Name: Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a extrair alfa-sinucleína solúvel e insolúvel de cérebros parkinsonianos pós-morte usando ultracentrifugação e western blot. Este método permite analisar agregados proteicos em tecido humano patológico.

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Agradeço ao Dr. Adamantios Mamais por extrair α-sinucleína de tecido humano e execução de borrões. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa MRC (MR / L010933 / 1) e em parte pelo prêmio Wellcome Trust / MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) para o Consórcio da Doença de Parkinson do Reino Unido (UKPDC), cujos membros são do Instituto de Neurologia da UCL, da Universidade de Sheffield e da Unidade de Fosforilação de Proteínas MRC da Universidade de Dundee. A RB recebeu financiamento da fundação MJFox para este trabalho e também é financiada pelo Reta Lila Weston Trust.

Tecido cerebral post-mortem foi doado para Queen Square Cérebro Banco para doenças neurológicas, University College London, Institute of Neurology utilizando protocolos e eticamente aprovados armazenada para a investigação sob uma licença emitida pela autoridade de tecido humano (HTA) Reino Unido (n. 12198). Veja a lista dos casos usados ​​para este protocolo (Tabela 1). 1. Preparação de buffers <ol><li> Prepare 1X TBS (solução salina Tris) buffer: <ol><li> Prepare 10X TBS como solução de reserva com 500 mM Tris-HCl pH 7,4 e 1500 mM de NaCl. <ol><li> Pesar 60,5 g de Tris-Cl pH 7,6 e 87,6 g de NaCl em 800 ml de água de elevada pureza. Ajustar o pH com HCl 1 M e perfazer o volume final para estoque 1 L. </li></ol></li><li> Preparar a concentração final de 1X TBS, diluindo o estoque 10 vezes em água destilada. </li><li> Adicionar inibidores de protease (PI), (1 comprimido por 50 ml de tampão) e Fos-stop comprimidos de inibidor de fosfatase (1 comprimido por 10 ml de tampão) arevogar os efeitos das ações enzimáticas não-específicas de proteases e fosfatases. Nota: Aqui, utilizamos a enzima inibidor comprimidos de Roche, mas igualmente outros inibidores disponíveis comercialmente podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Preparar tampão TBS-SDS por adição de 5% w / v de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) tampão. Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante usando um agitador magnético para solubilizar SDS. </li><li> Preparar tampão TBS-SDS-ureia, adicionando ureia a uma concentração final de 8 M w / v de tampão TBS 1X-SDS (pH 7,4). Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante num agitador magnético para dissolver a ureia. </li></ol> 2. A homogeneização da amostra e Ultracentrifugação Diferencial Nota: A parte seguinte do trabalho envolve a manipulação de tecido cerebral humano de acordo com as regras da HTA Reino Unido. Procedimentos operacionais padrão locais são seguidos em todos os times. Amostras do cérebro são dissecados a partir de blocos de cérebro congeladas e material de tecido homogeneizado num microcabinet mantido a pressão negativa. Vestidos de luvas descartáveis, máscaras, face-over-sapato protetores e óculos de segurança são usados ​​durante todo o procedimento. Resíduos de tecidos humanos é descartado após a autoclavagem a 121 ° C durante 20 minutos para a eliminação segura. Sharps (lâminas de bisturi) estão dispostos em um recipiente apropriado apropriado para contenção e eliminação segura. <ol><li> Pegue um pedaço de tecido humano congelado (cerca de 0,5 g no peso da região gânglios basais) e mediu-se rapidamente em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 mm 2) em gelo usando um pequeno petri-prato e uma lâmina de bisturi estéril. Use uma placa de petri separada e lâmina de bisturi para cada amostra. Recolhe-se o tecido moído num tubo de 15 ml e adicionar 10 volumes de tampão arrefecido com gelo 1XTBS ao tubo. </li><li> Homogeneizar as amostras utilizando um homogeneizador mecânico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Arrefecer em gelo durante 2 min. Repita este passo três vezess. Nota: Isso é feito de modo a que as amostras não são aquecidos durante a homogeneização. </li><li> Clarificar por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar pelete de material não homogeneizado. </li><li> Tome sobrenadante (homogeneizado bruto), adicione a tubos de centrífuga de policarbonato (tamanho do tubo depende do tamanho do rotor) e equilibrar cuidadosamente. Centrifugar a 100.000 xg durante 1 h a 4 ° C. </li><li> Reter sobrenadante como esta é a fracção solúvel em TBS. </li><li> Lave o peletizado duas vezes em cinco volumes de tampão 1X TBS e centrífuga cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. <ol><li> Ressuspender o sedimento final a pelota por sonicação durante 10 segundos a 20 KHz em cerca de 5 volumes de TBS 1X-SDS a RT. Nota: Antes da adição das amostras de tampão contendo SDS deve ser levado a 10 ° C para evitar a precipitação de SDS. </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min a 25 ° C. </li></ol></li><li> Reter sobrenadante como este é the SDS fracção solúvel. <ol><li> Lave o peletizado duas vezes em 5 volumes de tampão de TBS 1X-SDS a RT. Centrifugar cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 25 ° C. </li><li> Solubiliza-se o sedimento final em 50 ul de tampão TBS-1X SDS-ureia usando um sonicador ajustada a 20 KHz durante 10 segundos para atingir a solubilização completa; este é denominado a fracção solúvel em ureia. </li></ol></li><li> Dosear cada fracção para teor de proteína total utilizando um kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Diluir as amostras de TBS-SDS-ureia 1: 1 com tampão 1X TBS para permitir a compatibilidade com os reagentes de ensaio de proteína. Congelar as amostras em pequenas alíquotas (20 ul) a -80 ° C para reduzir os ciclos de congelamento e descongelamento. Nota: A adição de glicerol a 10% para as amostras é recomendado para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting de amostras e os resultados da análise <ol><li> Executar a partir de amostras de TBS, TBS-SDS e extratos TBS-SDS-uréia em 10 poços 4-12% de gel de poliacrilamida Tris-Biscom MOPS como tampão de corrida usando técnicas padrão. Veja Gallagher e Chakravarti (2008) 29 para um protocolo de western blot detalhado. </li><li> Carga de 10 ug de proteína de cada amostra em cada pista, juntamente com um marcador de peso molecular para TBS e SDS e as fracções de ureia. </li><li> Executar gel a 200 V durante 1 h ou até que o corante azul de tampão de carregamento atingiu o fundo do gel. </li><li> Proteínas a partir de geles de transferir electroforeticamente para membranas de nylon 28, pré-humedecido pela primeira vez em 100% de metanol e em seguida em tampão de transferência contendo 20% de metanol. Proporcionar uma marca de identificação no lado blot para determinar a proteína e a orientação dos marcadores de tamanho de peso molecular. <ol><li> Sandwich o gel com a membrana ao lado de papel de filtro húmido. A colocação correcta da membrana é crucial com a membrana entre o gel e o ânodo. Realize a transferência durante 2 horas a 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) tampão: dissolver 1 comprimido de PBS em 200 mlágua, para se obter 0,01 M tampão fosfato, 0,0027 M de cloreto de potássio e cloreto de sódio 0,137 M, pH 7,4. </li><li> Bloquear a membrana em solução de BSA a 5% em 1X PBS-T, durante 30 min com agitação a 70 rpm. Isto evita a ligação não específica do anticorpo primário para a membrana. </li></ol></li><li> Sondar a mancha de proteína com 6 ml de-α syn anticorpo primário SIN-1 (BD Biosciences; anticorpo monoclonal de ratinho) a 1: 750 de diluição (O / N a 4 ° C), seguido por uma série de lavagens com 1x PBS-T ( 3 x 5 min de cada vez) 28. </li><li> Incubar a mancha com o conjugado de HRP apropriado anticorpo secundário de 1: 2000 de diluição durante 30 min. Executar uma série de lavagens (3 x 5 min de cada vez) com 1X PBS-T. <ol><li> Imergir blots em solução melhorada quimioluminescência durante 15 segundos num quarto escuro. Borrões Cubra com um filme plástico e coloque filmes autoradiografia contra a mancha com o lado proteína-se em uma fita à prova de luz para capturar os sinais apropriados (bandas de tamanho adequado). </li><li> Desenvolver filmes auto-radiografia em um desenvolvedor automatizado. Nota: As manchas também pode ser desenvolvido manualmente utilizando revelador e do fixador de uma fonte comercial no caso de uma máquina automatizada programador não está disponível. </li></ol></li><li> Incubar a Western blot com 6 ml de tampão de extracção de western blot, durante 10 min com agitação constante para remover a mancha de sinal do anticorpo syn-α. Siga as etapas de 3,43 até 3.6.2 usando beta-actina anticorpo primário (mouse monoclonal) a 1: 8000 diluição. </li><li> Digitalizar e converter a imagem final em uma imagem TIFF e medir as densidades usando NIH ImageJ para fins de quantificação (um software de download gratuito). Nota: O software permite a leitura das densidades de área relativa de interesse (as bandas de tamanho adequado) e os dados podem ser expressos como uma razão de α-syn densidade / β-actina (um gene de manutenção da casa) como unidades arbitrárias ou sobre quando a sua própria casa mantendo um gene não é válido (como no caso de amostras solúveis em ureia). </li&gt; </ol>

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<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

O autor não tem nada a divulgar.

Este artigo descreve um protocolo de bioquímica para extração e análise das propriedades de solubilidade diferencial de monoméricos, oligoméricos e agregados α-syn de cérebros doentes usando desnaturação condições gel de funcionamento. Esta é uma técnica bem estabelecida para estudar agregada α syn-17, 18, ​​20, 21, uma proteína que é normalmente solúvel na sua forma nativa, mas obter propriedades de agregação amiloidogénicos ou aumentou com a progressão da doença ou com mutações genéticas. No entanto, alguns grupos usaram pequenas variações nas concentrações de SDS em respectivas memórias intermédias (8% ou 10%, em vez de 5%) 21,22, 30. O SDS é um detergente aniónico e solubiliza α-syn oligómeros que podem incluir formas de membrana ligada α-syn, enquanto a ureia, um reagente caotrópico desnatura as formas agregadas e fibrilares insolúveis ou amiloidogénicos de α-syn 20. A este respeito um estudo sistemático por Paleologou et al 31 examinaram a estabilidadee oligómeros de fibrilas com diferentes concentrações de ureia Syn-a- (6,5 - 8 M) ou SDS (0,25-2%) e relataram que concentrações de oligómeros estáveis ​​em SDS mas não com concentrações elevadas de ureia. A sua Fila-1 anticorpo, específico para oligómeros e fibrilas de Syn-ct detectadas concentrações mais elevadas de fibrilas em 6.5 M concentrações de ureia em condições não desnaturantes. As concentrações de tampão utilizado no presente protocolo espelha o que tem sido descrito em Culvenor et ai. (1999) 32. As regiões cerebrais anatômicas para a extração de bioquímica da insolúvel α-syn deve ser cuidadosamente selecionado e isso deve refletir carga LB e LN syn-α dependendo a progressão da doença 33,34. Os casos usados ​​aqui são amostras dos gânglios da base dos subtipos neocortical e límbicas do PD refletem estágios finais e intermediários de progressão PD de acordo com McKeith ctriteria 34. No cérebro Banco Queen Square, uma metade do cérebro érotineiramente fixados em formol para análise histoquímica e a outra metade é cuidadosamente dissecado em diferentes regiões anatômicas e flash congelados e armazenados em freezers -80 ° C durante mais bioquímica e estudos de análise de DNA / RNA. Após a fixação de formalina dos cérebros e dissecção por neuropathologists, imuno-histoquímica é realizada utilizando anticorpo α-syn e resultados arquivados. Além disso, como um procedimento de rotina, o pH do tecido do cérebro é medida na chegada como uma medida do estado agonal do tecido cerebral. Esta constitui uma base sólida para a qualidade da preservação de tecido para análise bioquímica. Os nossos dados apresentados mostram que há mais de SDS monómero solúvel α-syn em casos de DP comparação com os controlos; em particular os casos de PD neocortical tem maior carga α-syn comparados com a variedade PD límbico. Os casos neocorticais representar uma maior progressão da DP α-syn patologia nas regiões neocorticais tais como frontal e parietal CRcas 33,34. Os casos de DP límbicas têm maiores escores LB nas áreas frontais do cérebro basal / regiões límbicas tais como a amígdala, transentorrinal e as regiões do cíngulo. Para dados e análise estatística significativa, deve-se executar, pelo menos, 4 casos de cada coorte. Da mesma forma que não se tentou a análise estatística dos dados aqui apresentados blot. Deve também notar-se que os anticorpos podem reconhecer diferentes formas diferentes / composição de ordem superior ct-syn oligómeros e cada um pode ter a sua própria sensibilidade relativa e preferências. Isto é evidente a partir dos resultados de Tong et al. 29, onde eles mostram que 4 anticorpos syn-alfa diferentes (SIN-1, SS, Onco e LB509) dão resultados mutáveis, pelo menos, para sin-alfa oligômeros / agregados. Os monómeros α-SYN foram reconhecidos em graus semelhantes por todos os 4 anticorpos embora estes podem ter variações dependendo de se o epitopo do anticorpo syn-α está localizado quer na extremidade N-terminal ou C-terminal 29. Do mesmo modo, anticorpos específicos para fosfo-alfa sinucleína determinar o peso molecular elevado distinta α-sinucleína espécies 20,21. No protocolo aqui descrito, o anticorpo altamente caracterizado SIN-1 tem sido usada 19-21. No entanto, é importante considerar a validar qualquer novo anticorpo em transferências de Western com as experiências pré-absorção de anticorpos e também sobre-expressão e knockdown da proteína nas células. É importante considerar outras variações que foram aplicados pelos pesquisadores para determinar fragmentos menores de formas alfa-syn e instáveis ​​ou tetraméricas alfa-syn. Isto pode incluir fixação leve de membranas com 0,4% de PFA em PBS para manter as formas truncadas de α-syn 35 ou tratamento de homogenatos de exemplo com agentes de reticulação para estabilizar tetrâmeros 36. Avaliação bioquímica de proteínas precisas usando post-mortem tissue requer a minimização da degradação enzimática e modificação de proteínas. Por isso, é aconselhável a utilização de tecido com os menores atrasos post mortem e / ou selecionar amostras pareadas dentro das coortes de casos. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos para o padrão α-syn imunohistoquímica deve ser realizado antes de se iniciar o protocolo de isolamento. A extensão da patologia α-syn é altamente variável e pode variar de acordo com regiões seleccionadas. É aconselhável para selecionar regiões com patologia abundante como um controlo positivo para o rendimento ideal com cada corrida. O uso de inibidores de protease e inibidores de fosfatase, se necessário para prevenir a degradação enzimática indesejada após a libertação de proteases intracelulares ou fosfatases que ocorrem durante a lise celular e mantendo as amostras a 4 ° C é crucial. É importante que todas as amostras dentro do lote de experiências são tratadas de maneira uniforme e consistente para evitar as variações intra-utilizador; fre múltiplaciclos eze-descongelação deve ser evitada, pois esta pode retrair potencialmente modificações pós-translacionais, tais como a fosforilação. Um ponto crítico para ter em conta quando se analisa um grande número de amostras é que os dados de imunomanchas deve ser normalizada para uma amostra, o qual deve ser executado em paralelo com todas as outras amostras sobre os géis, e todos os dados de referência para aquela amostra. Isto é feito para assegurar a normalização dos dados entre várias manchas de imunotransferência. Este é o método adotado em nosso estudo recente 22. Deve notar-se que, a fim de manter o ECL de fundo baixo, as manchas não devem ser deixadas a secar fora em qualquer momento durante o protocolo de transferência de Western. Além disso, a exposição muito longas (&gt; 10 min) em filmes auto-radiografia deve ser evitado pois isso irá conduzir à saturação do sinal de ECL e conduzirá a quantificação imprecisa. Este protocolo acima é uma técnica relativamente simples, utilizando reagentes de laboratório comuns e emtrumentos e pode ser uma ferramenta valiosa para estudar a patofisiologia da proteína α-syn em investigação PD. Esta metodologia não só pode ser prorrogado com as modificações apropriadas para o estudo da biologia α-syn em animais transgênicos syn-alfa, mas também para outras doenças neurodegenerativas que caracterizam depósitos anormais de proteínas agregadas, como AD, MSA, DLB, HD e frontotemporaldementias. No entanto, os dados de transferência de Western aqui descrita poderia também ser validada utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática, utilizando anticorpos específicos para as formas de α-syn 31.

Uma das características patológicas comuns fundamentais entre várias doenças neurodegenerativas é a formação de agregados de proteínas anormais que ocorre numa proteína / doença modo específico 1. Assim, existem as características de placas de amilóide-beta e extraneuronais depósitos agregados tau hiperfosforiladas dentro de neurónios na doença de Alzheimer (AD); os depósitos syn-alfa agregados em Lewy Corpos (LBS), que são inclusões intraneuronais, e também no âmbito de processos distróficos neuronal chamado Lewy neurites (LNs) em PD, PD demência e demência com corpos de Lewy (DLBs) 2-4. Depósitos syn-alfa anormais também são vistas nas lesões da indicação de inclusões citoplasmáticas gliais em MSA 5. Na doença de Huntington, existem os depósitos de poli-Q característicos, e de ligação de ADN anormal Tar-43 e proteína fundidas em proteínas de sarcoma (FUS) são depositados na demência fronto-temporal. Importante para a DP, mutações no gene α-syn foram encontrados para cause autossômica dominante PD 11/06. Além disso, o gene triplicação α-syn 12 e 13 também causa a duplicação PD familiar ligando deste modo o aumento da expressão α-syn para os patomecanismos de PD. Notavelmente, casos de DP tanto esporádica e familiar abrigar depósitos anormais de α-syn patologia 14. Atuais tratamentos disponíveis para PD são apenas paliativos e não têm nenhum efeito sobre como travar ou atrasar a progressão da doença inexorável. α-syn é expressa abundantemente no cérebro humano e torna-se cerca de 1% da proteína total do cérebro. Ela está presente, mais especificamente, dentro dos neurônios, mas pode existir embora em quantidades menores dentro das células gliais. Um ponto controverso é a estrutura nativa de α-syn que pode existir como um monómero ou aleatória 15 como um tetrâmero dobrado 16. Durante a doença, α-syn muda a sua conformação que lhe permite obter misfolded e este processo é pensado para ser a causa da doença pathogenesis. Apesar de vários anos de investigações sobre os aspectos fisiopatológicos da α-syn e da doença, as causas exatas da doença mecanismos permaneceram indescritíveis 14. Estudos utilizando análise post-mortem dos cérebros de Parkinson têm até agora forneceu pistas importantes sobre a biologia normal e anormal de ambos em PD esporádica e também syn-α PD associado com mutações no gene LRRK2 17-22. Aqui, um protocolo de extracção bioquímica (ver esquema apresentado na Figura 1) para depósitos de syn-ct cada vez mais insolúveis no período de pós-mortem de tecido PD cérebro humano que abrigam agregados α-syn em diferentes graus tem sido descrita. Esta técnica também pode ser adaptada, com modificações em composições de tampão para estudar proteínas agregadas a partir de outras doenças neurodegenerativas 23,24 e também a partir de tecido cerebral animal transgénico 25-27. A principal consideração para as adaptações são as diferenças de solubilidade e os montantes totais das respectivas proteínas, algumas das quais são principalmente nuclear e pode precisar de buffers de elevado-sal para a extração ideal como mostrado para FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inibidores de protease&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>comprimidos inibidores de fosfatase&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Pastilhas salinas tamponadas com fosfato&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS buffer de execução</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE buffer de transferência</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&nbsp;</td><td>Papel</td><td></td> de filtro GE Healthcare RPN303F <td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris géis 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Supersignal West Pico Substrato quimioluminescente</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC kit de ensaio de proteína&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de policarbonato Beckman de parede espessa</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de remoção de Western blot</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 (monoclonal de camundongo)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primário beta-actina (monoclonal de camundongo&nbsp;</td><td>Anticorpo</td> secundário anti-camundongo de cabra cojugado Sigma <td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ modelo no&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga de bancada Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Jenke e Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de brains parkinsonianos

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alfa-sinucleína (α-syn) proteína é abundantemente expresso principalmente nos neurónios, e existe num número de formas diferentes - monómeros, oligómeros, tetrâmeros e fibrilas. Durante a doença, α-syn sofre alterações conf ormacionais para formar oligómeros e agregados de peso molecular elevado que tendem a tornar a proteína mais insolúvel. Anormalmente agregada α-syn é uma característica neuropatológica da doença de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Caracterização e análise de buffers usando Syn-ct insolúveis com o aumento da força do detergente e ultracentrifugação alta velocidade Biochemical proporciona uma ferramenta poderosa para determinar o desenvolvimento da patologia α-syn associada com a progressão da doença. Este protocolo descreve o isolamento de cada vez mais insolúveis / agregado α-syn partir de tecido de cérebro humano post-mortem. Esta metodologia pode ser adaptada, com modificações para estudos de α normal e anormalbiologia -syn em modelos animais transgénicos que albergam diferentes mutações Syn-ct, bem como em outras doenças neurodegenerativas que apresentam depósitos de proteínas fibrilares aberrantes relacionadas com as respectivas patologias.

TBS, SDS e as proteínas extraídas a partir de ureia solúvel em gânglios da base, seguindo o protocolo mostrado na Figura 1 foram corridas em géis e imunotransferidas com o SIN-1 monoclonal de murganho α-syn anticorpo primário. As fracções solúveis em TBS apresentada a presença de monomérico α-SYN (~ 14 espécies kDa) nos casos de DP e de controlo examinados (Figura 2A). As fracções solúveis em SDS mostrou também abundante monomérica α-syn em todos os três subtipos de casos estudados como exibido na baixa exposição blot (Figura 2C). Os casos de PD também apresentaram maiores espécies de peso molecular (MW) SYN-alfa como pode ser visto no alto blot exposição, que são susceptíveis de ser oligômeros (Figura 2C). As frações solúveis de uréia a partir de casos PD mostraram valores elevados de monómeros syn-a, oligômeros e espécies agregadas comparadas para controlar casos. Os casos DP idiopática neocortical demonstrar maior quantidade de AGGREG<html> espécies ated α-syn, enquanto os casos límbicas mostrar níveis intermediários de insolúvel α-syn. Ambos os SDS e uréia frações de casos DP idiopática demonstram níveis variáveis ​​de produtos syn-alfa truncadas em 12 kDa e 6 kDa, conforme descrito 20. Em contraste, os casos de controlo não mostraram qualquer α-syn insolúvel ou agregados (Figura 2E). Medidas semiquantitativos densidade de reflectir a quantidade de carga de LB como categoriesd usando α-syn imunohistoquímica demonstra a natureza do agregado insolúvel α-SYN (Figura 2B, 2D, 2F), em casos de DP neocorticais e límbicas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do α insolúvel procedimento de extração -syn.rPegue = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figura 2. immunoblots representativos de níveis -syn alfa de PD e controlar o tecido humano. TBS, SDS e as fracções solúveis de uréia a partir de gânglios basais (uma região que abriga α-syn patologia em casos PD) dos casos DP idiopática e neurologicamente normal (controle) cérebros foram analisados ​​para a presença de α-syn utilizando imunotransferência de Western. 10 ug de proteína foi carregada sobre cada pista. Em TBS fracções (A), monómeros principalmente α-syn estão presentes em todos os casos. Em SDS fracções (C), alguns oligómeros de α-syn são vistos juntamente com monómeros principalmente no tecido PD. Em frações de ureia (C), monômeros, oligômeros e agregados α-syn são variavelmente expressas no casos de DP reflecting respectiva carga LB. As amostras de controlo neurologicamente normais mostram a presença de apenas pequenas quantidades de monomérico α-syn. Por favor note possíveis produtos de degradação de α-syn são vistas em alguns dos casos, com elevada carga de LB. A ponta de seta sólida representa a forma monomérica da α-syn. O *, possivelmente, representa uma forma truncada no terminal C de α-syn como previamente descrito 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Caso </td><td> Sexo </td><td> idade em anos de morte </td><td> atraso post-mortem (hrs) </td><td> pH de tecido </td></tr><tr><td> Neocortical 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocortical 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35,3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Límbico 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Límbico 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Controlo 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Control 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32,5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. demografia limitada dos casos usados

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

O objetivo geral desta metodologia é extrair a alfa-sinucleína solúvel e insolúvel de cérebros de pacientes com Parkinson após a morte. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da doença de Parkinson. A principal vantagem desta técnica é que ela é relativamente simples e utiliza reagentes e instrumentos de laboratório comuns.Após preparar as soluções e os tampões necessários, comece colocando uma amostra de 0,5 gramas de tecido de gânglios basais congelado em uma pequena placa de Petri. Use uma lâmina de bisturi estéril para picar rapidamente em fragmentos quadrados de um milímetro. Recolha o tecido picado em um tubo de 15 mililitros e adicione 10 volumes de TBS 1X gelado ao tubo.Homogeneíze as amostras usando um homogeneizador mecânico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Em seguida, resfrie em gelo por dois minutos. Repita a homogeneização três vezes, resfriando em gelo a cada vez.Centrifugue o homogenato a 10.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante bruto do homogenato para tubos de centrífuga de policarbonato e centrifugue a 100.000 ×g por uma hora a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para tubos resfriados sobre gelo e mantenha esta fração solúvel em TBS.Lave com cinco volumes de tampão TBS 1X e centrifugue a 100.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, repita a lavagem.A lavagem cuidadosa dos pellets entre as etapas de ultracentrifugação é essencial para o sucesso deste procedimento. Após permitir que as amostras atinjam uma temperatura de 10 graus Celsius para evitar a precipitação de SDS, adicione cinco volumes de TBS-SDS 1X e re-suspenda o pellet final por meio de sonicação por 10 segundos a 20 quilohertz à temperatura ambiente. Realize ultracentrifugação a 100.000 ×g por 30 minutos a 25 graus Celsius.Após a ultracentrifugação, transfira o sobrenadante para tubos resfriados sobre gelo e retenha-o como a fração solúvel em SDS. Adicione cinco volumes do tampão TBS-SDS 1X à temperatura ambiente ao precipitado e centrifugue a 100.000 ×g por 15 minutos a 25 graus Celsius. Descarte o tampão de lavagem e repita a lavagem.Após descartar o sobrenadante, adicione 50 microlitros de TBS-SDS-Ureia 1X e solubilize utilizando um sonificador ajustado em 20 kilohertz por 10 segundos. Rotule esta amostra como fração solúvel em ureia. É essencial garantir completamente que todas as proteínas insolúveis sejam extraídas no procedimento.Dilua as amostras de TBS-SDS-Ureia em uma proporção de um para um com tampão TBS 1X para torná-las compatíveis com os reagentes do ensaio de proteína, e determine o teor total de proteína em cada fração utilizando um kit comercial de ensaio de proteína de acordo com o protocolo do fabricante. Aliquote as amostras em alíquotas de 20 microlitros com 10% de glicerol para reduzir ciclos futuros de congelamento-descongelamento, e armazene a menos 80 graus Celsius. Carregue 10 microlitros dos extratos TBS, TBS-SDS e TBS-SDS-Ureia juntamente com um marcador de peso molecular em gel de poliacrilamida Bis-Tris de quatro a 12 por cento com 10 poços, utilizando MOPS como tampão de corrida, empregando técnicas padrão.Execute o gel a 200 volts durante uma hora, ou até que a tinta azul do tampão de carga tenha alcançado a base do gel. Umedeça uma membrana de nylon em metanol a 100% e, em seguida, mergulhe no tampão de transferência contendo metanol a 20%. Faça uma marca identificadora na membrana para determinar o lado das proteínas e a orientação dos marcadores de peso molecular.Coloque o gel entre a membrana e papel filtro úmido. Realize a transferência por duas horas a 40 volts. Bloqueie com solução de BSA 5% em PBS-T 1X durante 30 minutos sob agitação a 70 rpm para evitar a ligação inespecífica do anticorpo primário à membrana.Processe o blot de proteína incubando com seis mililitros do anticorpo primário anti-alfa-sinucleína Syn-1, diluído na proporção de um para 750 em PBS-T, durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a membrana com PBS-T 1X três vezes, por cinco minutos cada vez. Em seguida, incube o blot com o anticorpo secundário conjugado à HRP, diluído na proporção de um para 2.000 em PBS-T, por 30 minutos.Lave a membrana como anteriormente com PBS-T 1X. Mergulhe os blot em solução de quimiluminescência amplificada de acordo com as instruções do fabricante em uma câmara escura. Cubra os blot com filme plástico aderente e capture o sinal utilizando autorradiografia.Após a aquisição de imagem, incubar o blot ocidental com seis mililitros de tampão de remoção para blot ocidental durante 10 minutos com agitação constante para remover o sinal do anticorpo contra alfa-sinucleína. Repetir o procedimento de blot ocidental para detectar a membrana com anticorpo primário contra beta-actina na diluição de um para 8.000. Digitalizar e converter a imagem final em um arquivo no formato Tiff e medir as densidades utilizando o software NIH ImageJ para fins de quantificação.As imagens a seguir são imunoblotagens representativas dos níveis de alfa-sinucleína em tecidos do gânglio basal humano de PD e controle. As frações solúveis em TBS, SDS e ureia foram analisadas quanto à presença de alfa-sinucleína por meio de imunoblot ocidental. Foram carregados 10 miligramas de proteína em cada poço.No fracionamento TBS, os monômeros da alfa-sinucleína estão presentes em todos os casos. O asterisco possivelmente representa uma forma da alfa-sinucleína truncada na extremidade C. No fracionamento SDS, alguns oligômeros da alfa-sinucleína são observados juntamente com os monômeros, indicados pela seta preenchida no tecido de DP.No fracionamento da ureia, monômeros, oligômeros e formas agregadas da alfa-sinucleína são expressos de forma variável nos casos de DP, refletindo a respectiva carga de corpos de Lewy. As amostras controle neurologicamente normais mostram a presença apenas de pequenas quantidades de alfa-sinucleína monomérica. Após dominar a técnica, a extração proteica pode ser realizada em um único dia de trabalho, seguida por imunoblotagem ocidental no dia seguinte, se for executada corretamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia dos corpos de Lewy explorarem espécies insolúveis e agregadas de alfa-sinucleína em tecido humano patológico e em modelos animais in vivo. Não se esqueça de que o trabalho com tecido humano não fixado exige medidas preventivas, e luvas e jalecos laboratoriais devem ser usados durante todos os procedimentos de manipulação.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um ensaio de imunofluorescência para detectar agregados de alfa-sinucleína específicos de doenças neurodegenerativas em seções de biópsia de pele. A imunocoloração flutuante é empregada para marcar fluorescentemente a hidrolase carboxi-terminal e os agregados de alfa-sinucleína nos neurônios dérmicos. Sob um microscópio confocal, as células com fluorescência de ambos os anticorpos indicam a presença de agregados de alfa-sinucleína nos neurônios dérmicos.

Um ensaio de imunofluorescência para detectar agregados de alfa-sinucleína em uma seção de biópsia de pele

Este vídeo demonstra o processo de quantificação do acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios de dopamina embrionários de camundongos pré-tratados com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína. Ele descreve as etapas para fixar, corar e quantificar os neurônios dopaminérgicos contendo agregados de alfa-sinucleína usando imunofluorescência.

Estudando o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios embrionários primários de dopamina de camundongo

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Detecção de α-sinucleína associada à doença por ELISA aprimorado no cérebro de camundongos transgênicos que superexpressam α-sinucleína com mutação A53T humana. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra o procedimento para detectar a proteína α-sinucleína associada a doenças neurodegenerativas no tecido cerebral de camundongos transgênicos usando ELISA. As etapas incluem homogeneização tecidual, centrifugação e detecção ELISA da proteína α-sinucleína para...

Detecção de proteína associada a doenças neurodegenerativas α-sinucleína usando ELISA

Usando microscopia de força atômica em combinação com a tecnologia de biopanning, criamos um sistema de biopanning negativo e positivo para adquirir anticorpos contra variantes proteicas específicas da doença presentes em qualquer material biológico, mesmo em baixas concentrações.  Obtivemos sucesso na obtenção de anticorpos para variantes da proteína TDP-43 envolvidas na Esclerose Lateral Amiotrófica.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Um ELISA que oferece uma nova abordagem quantitativa é descrito. Ele detecta especificamente a α-sinucleína associada à doença (αSD) em um modelo de camundongo transgênico (M83) de sinucleinopatia usando vários anticorpos contra a forma fosforilada de αS na Ser129 ou a parte C-terminal da proteína.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

O objetivo deste artigo é delinear as etapas necessárias para a geração de fibrilas de alfa-synucleina monomérica, controle de qualidade subsequente e uso das fibrilas pré-formadas in vivo.

Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Este trabalho analisa a dose vetorial e o tempo de exposição necessários para induzir neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor neste modelo pré-clínico da doença de Parkinson. Esses vetores que codificam a α-sinucleína humana são entregues na substantia nigra para recapitular a patologia da sinucleína associada à doença de Parkinson.

Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

O presente protocolo descreve um método para administração intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método fornece informações sobre a propagação da α-sinucleína da mucosa olfatória para o bulbo olfatório na doença de Parkinson.

Técnica para administração intranasal de agregados de α-sinucleína

Aprenda a extrair alfa-sinucleína solúvel e insolúvel de cérebros parkinsonianos pós-morte usando ultracentrifugação e western blot. Este método permite analisar agregados proteicos em tecido humano patológico.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

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