Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

O objetivo geral desta metodologia é extrair alfa-sinucleína solúvel e insolúvel de cérebros parkinsonianos post-mortem. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo da doença de Parkinson. A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica relativamente simples, usando reagentes e instrumentos de laboratório comuns.

Depois de preparar as soluções e tampões necessários, comece colocando uma amostra de 0,5 grama de tecido dos gânglios da base congelado em uma pequena placa de Petri. Use uma lâmina de bisturi estéril para picar rapidamente em fragmentos quadrados de um milímetro. Colete o tecido picado em um tubo de 15 mililitros e adicione 10 volumes de gelado, 1X TBS ao tubo.

Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador mecânico a 20.000 rpm por 10 segundos. Em seguida, deixe esfriar no gelo por dois minutos. Repita a homogeneização três vezes, resfriando no gelo a cada vez.

Centrifugar o homogenato a 10 000 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante homogeneizado bruto para tubos de centrifugação de policarbonato e centrifugar a 100 000 gs durante uma hora a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para tubos arrefecidos com gelo e retê-lo como fracção solúvel TBS.

Lave em cinco volumes de tampão 1X TBS e centrifugue a 100.000 gs por 15 minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, repita a lavagem.

A lavagem completa dos pellets entre as etapas de ultracentrifugação é fundamental para o sucesso deste procedimento. Depois de permitir que as amostras atinjam uma temperatura de 10 graus Celsius para evitar a precipitação de SDS, adicione cinco volumes de 1X TBS-SDS e ressuspenda o pellet final sonicando por 10 segundos a 20 kilohertz em temperatura ambiente. Ultracentrífuga a 100.000 gs por 30 minutos a 25 graus Celsius.

Após a ultracentrifugação, transferir o sobrenadante para tubos arrefecidos com gelo e retê-lo como fracção solúvel SDS. Adicione cinco volumes de tampão 1X TBS-SDS à temperatura ambiente ao pellet e centrifugue a 100.000 gs por 15 minutos a 25 graus Celsius. Descarte o tampão de lavagem e repita a lavagem.

Depois de descartar o sobrenadante, adicione 50 microlitros de 1X TBS-SDS-Ureia e solubilize usando um sonicador ajustado em 20 kilohertz por 10 segundos. Rotule esta amostra como a fração solúvel em ureia. É essencial garantir que todas as proteínas insolúveis sejam extraídas no procedimento.

Dilua as amostras de TBS-SDS-Ureia uma a uma com tampão 1X TBS para permitir a compatibilidade com reagentes de ensaio de proteína e analise cada fração quanto ao teor total de proteína usando um kit de ensaio de proteína comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Amostras de alíquota em alíquotas de 20 microlitros com 10% de glicerol para reduzir futuros ciclos de congelamento e descongelamento e armazene a 80 graus Celsius negativos. Carregue 10 microlitros dos extratos TBS, TBS-SDS e TBS-SDS-Ureia em um marcador de peso molecular em gel de poliacrilamida Bis-Tris de 10 poços, quatro a 12 por cento com MOPS como tampão de corrida usando técnicas padrão.

Execute o gel a 200 volts por uma hora ou até que o corante azul do tampão de carregamento atinja o fundo do gel. Molhe uma membrana de náilon em 100% de metanol e, em seguida, mergulhe em tampão de transferência contendo 20% de metanol. Faça uma marca de identificação na mancha para determinar o lado da proteína e a orientação dos marcadores de tamanho de peso molecular.

Coloque o gel com a membrana ao lado do papel de filtro úmido. Execute a transferência por duas horas a 40 volts. Bloqueie a solução de 5% BSA em 1X PBS-T por 30 minutos com agitação a 70 rpm para evitar a ligação não específica do anticorpo primário à membrana.

Sonde o blot de proteína incubando com seis mililitros do anticorpo primário de alfa-sinucleína Syn-1 diluído um a 750 em PBS-T durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a membrana com 1X PBS-T três vezes por cinco minutos de cada vez. Em seguida, incubar o blot com o anticorpo secundário conjugado HRP apropriado diluído de um a 2.000 em PBS-T por 30 minutos.

Lave a membrana como antes com 1X PBS-T. Mergulhe os borrões em solução de quimioluminescência aprimorada de acordo com as instruções do fabricante em uma sala escura. Cubra as manchas com filme plástico e capture o sinal usando autorradiografia.

Após a imagem, incube o western blot com seis mililitros de tampão de remoção de western blot por 10 minutos com agitação constante para retirar o sinal do anticorpo alfa-sinucleína. Repita o procedimento de western blot para sondar a membrana com anticorpo primário beta-actina em uma diluição de um a 8.000. Digitalize e converta a imagem final em uma imagem Tiff e meça as densidades usando o NIH ImageJ para fins de quantificação.

As imagens a seguir são imunomanchas representativas dos níveis de alfa-sinucleína da DP e controlam o tecido dos gânglios da base humana. As frações solúveis de TBS, SDS e ureia foram analisadas quanto à presença de alfa-sinucleína usando imunoblot ocidental. 10 miligramas de proteína foram carregados em cada pista.

Na fração TBS, os monômeros de alfa-sinucleína estão presentes em todos os casos. O asterisco possivelmente representa uma forma truncada C-terminalmente de alfa-sinucleína. Na fração SDS, alguns oligômeros de alfa-sinucleína são vistos junto com monômeros, indicados pela ponta de seta sólida no tecido da DP.

Na fração ureia, monômeros, oligômeros e alfa-sinucleína agregada são expressos de forma variável nos casos de DP, refletindo suas respectivas cargas corporais de Lewy. As amostras de controle neurologicamente normais mostram a presença de apenas pequenas quantidades de alfa-sinucleína monomérica. Uma vez dominada, essa técnica de extração de proteínas pode ser feita em um dia útil, seguida de imunotransferência ocidental no dia seguinte, se for realizada corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de corpos de Lewy explorarem espécies de alfa-sinucleína insolúveis e agregadas em tecidos humanos patológicos e em modelos animais in vivo. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano não fixado requer medidas de precaução, e luvas e jalecos de laboratório devem ser usados em todos os procedimentos de manuseio.