recomendado, uma vez que muitos inibição células experiência de contato dependentes de ancoragem, o que pode alterar a sua capacidade migratória. Placas com menos de 80% de confluência irá resultar em fotos inutilizáveis ​​porque o software de análise de imagem irá interpretar lacunas entre as células como parte do perímetro do zero (veja a Figura 1D). </li><li> Após as células terem atingido confluência de 90%, danificar as células conforme for apropriado para a aplicação. Para avaliar o dano celular após a exposição à fumaça de cigarro extrato solúvel (CSE), geram 100% CSE, chamando a fumaça de um cigarro Universidade de Kentucky pesquisa (3R4F) através de 25 ml de meio completo em um Kitasato mais de 2 min 18. </li><li> Incubam-se as células durante 24 horas em 4 ml de 1-4% de CSE diluído em meio completo. Após incubação, lavam as células duas vezes com 4 ml de PBS estéril quente, antes de substituir com 4 ml de meio completo fresco. Nota: danificar as células com alta concentração de extrato de fumaça de cigarro (&gt; 5%) pode reduzir substancialmente confluência. </li></ol> 2. Criação da Raspadinha <ol><li> Em um ambiente estéril, retire a tampa da placa de 60 milímetros de MSCs danificados, e estabelecer uma borda em linha reta (por exemplo, uma régua de plástico esterilizado) acRoss da borda superior da placa. Sem remover a mídia, use um estéril ponta da pipeta 200 mL guiado pelo straight-edge estéril para fazer um a quatro arranhões paralelos em toda a placa aproximadamente 5 milímetros e 50 mm de comprimento. Nota: Uma borda reta minimiza a quantidade de ajustes de rotação necessários para a placa quando está no palco microscópio. É imperativo que os arranhões aparecer completamente vertical (ou horizontal) na tela. Gerando múltiplas arranhões em uma placa 60 mm não altera o microambiente de uma forma que afecta a migração de células (dados não mostrados), mas podem ser uma consideração para outros tipos de células. O uso de pequenos poços não é recomendado uma vez que a variabilidade de células crescendo perto da borda do poço se torna mais pronunciada e pode afectar a geração uniforme de arranhões. </li><li> Aspirar os meios e lava-se suavemente as placas com 2 ml de meio completo pré-aquecido para impedir que as células adiram ao centro do zero, e para remover célulass que foram soltos pelo coçar. Substitua com 4 ml de meio completo fresco. </li><li> Usando um marcador permanente estéril, etiquetar cada arranhão de 1-4 no lado inferior da placa no local que não interfira com a imagiologia do arranhões. Nota: É importante que as imagens do mesmo zero são comparadas antes e após a migração, já que pode haver variação na largura zero. </li></ol> 3. Tendo Imagens iniciais da Raspadinha Nota: Se o ensaio de zero é efectuada em várias placas, recomenda-se que as imagens iniciais de todos os arranhões em uma única placa são tomadas antes arranhões são feitas na placa seguinte. <ol><li> Usar um microscópio de contraste de fase invertida com uma câmara para gerar as imagens necessárias para análise. </li><li> Posicione a placa de cultura no microscópio, e use o objectivo de baixa potência (10X) para localizar zero # 1. Se a condensação sobre a tampa da placa de cultura está a impedir uma clara image das células, utilizar um conjunto de fase aquecida a 37 ° C. </li><li> Mantendo a zero completamente horizontal e no centro do campo de vista, obter o número de imagens necessárias para abranger 90% do comprimento do zero. Obter imagens de partes distintas do zero com nenhuma sobreposição entre as imagens. Nota: A refracção da luz nas bordas da placa de cultura superexpõe as imagens, o que os torna impossível de analisar. Portanto, não tirar fotos a partir do primeiro e duram 5% do comprimento do zero. </li><li> Salve imagens de cada arranhão em uma pasta separada. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,4 para arranhões 2, 3 e 4. </li><li> Retorno placas para a incubadora imediatamente após a imagem inicial. Deixe as células migram para 4-7 horas. Nota: 7 horas é o ideal quando se avalia MSCs danificadas com CSE. A incubação de células durante mais de 7 horas não é recomendada porque a proliferação de células pode actuar como uma variável de confusão durante a migração celular (ver Nota Opcional 8.2 abaixo). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analisando iniciais de raspadinhas Imagens <ol><li> Baixe e instale o ImageJ Ferida plugin de instrumento de cura (consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos). </li><li> Abra o arquivo de imagem em ImageJ, clique em &quot;Processo&quot; e &quot;Find Edges&quot; para destacar as células ao redor do zero para a Ferramenta de cicatrização de feridas para calcular a área de rascunho (Figura 2B). Em seguida, clique em &quot;Imagem&quot;, &quot;Ajuste&quot;, &quot;Limiar de cores&quot; e no menu dropdown rotulado &quot;Limiar de cores&quot; altere o valor para &quot;B &amp; W&quot;. </li><li> Dentro do menu &quot;Limiar de cores&quot;, ajuste ambos os controles deslizantes de nível de luminosidade até um contraste perfeito entre zero e celular frente a é alcançado. Para permitir o maior alcance ao tentar criar contraste na imagem, mova o controle deslizante inferior completamente para a direita (imagem totalmente preta), e em seguida, ajuste o controle deslizante superior para gerar o máximo de contraste. </li><li> Ajuste lentamente o topo brideslizante lho da esquerda para a direita até que a imagem limpa mostra o contorno do zero (Figura 2C). Uma vez que foram identificadas as bordas do zero, clique em &quot;Mais Ferramentas&quot; na barra de ferramentas ImageJ, selecione &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; no menu suspenso, e pressione o botão &quot;m&quot; (que aparecerá na barra de ferramentas ImageJ) para destacar a área de rascunho e saída da área computada em uma janela pop-resultados out (Figura 2D). </li><li> Copiar e colar todos os números da janela de resultados (Figura 2E) em uma planilha excel. Certifique-se de separar os dados de arranhões individuais. </li></ol> 5. Tendo Imagens Finais da Raspadinha <ol><li> Depois que as células migraram (4-7 hr), repita os passos de 3,2-3,4. Imagem das placas na mesma ordem em que foram riscados de modo que as células em cada placa tiveram o mesmo tempo para migrar. Nota: As células podem ser trabalhada em vários pontos de tempo, dependendo da sua sensividade de ambas as mudanças de temperatura e de pH. Alternativamente, imagens de células vivas pode ser usado para seguir as células em tempo real, à medida que migram. </li></ol> 6. Analisando finais de raspadinhas Imagens <ol><li> Repita os passos de 4,2-4,5 para imagens finais zero. </li></ol> 7. Cálculo da área de rascunho para quantificar as Migrações <ol><li> Calcula-se a área média pré-migração calculando a média dos valores dos respectivos riscos iniciais da área. </li><li> Calcule a quantidade total de migração subtraindo a área de migração final para cada imagem, calculado na etapa 6, a partir da área de pré-migração média (passo 7.1). Gerar uma lista de valores para cada um zero que representa a alteração na migração. </li><li> Reúnem-se os dados a partir de múltiplos arranhões dentro do mesmo grupo de teste (ou seja, todas as placas e todos os arranhões em células expostas a 0% de CSE). Use um teste de análise de variância para analisar as diferenças entre os grupos experimentais. </li><li> Se as células são lentos para migrare necessitam de um tempo de incubação mais longo após arranhão (superior a 10-12 h), executar um ensaio de incorporação de BrDU ou EdU 19 para determinar se as células são submetidos a qualquer proliferação durante o período em que o ensaio de migração está a ocorrer. Escolha um tempo de ensaio de migração para evitar a proliferação celular significativa. </li></ol> 8. Opcional <ol><li> Para avaliar se a senescência celular é significativo que ocorre como resultado do procedimento de coçar, realizar um ensaio de beta-galactosidase associada a senescência em uma placa de ensaio em tempos predeterminados após arranhão 19. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo descrito aqui fornece um método quantitativo robusto, padronizado para executar e analisar testes de zero. Ensaios simples arranhão são rotineiramente utilizados em muitas áreas diferentes de estudo para analisar a migração celular. No entanto, tradicionalmente o ensaio zero faltou um set-up e quantificação protocolo padronizado, o que levou a problemas com a reprodutibilidade 7,10. Muitas das modificações e otimizações para melhorar o ensaio zero reduziram essas questões, incluindo imagens ao viv...

A migração celular é altamente coordenada e vital para muitos processos fisiológicos, tais como desenvolvimento do tecido, reparação e regeneração, bem como processos patológicos tais como a metástase do cancro e arteriosclerose 1. Uma compreensão da migração celular é particularmente relevante para as terapias emergentes utilizadas para reparar tecidos danificados e tratar condições patológicas, incluindo as tecnologias de transplante de células e tecidos artificial enxerto 2. Dado o interesse atual no papel de células estromais mesenquimais (MSCs) na mediação de reparação de tecidos 3, quantificando a capacidade migratória destas células usando um ensaio que é rigorosamente quantificável, adaptável e relação custo-benefício é de interesse. É importante ressaltar que tal ensaio deve ser suficientemente sensível para detectar mudanças relativamente sutis na capacidade migratória celular após dano. Os métodos actuais para quantificar a migração de células, incluindo ensaios de risco, os ensaios de migração trans-poços (CH Boydenâmbares), matrizes micropillar e ensaios zona de exclusão de células possuem uma série de limitações na reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-efetividade 1,4,5. O ensaio zero otimizado aqui descrito demonstra resultados robustos, capacidade de análise quantificáveis ​​e baseados em imagem, relação custo-eficácia e capacidade de adaptação a outras aplicações. Os ensaios de raspadinhas têm sido utilizados em várias capacidades para avaliar a migração celular e proliferação em diferentes condições experimentais 5. O ensaio implica semeando as células designadas, cultivá-las para completar ou próximo da confluência, e coçar a monocamada resultante com uma agulha estéril ou ponta de pipeta 6. Análise é mais vulgarmente efectuada por comparação da largura do zero ao longo de múltiplos pontos de tempo em locais seleccionados aleatoriamente 7-9. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio do zero é confundida por problemas com a reprodutibilidade e quantificação. A variabilidade nageração de zero a não apenas altera o microambiente das células, mas também pode impedir a migração de células ao danificar a superfície da placa e da matriz extracelular subjacente 5. Os ensaios são frequentemente realizados ao longo de 7 a 12 h, no entanto, para linhas de células exibindo migração mais lenta e os tempos de ensaio mais longos, a proliferação torna-se uma variável de confusão 7,10. Por último, as células senescentes gerados pelo processo de coçar pode libertar factores que interferem com a sinalização extracelular necessária para fechar a fenda na monocamada 1. Optimizar a zero ensaio requer a criação de uma diferença consistente, que não interfere com as propriedades de superfície, minimizando o comprimento de tempo de ensaio, e a prevenção da morte de células indesejáveis ​​durante a manipulação. O ensaio à base de batente consiste numa optimização do ensaio de uma zona de exclusão de células. Este ensaio utiliza uma rolha colocado no meio do poço que exclui o crescimento celular, mas permite que as células a ser revestida em volta da zona de exclusão central.Para avaliar a migração, a tampa é removida, e a zona de exclusão resultante proporciona uma superfície para a migração ocorra. No entanto, este ensaio é difícil para personalizar ou adaptar a 10 e para algumas aplicações, esta técnica também pode ser um custo proibitivo. Em contraste com os ensaios de zero e os seus derivados, ensaios de trans-migração bem (ou ensaios de câmara de Boyden) avaliar a migração através da quantificação do número de células que se movem de uma câmara, através de um filtro de membrana microporosa, para uma câmara contendo agentes quimiotácticos 8,11, 12. Esta técnica tem utilidade limitada para as células aderentes como as MSCs porque após a migração através da membrana porosa, as células aderem ao lado da membrana exposta aos agentes quimiotácticos, e pode ser difícil de quantificar com precisão. Enquanto o ensaio é capaz de analisar alguns padrões de migração tridimensionais, os tipos de células restritas para o qual é capaz de quantificar com precisão limite de migração celular sua utilidade 10. Outra alternativa para ensaios de zero usa uma rede de micro-pilar, que mede a motilidade celular através de um espaço tridimensional utilizando a capacidade das células para se deformar e migram para a matriz como um substituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre um molde preciso e tratada com ozono e fibronectina produz um microambiente homogénea e não degradável. Espaçamento Micro-pilar também pode ser variado conforme necessário para avaliar a capacidade das células para introduzir a matriz 4. O molde é criado por meio de gravura de ião reactivo profundo de bolachas de silício para criar uma versão da matriz negativa de alta relação de aspecto 13. Enquanto o ensaio é reforçada pela sua capacidade de personalização, capacidade de modelar a migração tridimensional, e análise através da visualização direta de células que migram, dificuldade em criar micro-pilar matrizes impede economicamente seu uso generalizado. O ensaio zero otimizado descrito neste protocolo oferece uma eficiente, cosmétodo t-eficaz para produzir arranhões consistentes que podem ser analisados ​​usando o software disponível gratuitamente. Em vez de medidas de largura simples, feitas em toda a zero antes e depois da migração celular, o software permite ao usuário determinar áreas totais scratch antes e depois da migração. Este avanço limita a questão de tentar determinar onde a zero as medidas de largura devem ser tomadas, e se a largura do zero é uniforme ao longo dela de comprimento. Além disso, a optimização cuidadosa dos números de células, confluência celular e o tipo e grau do dano infligido nas células é discutida, a fim de optimizar ainda mais o ensaio.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glicose alta, sem adição de glutamina)</td> <td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td>Glutamina <td>SV3007901</td><td></td> <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Reagente</td><td>de</td> dissociação celular Fisher Scientific SH3003401 <td></td></tr><tr><td>TypeLE</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td>Placas de cultura de tecidos padrão <td>Fisher</td><td>Scientific SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Estéril 200 &mu; l pontas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz invertida com anexo de câmera</td><td>Software Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise estatística</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

otimização do ensaio wound zero para detectar mudanças na murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por extract fumo do cigarro solúvel

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

A migração celular é vital para muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo desenvolvimento, reparo e regeneração de tecidos, metástase de câncer e respostas inflamatórias. Dado o interesse atual no papel das células estromais mesenquimais na mediação do reparo tecidual, estamos interessados em quantificar a capacidade migratória dessas células e entender como a capacidade migratória pode ser alterada após o dano. A otimização de um ensaio de migração rigorosamente quantitativo que seja fácil de personalizar e econômico de realizar é fundamental para responder a perguntas sobre alterações na migração celular em resposta a vários estímulos. Os métodos atuais para quantificar a migração celular, incluindo ensaios de risco, ensaios de migração trans-well (câmaras de Boyden), matrizes de micropilares e ensaios de zona de exclusão celular, possuem uma série de limitações em reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-benefício. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio de arranhões é confundido por problemas de reprodutibilidade relacionados a danos ao microambiente celular, impedimentos à migração celular, influência de células senescentes vizinhas e proliferação celular, bem como falta de quantificação rigorosa. O ensaio de arranhões otimizado descrito aqui demonstra resultados robustos, recursos de análise quantificáveis e baseados em imagens, custo-benefício e adaptabilidade a outras aplicações.

Os ensaios scratch aqui apresentadas foram realizadas utilizando residentes pulmão células estromais mesenquimais murino (LR-MSCs) e isolado como referência nas notas de protocolo. O LR-MSC foram semeadas a uma densidade de 500000 células em 60 mm de cultura de tecidos prato, e cultivadas a 90% de confluência em 48 horas. Para gerar danos, 4% de CSE (descrito acima) foi incubado com as células durante 24 horas após o período de sementeira inicial, mas antes do ensaio zero. Para cada ensaio, o zero foi gerado usando uma ...

A capacidade de migrar é uma função chave de muitos tipos diferentes de células, incluindo células estromais mesenquimais (MSCs). No entanto, quantificar as alterações na capacidade migratória após os danos é um desafio. Este protocolo descreve um ensaio de migração facilmente adaptável que usa estatísticas rigorosas para quantificar as mudanças na capacidade migratória do MSC após danos.

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

O objetivo geral deste ensaio é detectar alterações na capacidade migratória de células estromais mesenquimais pulmonares após dano com extrato solúvel de fumaça de cigarro. Este método pode ser usado para responder perguntas-chave na área de biologia regenerativa pulmonar, incluindo como a capacidade migratória de células progenitoras pulmonares pode ser aprimorada para auxiliar na reparação pulmonar. A principal vantagem desta técnica é que ela foi otimizada para fornecer melhores medições quantitativas da migração celular, mantendo-se ainda econômica e de fácil personalização.Nesta demonstração, o ensaio de arranhão será usado para quantificar a capacidade migratória de células estromais mesenquimatosas pulmonares de camundongo, ou CEMs. Após exposição ao extrato solúvel de fumaça de cigarro, as CEMs são cultivadas em meio completo em placas de 60 milímetros e danificadas conforme descrito no texto do protocolo. Uma confluência apropriada é importante para o ensaio de arranhão porque garante que o software de imagem possa identificar corretamente os limites do arranhão.Este exemplo mostra MSCs em 95% de confluência, adequadas para arranhão em ambiente estéril. Remova a tampa de uma placa de MSCs danificadas e posicione uma borda reta, como uma régua de plástico esterilizada, sobre a borda superior da placa. Uma borda reta minimiza a quantidade de ajustes rotacionais necessários para a placa quando esta for posteriormente colocada na platina do microscópio para obtenção de imagens.Sem remover o meio, utilize uma ponteira estéril de pipeta de 200 microlitros guiada pela borda reta estéril para fazer quatro riscos paralelos no platô, aproximadamente cinco milímetros de distância entre si e com 50 milímetros de comprimento. A geração de múltiplos riscos em um platô de 60 milímetros não altera o microambiente de forma a afetar a migração celular de MSCs, mas pode ser uma consideração para outros tipos celulares. Aspire o meio e lave suavemente o platô com dois mililitros de meio completo pré-aquecido.Isso impede que as células adiram ao centro do arranhão e remove as células que foram soltas pelo arranhamento. Substitua por quatro mililitros de meio completo fresco utilizando um marcador permanente estéril e rotule cada arranhão de um a quatro na parte inferior da placa em locais que não interfiram na obtenção de imagens. As imagens iniciais de cada arranhão devem ser obtidas porque é importante comparar imagens do mesmo arranhão antes e depois da migração, já que pode haver variação na largura do arranhão.Se o ensaio de arranhão for realizado em várias placas, recomenda-se que as imagens iniciais de todos os arranhões em uma única placa sejam capturadas antes que arranhões sejam feitos na próxima placa. Utilize um microscópio invertido de contraste de fase com câmera para adquirir as imagens necessárias para análise. Posicione a placa de cultura no microscópio e utilize a objetiva de baixa potência para localizar o arranhão.Número um. É imperativo que o arranhão apareça completamente horizontal na tela, mantendo-o totalmente horizontal e no centro do campo de visão; obtenha quantas imagens forem necessárias para abranger 90% do comprimento do arranhão. Adquira imagens de porções distintas do arranhão, sem sobreposição entre as imagens.Não obtenha imagens dos primeiros e últimos 5% do comprimento do arranhão, porque a refração da luz nas bordas da placa de cultura superexposta as imagens, tornando-as impossíveis de analisar. Salve as imagens do arranhão número um em uma pasta. Obtenha imagens dos arranhões dois, três e quatro da mesma maneira e salve as imagens de cada arranhão em pastas separadas.Retorne as placas ao incubador imediatamente após essa imagem inicial. Deixe as células migrarem por quatro a sete horas antes de iniciar este ensaio. Baixe o software Image J e instale o plugin da ferramenta de cicatrização de ferimentos.Abra o arquivo de imagem no ImageJ, depois clique em processar e encontre as bordas para destacar as células ao redor da marcação para a ferramenta de cicatrização de ferimento. Para calcular a área da marcação, clique em imagem ajustar e limite de cor, e no menu suspenso denominado cor do limite, altere o valor para BNW dentro do menu de limite de cor. Mova o controle deslizante inferior completamente para a direita para tornar a imagem completamente preta, e então ajuste o controle deslizante superior para gerar o máximo contraste entre a marcação e a frente celular.Ajuste lentamente o controle deslizante de brilho superior da esquerda para a direita até que a imagem exiba claramente o contorno do arranhão. Uma vez identificadas as bordas do arranhão, clique em mais ferramentas. Na barra de ferramentas do Image J, selecione a ferramenta de cicatrização de ferida por RM da lista suspensa e pressione a tecla M para destacar a área do arranhão e obter a área calculada.Em uma janela pop-up de resultados, copie e cole todos os números da janela de resultados em uma planilha do Excel. Certifique-se de separar os dados de cada arranhão individual. Após as células terem migrado por quatro a sete horas, repita o procedimento de aquisição de imagens para os arranhões, imageando as placas na mesma ordem em que foram arranhadas, de modo que as células em cada placa tenham tido tempo igual para migrar.As células podem ser monitoradas em múltiplos pontos temporais, dependendo de sua sensibilidade às alterações de temperatura e pH. As imagens finais da marcação são então analisadas usando o ImageJ da mesma forma que demonstrado para as imagens iniciais da marcação. As áreas da marcação também podem ser calculadas para quantificar a migração, corretamente.A confluência é essencial para o sucesso do ensaio de arranhão. Um arranhão bem-sucedido em MSCs pulmonares de camundongo com 95% de confluência é mostrado aqui. Em contraste, uma confluência de 70% é insuficiente para um arranhão bem-sucedido e pode gerar fronteiras falsas.Estas são imagens originais representativas pré e pós-migração, com os respectivos limites da área do arranhão conforme definidos pelo software de imagem. Esses gráficos mostram a área média calculada do arranhão em pixels para cada um dos quatro arranhões feitos em uma placa de CMMs pulmonares murinos com 95% de confluência, antes ou após a migração, com exposição a 0% ou 4% de extrato de fumaça de cigarro. A comparação da alteração média calculada na área do arranhão revelou menor migração das CMMs pulmonares murinas após exposição a 4% de extrato de fumaça de cigarro.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar e monitorar cuidadosamente a confluência celular para o tipo específico de célula com o qual está sendo trabalhado, além de praticar a geração dos arranhões para garantir que sejam tão uniformes quanto possível. Após este procedimento, outras técnicas como imunohistoquímica podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre alterações e expressão proteica que possam afetar a migração celular.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.

Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Este estudo centra-se em um modelo em vitro de ferida cura (zero ensaio) como um mecanismo para determinar contaminantes como ambientais tais como migração celular de influência de arsênico. Os resultados demonstram que este ensaio in vitro fornece indicações rápidas e precoce de alterações à migração celular antes da experimentação na vivo .

In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.

Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

Por meio da incorporação do design da experiência de interação e da análise dos requisitos do usuário, introduzimos um raspador de células inovador que aprimora os ensaios de cicatrização de feridas celulares em termos de reprodutibilidade, confiabilidade, praticidade, integridade celular e experiência do usuário.

Uma ferramenta para criar automaticamente lacunas livres de células estáveis e reprodutíveis para melhorar a confiabilidade do ensaio de cicatrização de feridas celulares

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Aprenda a usar o ensaio de wound healing otimizado para quantificar a migração de células-tronco mesenquimais pulmonares murinas após exposição a extrato solúvel de fumaça de cigarro. Este método econômico e personalizável oferece medições quantitativas precisas para estudos de biologia regenerativa pulmonar.

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