Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é desvendar as interações entre proteínas e DNA na cromatina das células de arabidopsis. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vegetal, como quais genes são regulados por um determinado fator de transcrição ou quais modificações do sistema estão associadas a um status transcricional dos genes. A principal vantagem dessa técnica é que, por meio da etapa de reticulação, é possível corrigir e capturar as mudanças na organização da cromatina que ocorrem durante o desenvolvimento da planta.

Embora este método possa fornecer uma visão sobre a interação de proteínas em arabidopsis thaliana, ele também pode ser aplicado a diferentes ordens de plantas e adaptado a outras espécies de plantas. Demonstrando este procedimento estarão Dorota Komar e Alfonso Mouriz, dois alunos de doutorado em nosso laboratório. Após o cultivo da arabidopse de acordo com o protocolo de texto, colete 1,5 gramas de material vegetal em tubos de 50 mililitros e mantenha-os no gelo durante a reticulação.

Em seguida, use uma agulha aquecida por queimador de laboratório para fazer pequenos orifícios nas tampas dos tubos. Adicione 40 mililitros de 1x pbs e 1,08 mililitros de formaldeído aos tubos. Aparafuse as tampas dos tubos e coloque-os em um dessecador.

Aspire por 10 minutos e, em seguida, solte cuidadosamente o vácuo para evitar agitar a solução. Depois de misturar a amostra, repita as etapas de vácuo e mistura. Após a infiltração, observe o material vegetal e confirme se ele se torna ligeiramente translúcido e afunda no fundo do tubo.

Adicione 2,5 mililitros de glicina de dois molares a uma concentração final de 0,125 molar e aplique o vácuo por cinco minutos. Depois de liberar o vácuo, descarte a solução invertendo os tubos e deixando-a escorrer pelos orifícios das tampas. Use pbs para enxaguar as mudas duas vezes e enxágue com água uma vez.

Em seguida, seque as mudas em uma toalha de papel antes de usar nitrogênio líquido para congelar. Por cada imunoprecipitação, prepare 15 microlitros de esferas magnéticas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de imunoprecipitação de cromatina, ou tampão de diluição de cavacos, aos grânulos, misture por rotação e coloque o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro em um rack magnético.

Depois de permitir que as contas se prendam ao ímã por cerca de um minuto, use um pipetador para remover o sobrenadante antes de repetir a lavagem. Ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de tampão de diluição de cavacos. Para imunoprecipitação, adicione a quantidade necessária do anticorpo específico a um dos dois tubos preparados para cada planta às cegas.

Um fator chave no experimento bem-sucedido do chip é o anticorpo escolhido para a imunoprecipitação da proteína de interesse. Os anticorpos criados contra o fator de transcrição da planta podem ser úteis para experimentos com chips, mas o soro deve ser exaustivamente testado. Por exemplo, os anticorpos verificados apenas na análise de Western blot não são necessariamente válidos para chip.

Como controle negativo, adicione a mesma quantidade de IGG não específico ao segundo tubo. Incube os tubos a quatro graus Celsius durante a noite em uma roda giratória para permitir que o anticorpo se prenda às contas. Usando um almofariz e pilão, triture bem o material vegetal congelado em nitrogênio líquido até que o pó fique homogêneo e verde claro.

Transfira o pó para um novo tubo de 50 mililitros. Sob uma coifa, adicione 30 mililitros de tampão de extração um e misture bem para embeber o pó de tecido. A partir desta etapa, mantenha as amostras a quatro graus Celsius o tempo todo e certifique-se de que o tecido esteja completamente descongelado antes de prosseguir.

Limpe a pasta passando-a por um tecido de filtração com um tamanho de poro de 22 a 25 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Decantar suavemente o sobrenadante do pellet, que deve ter cerca de dois mililitros de volume.

Com cinco mililitros de tampão de extração dois, ressuspenda o pellet. Em seguida, centrifugue a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a decantação do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de extração três.

Em um tubo separado, adicione 600 microlitros de tampão de extração três e, em seguida, coloque cuidadosamente o pellet ressuspenso em cima do tampão limpo. Centrifugar o tubo durante uma hora a 16 000 vezes g a quatro graus Celsius, seguido de aspiração do sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, use 300 microlitros de tampão de sonicação para ressuspender lentamente o pellet nuclear, evitando a formação de bolhas, o que pode afetar a eficiência da sonicação.

Transfira cuidadosamente a suspensão para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Sonicar a suspensão para lisar os núcleos e compartilhar aleatoriamente a cromatina em 200 a 600 fragmentos de pares de bases. Verifique o tamanho dos fragmentos de DNA em um gel de agarose e, em seguida, gire a solução a 12.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e descarte o pellet. Alíquota de um décimo do sobrenadante em um novo tubo e rotule-o como entrada antes de congelar a 20 graus Celsius negativos. Finalmente, faça uma diluição de dez vezes da cromatina no tampão de diluição do chip para atingir uma concentração final de SDS de 0,1%.

As amostras podem então ser congeladas e armazenadas a menos 20 graus Celsius por várias semanas. Depois de incubar os grânulos com anticorpos durante a noite, use um mililitro de tampão de diluição de cavacos para lavar os grânulos três vezes, depois ressuspenda os grânulos em um mililitro da cromatina diluída e incube o tubo durante a noite em uma roda giratória a quatro graus Celsius. No dia seguinte, coloque as contas no rack magnético a quatro graus Celsius e, após remover a solução, use um mililitro de tampão de lavagem com baixo teor de sal para lavar as contas duas vezes e, em seguida, use tampão de lavagem com alto teor de sal para lavar as contas uma vez.

Depois de usar um mililitro de tampão de lavagem de cloreto de lítio para lavar as contas uma vez, use um mililitro de tampão TE para lavar as contas duas vezes. Aspire para remover completamente o tampão de lavagem TE. Depois que as amostras de entrada forem descongeladas, transfira cinco microlitros de cada uma para novos tubos de 1,5 mililitro e, seguindo em frente, trate da mesma forma que as amostras de chips.

Inverta a reticulação adicionando 200 microlitros de resina de troca iônica quelante a cinco por cento e incube a 95 graus Celsius por 10 minutos, agitando a cada dois ou três minutos. Gire para baixo a 16.000 vezes g por 30 segundos e transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos de microcentrífugas. Adicione dois microlitros de 10 miligramas por mililitro de protonase K e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para digerir proteínas e liberar DNA.

Para parar a reação, incube a 95 graus Celsius por 10 minutos, gire rapidamente a 16.000 vezes g por 30 segundos e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Depois de limpar o DNA de acordo com o protocolo de texto, dilua de um a dez com água e use cinco microlitros por reação para medir a abundância de locais de ligação por qPCR. Analise os dados de acordo com o protocolo de texto.

As folhas de aribidopsis são cobertas por camadas de cera e os tricomas favorecem a formação de bolhas de ar, o que dificulta a penetração dos reagentes de reticulação no tecido vegetal. Aqui são mostradas amostras de mudas reticuladas que foram reticuladas a vácuo para aumentar a eficiência da fixação. Esta figura demonstra que um número aumentado de ciclos de sonicação reduz progressivamente o tamanho médio do DNA em amostras de chips, atingindo o enriquecimento ideal na faixa de 200 a 600 pares de bases após 20 a 30 ciclos, conforme demonstrado aqui.

Como visto nesta figura, quatro regiões importantes para a regulação transcricional do locus FT, um gene mestre da floração, foram escolhidas para a análise. Os resultados do chip demonstram que a proteína EBS combinou uma das quatro regiões testadas, uma sequência regulatória próxima ao local de início da transcrição do FT. Finalmente, ensaios de chip realizados usando um anticorpo direcionado contra a histona h3 acetilada nas lisinas nove e 14, que está correlacionada com a cromatina transcricionalmente ativa, revelaram maior abundância de H3K9 / 14ac em DBS mutante versus plantas selvagens em todos os quatro fragmentos genômicos de FT testados, consistente com a regulação positiva observada deste gene mestre de floração neste mutante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente.

Seguir esse procedimento, juntamente com outras medidas como a análise da expressão gênica, pode contribuir para responder a outras perguntas, como: Qual é o papel biológico da ligação da proteína ao DNA? É na ativação ou repressão transcricional? E quais modificações de histonas estão associadas?

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética vegetal explorarem os estados da cromatina em nossas células redutoras. E isso pode ser estendido a outras espécies de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a ligação de sua proteína aribidopse de interesse ao DNA in vivo.

Não se esqueça de que trabalhar com reagentes de 2-metoxietanol, formaldeído ou sonicador, patógenos e mutações do tronco pode ser extremamente perigoso, e precauções como roupas de proteção, luvas ou proteção auditiva devem sempre ser tomadas ao usar este procedimento.