Name: Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprenda o ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para identificar interações proteína-DNA em Arabidopsis in vivo. Este método permite estudar a regulação gênica em plantas.

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Os autores gostariam de agradecer à The Plant Cell por permitir o uso de alguns dados publicados nesta revista para elaborar os resultados representativos descritos aqui na Figura 4. Este trabalho foi apoiado pela Rede de Formação Inicial Marie Curie da UE 7FP EpiTRAITS (Acordo de Subvenção 316965) e pelo Ministério de Economia e Competitividade espanhol (bolsas BIO2010-15589 e BIO2013-43098-R).

1. A reticulação do material vegetal (1 hr) <ol><li> Crescer as linhas de Arabidopsis utilizados no experimento (tipo selvagem - WT - contra os mutantes, e / ou linhas que expressam a versão marcado de sua proteína de interesse em relação linhas expressam o tag não fundida a qualquer proteína) durante 12-18 dias em grandes placas de Petri (150 mm) com meio MS-ágar (1 L: 1x Murashige &amp; Skoog, 10 g de sacarose, 0,5 g de MES, pH 5,7 (KOH), 1% de agar). Alternativamente, cultivar plantas em vasos contendo 3: 1 mistura de solo e vermiculita. CUIDADO! O formaldeído é tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão, e deve ser tratado em uma capa química uso de equipamento de protecção individual adequado. Passos 1,2-1,6 deve ser realizada sob a coifa. </li><li> Adicione pequenos buracos na tampa dos tubos de 50 ml com uma agulha aquecida pelo queimador, de laboratório. Adicionar 40 ml de PBS 1x tampão e 1,08 ml de formaldeído até uma concentração final de 1% (Estoque 37% solution). Recolha de 1,5 g de material vegetal em esses tubos de 50 ml. Manter os tubos em gelo durante reticulação. </li><li> Feche os tubos de 50 ml com tampa. Colocar os tubos em um exsicador e aplicar vácuo. Aspirador de infiltrar o tecido durante 10 min, em seguida, libertar o vácuo com cuidado, para evitar-se agitando a solução. Misturar a amostra. Repita duas vezes. Após a infiltração, observar o material de planta e confirmar que se torna ligeiramente translúcido e tendem a afundar para o fundo do tubo (Figura 2). </li><li> Adicionar 2,5 ml de 2 M de glicina para atingir uma concentração final de 0,125 M. Aplicar vácuo durante 5 minutos. A glicina actua como um inibidor competitivo da reticulação de formaldeído. </li><li> Descartar a solução de formaldeído-glicina PBS invertendo o tubo fechado 50 ml com buracos na tampa. </li><li> Lavar as plântulas duas vezes com 1x PBS e uma vez com água descartando a solução de lavagem como descrito na etapa 1.5. Seque-os sobre uma toalha de papel e congelar em nitroge líquidon. NOTA: tecido congelado pode ser mantida a -80 ° C durante semanas. </li></ol> 2. Preparação dos anticorpos (1 dia) NOTA: Para a imunoprecipitação, recomenda-se a utilização de contas magnéticas conjugadas com anticorpos através de uma proteína G ou proteína A de ligação com elevada afinidade para o domínio constante da cadeia pesada de anticorpo. Os complexos DNA-proteína pode anexar inespecificamente à superfície dos grânulos de conjugados de anticorpos. Por essa razão, é necessário realizar os controlos sem anticorpos específicos para quantificar o fundo de ligação não-específica. <ol><li> Para cada imunoprecipitação, preparar 15 uL de pérolas magnéticas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A quantidade de pérolas depende da quantidade da cromatina utilizados para imunoprecipitação e também sobre os anticorpos. </li><li> Para lavar, adicionar 1 ml de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tampão de diluição às esferas, misture por rotação e coloque a 1,5 ml de microcentrífuga tuestar numa cremalheira magnética. Espere cerca de 1 min para deixar as contas anexar ao ímã. Com os 1,5 ml microtubos ainda no rack, remova o sobrenadante por pipetagem. Repita duas vezes. NOTA: Para cada linha de plantas dois conjuntos de imunoprecipitação são necessários: um com as contas e anticorpo (Ab) e um segundo sem anticorpo (No-Ab) controle com apenas esferas magnéticas. </li><li> Ressuspender as pérolas em 200 ul de tampão de diluição de chip. Adicionar a quantidade necessária de Ab específico para um dos dois tubos preparados para cada linha de planta (a diluição exacta difere para cada Ab e tem de ser optimizada experimentalmente ou, no caso de anticorpos comerciais, siga as instruções do fabricante). Utilize essa amostra para imunoprecipitação. Adicionar a mesma quantidade de IgG inespecífica ao outro tubo, o qual será utilizado como controlo negativo. </li><li> Incubar O / N numa roda rotativa, a 4 ° C para permitir que o anticorpo atribuem aos grânulos. </li></ol> 3. Extracção da cromatina (4 h) </p&gt; <ol><li> Moer exaustivamente o material vegetal congelado em nitrogênio líquido usando almofariz e pilão até que o pó se torna verde homogêneo e leve. Transferir o pó para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Para obter as etapas 3.2 - 3.6, o trabalho sob a coifa. Adicionar 30 ml de tampão de extracção 1 (ExB 1), e misture bem para absorver o pó de tecido. A partir deste passo em diante, manter as amostras a 4 ° C em todos os momentos. Tecido congelado e sobras de nitrogênio líquido fará com que o buffer para congelar. Certifique-se de descongelar o tecido congelado completamente, invertendo os tubos de 4-5 vezes a cada 2 min. </li><li> Limpar a pasta fazendo-a passar através de um tecido de filtração com tamanho de poro de 22-25 uM para um novo tubo de 50 ml e centrifugar a 1000 xg lo durante 20 min a 4 ° C. NOTA: Neste passo, os núcleos e todos os organelos irá sedimentar. ExB 1 contém sacarose suficiente para proporcionar uma elevada densidade e impedir a ruptura da estrutura do organelo. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação. Neste STAge, observar uma bolinha verde de cerca de 2 ml. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de ExB 2. Ressuspender o sedimento será difícil neste ponto. Centrifugar a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: ExB 2 contém 1% de Triton X-100 para ajudar a romper os cloroplastos aberto e remova clorofila. </li><li> Ressuspender o sedimento em 300 ul de Tampão de Extracção 3 (ExB 3). </li><li> Em um tubo de microcentrífuga limpo, adicione 600 mL de ExB 3. Pegue o sedimento ressuspenso a partir do passo 3.6 e cuidadosamente mergulhá-la no topo do limpa ExB 3. </li><li> Rotação durante 1 h a 16000 xg, a 4 ° C. NOTA: Este passo ajuda a remover o detergente a partir da amostra. </li><li> Remover o sobrenadante por aspiração com uma pipeta. Ressuspender o sedimento nuclear em 300 ul de tampão de sonicação lentamente por pipetagem para cima e para baixo para evitar a formação de bolhas, o que pode afectar a eficiência sonicação. Pipeta com cuidado toda a suspensão para fora e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. NOTA: Estetampão contém SDS, para lisar os núcleos e libertar a cromatina. </li><li> Sonicar a suspensão para lisar os núcleos e aleatoriamente cisalhamento a cromatina em pequenos fragmentos. Use condições sonication que prestam cromatina enriquecido em fragmentos entre 200-800 pb (20-30 ciclos com as configurações de 30 segundos ON / OFF 30 seg a 4 ° C para o dispositivo disponível descrito na Tabela de materiais / reagentes de ultra-sons). Verifique a eficiência de ultra-sons por separação electroforética dos fragmentos de ADN obtidos num gel de agarose de 13, 2 ul de carregamento sonicada cromatina (Figura 3). CUIDADO! Certifique-se de usar equipamento de proteção durante a etapa de ultra-sons no caso de o dispositivo de ultra-som não está contido em um armário à prova de som. Passo crucial! A fragmentação da cromatina depende em grande parte do equipamento de sonicação. As condições de sonicação deve ser ajustado para alcançar enriquecimento nos tamanhos de ADN apropriadas. VejoFigura 3 para um exemplo de como optimizar a fragmentação da cromatina. </li><li> Girar a solução uma vez a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante por pipetagem a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. Descarte o sedimento. Aqui 1/10 do sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, marcá-lo como entrada e congelamento a -20 ° C. </li><li> Dilui-se a cromatina 10x com tamp de diluio para diluir ChIP SDS a uma concentração final de 0,1%. Nota: As amostras podem ser congeladas e armazenadas a -20 ° C durante várias semanas. </li></ol> 4. A imunoprecipitação da proteína de interesse e Salvamento de ADN (1 dia, 3 h) <ol><li> Lavam-se as contas revestidas com o Ab a partir do passo 2.4 três vezes com 1 ml de tampão de diluição de chip para remover o excesso de anticorpo, tal como descrito na etapa 2.2. Ressuspender em 200 ul de tampão de diluição de chip. Adicionar 50 ul de isolado da cromatina. Incubar O / N numa roda rotativa, a 4 ° C. Nota: Verifique o concentratina da cromatina em microvolume UV-Vis. 50 ul de isolado de cromatina deve conter mais do que 10 ug de ADN. </li><li> Para obter as etapas de trabalho 4,2-4,5 em 4 ° C. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem de baixo de sal como descrito no passo 2.2. </li><li> Lave as contas uma vez em 1 ml de tampão de lavagem de alta sal. </li><li> Lave as contas uma vez em 1 ml de tampão de lavagem de LiCl. </li><li> Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão TE. Após a última lavagem, certifique-se de remover totalmente o tampão TE deixado no tubo por aspiração com uma pipeta. </li><li> Retire as amostras de entrada (passo 3.9). Transferência de 5 ul da entrada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e continuar como com as amostras de aparas. Inverta a reticulação por adição de 200 ul de resina de permuta iónica quelante 5%, e incubar durante 10 min a 95 ° C, agitando a cada 2-3 minutos. Girar a 16.000 xg durante 30 seg e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga por pipetagem. NOTA: Enquanto o tranal método para a reticulação envolve a reversão de uma incubação de S / N com NaCl, a incubação com uma resina quelante de iões a 95 ° C permite a decrosslinking eficiente e eluição de ADN em 10 min, portanto, fazendo com que o protocolo de um dia curto. </li><li> Adicionar 2 mL de proteinase K (10 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante 30 min para digerir proteínas e libertar o ADN. </li><li> Parar a reacção por incubação a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Rapidamente girar a 16.000 xg durante 30 seg e transferir o sobrenadante para um novo tubo por pipetagem. </li><li> Limpar o ADN isolado utilizando um kit de purificação de fragmentos de ADN padrão. NOTA: Proceda de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Transferir a coluna de ligação ao ADN a partir do kit para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Elui-se o ADN purificado por meio de adição de 20 ul de água isenta de ADNase para o centro da coluna e centrifugação a 16.000 xg durante 60 seg. Pare ponto: As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante várias semanas. </li></ol&gt; 5. Medição Abundância de Sítios de Ligação do DNA imunoprecipitada por qPCR (4 horas) NOTA: O DNA isolado a partir da cromatina precipitado tem que ser analisados ​​para determinar quais os fragmentos de ADN ter sido ChIP-Ed do total de cromatina, devido à sua ligação à proteína de interesse. <ol><li> Iniciadores do projeto para as regiões genômicas de interesse com uma temperatura de fusão (Tm) de 60 ° C e um teor de GC de 30% -80%. Como cromatina é fragmentado por ultra-sons, o comprimento da sequência amplificada não deve ser mais longo do que os nucleótidos 150-200 (Tabela 1). NOTA: Uma ferramenta útil para desenho de primers é o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Directrizes adicionais para o projeto cartilha estão disponíveis em relatórios anteriores 8, 14,15. </li><li> Use um programa BLAST para se certificar de que os iniciadores são específicos (especialmente promotores podem compartilhar sequências de ligação TF similar) e testar a eficiência usin cartilhag diluições 1:10 em água o ADN de entrada (passo 4.9). Certas regiões do genoma será purificado melhor do que outros. É, portanto, importante para conceber iniciadores de PCR e verificá-los sobre o ADN de entrada diluída. </li><li> Dilui-se o ADN purificado a 1:10 com água e Pipetar 5 ul de ADN diluído em um tubo de PCR de cada reacção. NOTA: Diluir apenas a quantidade necessária, como o DNA pode anexar às paredes dos tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento aumentar o número de moléculas de DNA ligados. Para cada par de primers, amplificação na entrada, Ab-chip e No-Ab chip tem de ser analisada. </li><li> Para completar a mistura de PCR, adicionar SYBR Green PCR master mix para uma concentração final de 1x, e 0,5 uM de cada iniciador. Encha até 20 l com água livre de DNase. </li><li> Realizar a reacção qPCR seguindo as instruções do fabricante master mix SYBR Green PCR. </li></ol> Análise 6. Dados NOTA: Entre os exno existentes formas de analisar os dados dos chips, dois são mais comumente usados. O primeiro deles é o método de enriquecimento de dobra, também denominada como &quot;enriquecimento relativo&quot;, &quot;sinal sobre o fundo&quot; ou &quot;em relação ao controlo sem anticorpo. O segundo método é nomeado como &quot;% de entrada&quot;. <ol><li> A análise dos dados por um método de enriquecimento de dobra. <ol><li> Crie uma planilha com amostras nomes e valores Ct matérias que tenham sido obtidas após reação qPCR. </li><li> Para cada amostra, a partir de subtrair o seu valor de Ct em bruto o valor Ct em bruto obtido para o controlo n-Ab correspondente. NOTA: Após esta operação matemática, o valor de Ct para a amostra No-Ab será igual a 0. </li><li> Calcule o enriquecimento vezes por operação de exponenciação com base 2 e expoente (poder) igual ao restante negativa obtida na etapa 6.1.2 (Tabela 2). enriquecimento vezes = 2 - (Ct (amostra) - Ct (No-Ab)) NOTA: Neste metod a abundância de um fragmento de ADN específico na amostra ChIP-ED é comparada com a abundância deste fragmento no controlo n-Ab. A suposição de que este método é o nível de sinal de fundo é reprodutível entre diferentes conjuntos de iniciadores, amostras, e replicar experiências. No entanto, esta níveis de sinal&#39;noise&#39; variam entre conjuntos de iniciadores, exemplos e experiências. </li></ol></li><li> A análise dos dados pelos% do método de entrada. <ol><li> Crie uma planilha com amostras nomes e valores Ct matérias que têm sido obtidos por eles após a reação qPCR. </li><li> Ajustar valores Ct-primas para amostras de entrada por subtracção de um valor de base de logaritmo de 2 a partir da fracção de cromatina total extraído que foi tomado como uma entrada. NOTA: Neste protocolo o valor subtraído é igual a 3,32, como 10% do total de cromatina foi tomada como uma entrada neste protocolo. Log 2 (10) é igual a 3,32. </li><li> Calcular% de entrada multiplicando por 100 o valor da operação de exponenciação com base 2 e expoente (potência) igual ao restante de valores de entrada a partir dos valores ajustados subtraídos matérias-Ct da amostra (Tabela 3). % De entrada = 100 * 2 (input ajustado - Ct (amostra)) NOTA: Com este procedimento, a relação entre a abundância de ADN específica na amostra ChIP-ed ao total isolado da cromatina (amostra de entrada) é calculado. Mais detalhes sobre a análise de dados do chip pode ser encontrado em Haring et ai. 8. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui descrito ChIP é uma técnica poderosa e reprodutível para analisar interacções entre proteínas e sequências específicas de ADN in vivo em plantas de Arabidopsis. A identificação bem sucedida de sítios de ligação para as proteínas de interesse requer uma seleção adequada de órgãos vegetais ou estágios de desenvolvimento, onde as interações relevantes estão realmente ocorrendo. Além disso, é essencial para se obter uma fixação adequada do material de planta e um corte óptimo da cromatina por sonic...

Nos últimos anos, uma grande variedade de ferramentas genéticas, moleculares e genómicos foram desenvolvidos na Arabidopsis thaliana espécies modelo. Esta tecnologia tem facilitado enormemente o progresso na compreensão de como o desenvolvimento das plantas é regulamentada. Entre os processos de desenvolvimento de Arabidopsis utilizando estudadas como um modelo, o controlo genético do período de floração foi extensivamente analisado. Estes estudos têm mostrado que as plantas modular muito precisamente a época da floração em resposta a estímulos endógenos, tais como hormônios e da idade da planta, e também aos sinais ambientais, tais como fotoperíodo e temperatura que sincronizar o tempo de floração com o ciclo natural das estações 1, 2. O isolamento e caracterização de mutantes de Arabidopsis com alterações no tempo de floração tem sido determinante em revelar uma complexa rede de genes que regulam o tempo de floração em resposta a fatores endógenos e ambientais. Estes circuitos são genéticosintegrado no nível de alguns genes mestre que actuam como interruptores de floração, e o momento exacto do início floral depende do equilíbrio da floração promover e reprimir actividades que funcionam a montante dos genes integrador florais 1,3. A caracterização funcional dos genes identificados pelo seu papel no controlo de início de floração, auxiliado pelo uso recente de abordagens genómicas, revelaram o papel central de regulação de transcrição na modulação do período de floração. Na verdade, muitos dos genes codificam mestre de floração fatores de transcrição 4. Além disso, um certo número de complexos de proteína de remodelação da cromatina influenciar a expressão de genes mestres de floração. Uma série de mutantes de Arabidopsis os isolados por seu tempo de floração alterado acabou por portadores de mutações em genes que codificam uma variedade de modificadores de cromatina. Diferentes empresas de reestruturação de cromatina que introduzem modificações pós-translacionais em Histone caudas, reposicionar nucleosomes relativos ao DNA ou trocar histonas canônicos por variantes de histonas são necessárias para a regulação da floração em Arabidopsis 5,6. Algumas destas actividades remodelação da cromatina catalisar a deposição ou a remoção de modificações covalentes, tais como a metilação ou acetilação de histonas em resíduos específicos. Estas marcas das histonas são especificamente reconhecidos pelos efectores especializados que recrutam outros complexos de remodelação da cromatina, factores de transcrição ou de componentes da maquinaria transcricional para regular a actividade transcricional de genes de floração. Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP) permite a identificação de locais in vivo de proteínas de interesse de ligação de ADN (Figura 1). Este procedimento tira vantagem da capacidade de certos produtos químicos para reticular as proteínas para o ADN. Os complexos ADN-proteína resultante pode ser então imunoprecipitadas utilizando anticorpos específicos AGAfactores de transcrição inst, proteínas de ligação de cromatina, ou modificações particulares e epítopos heterólogos (vulgarmente referidos como &quot;etiquetas&quot;) ligados à proteína de escolha. O ADN purificado a partir de imunoprecipitados destes pode ser utilizado como um molde em PCR (qPCR) para avaliar as reacções quantitativos para o enriquecimento de sequências particulares de interesse. Deste modo, os sítios de ligação de factores de transcrição ou a distribuição de sinais de histonas em genes particulares pode ser estabelecido 7,8. Além disso, combinado com Next Generation Sequencing (NGS) que permite enorme sequenciamento paralelo, a tecnologia de chip tornou possível a identificação de todo o genoma dos sítios de ligação de fatores de transcrição, bem como paisagens epigenômicos inauguração de modificações de histonas. Além disso, a análise simultânea da expressão de genes permite a monitorização como a ligação dos reguladores da transcrição ou a deposição de marcas particulares histona correlaciona com a transcrição activity 9 de genes. O uso de protocolos chip no Arabidopsis permitiu avaliar o impacto que uma variedade de reguladores de transcrição têm sobre a organização da cromatina de genes mestres da floração e como essas mudanças estruturais influenciar a expressão do gene 5,6. Resultados anteriores mostraram que a Arabidopsis lócus florescimento precoce em suma DIAS (EBS) atua como um repressor da floração e mutantes neste show gene uma aceleração da floração e da sobre-regulação do gene mestre do FT floração. Além disso, a perda de função mutações no FT suprimir totalmente o fenótipo de floração precoce das plantas EBS mutantes, indicando que FT é necessário para a floração precoce de mutantes de EBS e que a EBS é necessária para a repressão de este gene mestre de floração 10 , 11. EBS codifica uma proteína contendo PHD que se pode ligar especificamente histona H3 trimetilada em di- e the 4 resíduo lisina (H3K4me2 / 3), sugerindo um papel para EBS na repressão mediada por cromatina de FT 12. A utilização da abordagem ChIP demonstrou que a Arabidopsis contendo PHD proteína EBS 10,11 liga regiões reguladoras do gene FT integrador floral para reprimir a sua expressão 12. Os dados adicionais obtidos através do uso de tecnologia de chip mostrou que esta proteína é necessária para manter baixos níveis de acetilação da histona, uma característica da transcrição activa, na cromatina deste gene mestre de floração durante as fases iniciais de desenvolvimento da Arabidopsis. Estas observações, em conjunto com dados de expressão genética do gene e, demonstram que este Arabidopsis PHD contendo a proteína tem um papel central na regulação fina da época de floração através da modulação da expressão do gene integrador floral FT 12. O trabalho aqui apresentado fornece um método optimizado útil não só para a análise das histonas, mas também para a outracromatina proteínas associadas, e com o aumento da eficiência e redução do tempo experimental. Além disso, este relatório ilustra como o uso de protocolos de chip tem fornecido novos insights sobre a relação entre as mudanças em modificações da cromatina e estados de transcrição de genes de plantas, e como esses mecanismos mediados por cromatina de impacto controle da expressão gênica no início do florescimento em Arabidopsis.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Mistura de Sal Basal Murashige e Skoog)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Uso sob a capela de exaustão</td></tr><tr><td>Mistura de inibidores de protease cOmplete ULTRA Comprimidos, Mini, sem EDTA, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Dispositivo de sonicação padrão</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr> <tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos Dynabeads acoplados à proteína A ou proteína G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Verifique o fabricante' s manual para afinidade de anticorpos</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergente Solution</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr><tr><td>(mouse, rato, coelho&hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic rack - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac anticorpo policlonal - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag Anticorpo, clone 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de arabidopsis interações proteína-adn<em&gt; in vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Redes reguladoras de genes intrincadas orquestram processos biológicos e transições de desenvolvimento em plantas. A ativação transcricional seletiva e o silenciamento de genes medeiam a resposta das plantas a sinais ambientais e pistas de desenvolvimento. Portanto, insights sobre os mecanismos que controlam a expressão gênica das plantas são essenciais para obter uma compreensão profunda de como os processos biológicos são regulados nas plantas. A técnica de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) descrita aqui é um procedimento para identificar os sítios de ligação ao DNA de proteínas em genes ou regiões genômicas da espécie modelo Arabidopsis thaliana. As interações com o DNA de proteínas de interesse, como fatores de transcrição, proteínas da cromatina ou versões pós-traducionalmente modificadas de histonas, podem ser analisadas de forma eficiente com o protocolo ChIP. Este método baseia-se na fixação de interações proteína-DNA in vivo, fragmentação aleatória da cromatina, imunoprecipitação de complexos proteína-DNA com anticorpos específicos e quantificação do DNA associado à proteína de interesse por técnicas de PCR. O uso dessa metodologia em Arabidopsis tem contribuído significativamente para desvendar mecanismos regulatórios transcricionais que controlam uma variedade de processos biológicos vegetais. Essa abordagem permitiu a identificação dos sítios de ligação da proteína EBS da cromatina de Arabidopsis a regiões regulatórias do gene mestre do TF de floração. O impacto dessa proteína no acúmulo de marcas de histonas específicas na região genômica do FT também foi revelado por meio da análise de ChIP.

Oito etapas principais podem ser apontados neste protocolo chip para a identificação de in vivo as interações proteína-ADN, incluindo cultivo e colheita de material vegetal, cross-linking da cromatina, o isolamento da cromatina, fragmentação da cromatina, isolamento selectivo dos complexos entre DNA e a proteína de interesse por imunoprecipitação, a digestão de proteínas, purificação de DNA, análise e qPCR (Figura 1). Um passo essencial no protocolo de chip é a fixação das interacções ADN-prote...

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

O objetivo geral deste procedimento é revelar as interações entre proteínas e DNA na cromatina de células de arabidopsis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia vegetal, como quais genes são regulados por um determinado fator de transcrição ou quais modificações no sistema estão associadas ao estado transcricional dos genes. A principal vantagem desta técnica é que, por meio da etapa de reticulação, é possível fixar e capturar alterações na organização da cromatina que ocorrem durante o desenvolvimento da planta.Embora este método possa fornecer uma perspectiva sobre a interação proteica em Arabidopsis thaliana, ele também pode ser aplicado a diferentes ordens de plantas e adaptado a outras espécies vegetais. Demonstrarão este procedimento Dorota Komar e Alfonso Mouriz, dois estudantes de doutorado em nosso laboratório. Após cultivar Arabidopsis de acordo com o protocolo descrito, colete 1,5 gramas de material vegetal em tubos de 50 mililitros e mantenha-os no gelo durante a reticulação.Em seguida, utilize uma agulha aquecida em bico de Bunsen para fazer pequenos orifícios nas tampas dos tubos. Adicione 40 mililitros de PBS 1x e 1,08 mililitros de formaldeído aos tubos. Parafuse as tampas nos tubos e coloque os tubos em um dessecador.Infiltração a vácuo por 10 minutos, depois libere cuidadosamente o vácuo para evitar agitação da solução. Após misturar a amostra, repita os passos de vácuo e mistura. Após a infiltração, observe o material vegetal e confirme que ele torna-se levemente translúcido e afunda até o fundo do tubo.Adicione 2,5 mililitros de glicina 2 molar para obter uma concentração final de 0,125 molar e aplique o vácuo durante cinco minutos. Após liberar o vácuo, descarte a solução invertendo os tubos e permitindo que escorra pelos orifícios nas tampas. Use PBS para lavar os plântulos duas vezes e lave com água uma vez.Em seguida, seque os plântulas em uma toalha de papel antes de usar nitrogênio líquido para congelar. Para cada imunoprecipitação, prepare 15 microlitros de esferas magnéticas em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de tampão de diluição para imunoprecipitação de cromatina, ou tampão de diluição para chip, às esferas, misture por rotação e coloque o tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro em um suporte magnético.Após deixar as esferas aderirem ao ímã por cerca de um minuto, utilize uma pipeta para remover o sobrenadante antes de repetir a lavagem. Re-suspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de diluição para ChIP. Para imunoprecipitação, adicione a quantidade necessária do anticorpo específico a um dos dois tubos preparados para cada planta cega.Um fator fundamental para o sucesso do experimento de chip é o anticorpo escolhido para a imunoprecipitação da proteína de interesse. Anticorpos produzidos contra fatores de transcrição de plantas podem ser úteis para experimentos de chip, mas o soro deve ser cuidadosamente testado. Por exemplo, anticorpos verificados apenas em análises de Western blot nem sempre são adequados para experimentos de chip.Como controle negativo, adicione a mesma quantidade de IGG não específica ao segundo tubo. Incube os tubos a quatro graus Celsius durante a noite em uma roda rotativa para permitir que o anticorpo se ligue às esferas. Usando um almofariz e um pistilo, triture completamente o material vegetal congelado em nitrogênio líquido até que o pó fique homogêneo e verde claro.Transfira o pó para um novo tubo de 50 mililitros. Em uma capela, adicione 30 mililitros do tampão de extração um e misture bem para hidratar o pó do tecido. A partir deste passo, mantenha as amostras a quatro graus Celsius em todos os momentos e certifique-se de que o tecido esteja completamente descongelado antes de prosseguir.Limpe a suspensão passando-a por uma tela de filtração com tamanho de poro de 22 a 25 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante do precipitado, que deve ter um volume de cerca de dois mililitros.Com cinco mililitros do tampão de extração dois, re-suspenda o precipitado. Em seguida, centrifugue a 1.000 ×g e 4 °C por 10 minutos. Após a remoção do sobrenadante, re-suspenda o precipitado em 300 microlitros do tampão de extração três.Em um tubo separado, adicione 600 microlitros do tampão de extração três e, em seguida, sobreponha cuidadosamente o pellet re-suspenso sobre o tampão limpo. Centrifugue o tubo durante uma hora a 16.000 vezes g a quatro graus Celsius, seguido pela aspiração do sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, utilize 300 microlitros do tampão de sonicação para ressuspender lentamente o pellet nuclear, evitando a formação de bolhas, o que pode afetar a eficiência da sonicação.Transfira cuidadosamente a suspensão para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Sonique a suspensão para lisar os núcleos e fragmentar aleatoriamente a cromatina em fragmentos de 200 a 600 pares de bases. Verifique os tamanhos dos fragmentos de DNA em um gel de agarose, em seguida, centrifugue a solução a 12.000 × g e 4 °C por 10 minutos.Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e descarte o pellet. Aliquota um décimo do sobrenadante em um tubo novo e rotule-o como "input" antes do congelamento a menos 20 graus Celsius. Por fim, faça uma diluição dez vezes maior da cromatina no tampão de diluição para ChIP, para obter uma concentração final de SDS de 0,1 por cento.As amostras podem então ser congeladas e armazenadas a menos 20 graus Celsius por várias semanas. Após incubar as microesferas com anticorpos durante a noite, utilize um mililitro de tampão de diluição para imunoprecipitação para lavar as microesferas três vezes, depois re-suspenda as microesferas em um mililitro de cromatina diluída e incube o tubo durante a noite em rotação a quatro graus Celsius. No dia seguinte, coloque as microesferas na grade magnética a quatro graus Celsius e, após remover a solução, utilize um mililitro de tampão de lavagem de baixa força iônica para lavar as microesferas duas vezes, depois utilize o tampão de lavagem de alta força iônica para lavar as microesferas uma vez.Após usar um mililitro de tampão de lavagem de cloreto de lítio para lavar os grânulos uma vez, use um mililitro de tampão TE para lavar os grânulos duas vezes. Aspire para remover completamente o tampão de lavagem TE. Assim que as amostras de entrada forem descongeladas, transfira cinco microlitros de cada uma para novos tubos de 1,5 mililitro e, a partir desse ponto, trate-as de maneira semelhante às amostras de chip.Reverta a ligação cruzada adicionando 200 microlitros de resina de troca iônica quelante a cinco por cento e incube a 95 graus Celsius por 10 minutos, agitando a cada dois a três minutos. Centrifugue a 16.000 vezes g por 30 segundos e transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga. Adicione dois microlitros de proteonase K a 10 miligramas por mililitro e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para digerir as proteínas e liberar o DNA.Para interromper a reação, incubar a 95 graus Celsius por 10 minutos, centrifugar rapidamente a 16.000 ×g por 30 segundos e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Após purificar o DNA de acordo com o protocolo descrito no texto, diluir de um para dez com água e utilizar cinco microlitros por reação para medir a abundância de sítios de ligação por qPCR. Analisar os dados de acordo com o protocolo descrito no texto.Folhas de Arabidopsis são cobertas por camadas de cera e tricomas que favorecem a formação de bolhas de ar, o que dificulta a penetração de reagentes de reticulação nos tecidos vegetais. Aqui são mostradas amostras de plântulas reticuladas que foram submetidas a reticulação sob vácuo para aumentar a eficiência de fixação. Esta figura demonstra que um número crescente de ciclos de sonicação reduz progressivamente o tamanho médio do DNA em amostras de chip, alcançando o enriquecimento ótimo na faixa de 200 a 600 pares de bases após 20 a 30 ciclos, como demonstrado aqui.Como visto nesta figura, quatro regiões importantes para a regulação transcricional do locus FT, um gene mestre do florescimento, foram escolhidas para a análise. Os resultados de ChIP demonstram que a proteína EBS se ligou a uma das quatro regiões testadas, uma sequência reguladora próxima ao sítio de início da transcrição de FT. Por fim, ensaios de ChIP realizados com um anticorpo direcionado contra a histona H3 acetilada nas lisinas nove e 14, que está associada à cromatina transcricionalmente ativa, revelaram maior abundância de H3K9/14ac em mutantes DBS em comparação com plantas do tipo selvagem em todos os quatro fragmentos genômicos de FT testados, o que é consistente com a superexpressão observada desse gene mestre do florescimento nesse mutante. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente.Após este procedimento, juntamente com outras medidas como a análise de expressão gênica, pode contribuir para responder outras questões, tais como: Qual é o papel biológico da ligação da proteína ao DNA? Está envolvida na ativação ou repressão transcricional? E quais modificações de histonas estão associadas?Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética vegetal explorarem os estados da cromatina em nossas células redutivas. E isso pode ser estendido a outras espécies vegetais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar a ligação da sua proteína de interesse em *Arabidopsis* ao DNA *in vivo*.Não se esqueça de que o trabalho com reagentes como 2-metoxietanol, formaldeído ou sonicador, patógenos e mutações de stem pode ser extremamente perigoso, e precauções como roupas protetoras, luvas ou proteção auditiva devem sempre ser tomadas ao utilizar este procedimento.

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted...

Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

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Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

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Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento...

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

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Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a realização do experimento de marcação por proximidade (PL) em pepino (Cucumis sativus L.) usando AT4G18020 (APRR2)-proteína AirID como modelo. O método descreve a construção de um vetor, a transformação de um construto através de agroinfiltração, infiltração de biotina, extração de proteínas e purificação de proteínas marcadas com biotina através da técnica de purificação por afinidade.

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