Name: Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a caracterizar o metabolismo de macrófagos M1 e M2 derivados da medula óssea usando análise de fluxo extracelular em tempo real. Este método permite investigar como citocinas e compostos afetam a fenotipagem metabólica celular.

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Jan Van den Bossche recebeu uma bolsa de pós-doutorado júnior da Netherlands Heart Foundation (2013T003) e uma bolsa VENI da ZonMW (91615052). Menno de Winther é um Investigador Estabelecido da Netherlands Heart Foundation (2007T067), é apoiado por uma bolsa da Netherlands Heart Foundation (2010B022) e possui uma bolsa AMC. Também agradecemos o apoio da Iniciativa de Pesquisa Cardiovascular da Holanda, da Federação Holandesa de Centros Médicos Universitários, da Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde e da Academia Real de Ciências da Holanda para o projeto GENIUS "Gerando os melhores alvos farmacêuticos baseados em evidências para aterosclerose" (CVON2011-19). Agradecemos à Seahorse Bioscience por tornar possível a publicação em acesso aberto. Os autores agradecem a Riekelt Houtkooper e Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdã, Holanda) por toda a assistência anterior com o analisador Seahorse.

1. Os macrófagos A cultura e polarização de Medula Óssea derivados <ol><li> Dia 0: Isolar fêmur e tíbia ossos de 6-10 semana ratos velhos de interesse (C57BL / 6 neste ensaio). </li><li> Remover o tecido do músculo dos ossos e colocar os ossos numa placa de petri com 9 cm cheia de PBS gelado. </li><li> Transfira os ossos de um prato de 9 centímetros de Petri cheia com etanol 70% e agitar suavemente a placa durante 30 segundos. </li><li> Transfira os ossos para uma nova 9 centímetros placa de Petri cheia de gelo-frio PBS estéril. </li><li> Cortar o fêmur ea tíbia em ambas as extremidades com tesoura estéril. </li><li> Lave os ossos com 10 ml de gelo-frio PBS estéril usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de 25 G. Recolha da medula óssea em um tubo de 50 ml. </li><li> Transferir as células da medula óssea para um novo tubo de 50 ml usando uma agulha 23 G. </li><li> Repita este passo com uma agulha de 25 G. Nota: Estes passos são necessários para remover aglomerados de células e resíduos ósseos. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descarte o supernatant e ressuspender as células em meio de 40 ml de células de cultura (RPMI-1640 mais 2 mM de L-glutamina, 10% FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml) e 15% filtrou-se L-929 de células ( ATCC, CCL-1) meio contendo climatizados, M-CSF (ou, alternativamente, 10 ng mL-M-CSF / recombinante em vez de L-929 de meio condicionado de células). Nota: A geração de meio condicionado de células L-929 foi detalhado anteriormente neste jornal em 2013. 11 </li><li> Cultura das células a partir de um murganho em duas placas de Petri de 15 cm (não utilizar placas tratadas de cultura de células uma vez que macrófagos não irá separar a partir desta plástico) em 20 ml de meio de cultura por placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cultura de células fresco no dia 3, sem remover os mais velhos 20 ml meio de cultura celular. </li><li> Substitua a forma de cada placa com 20 ml de meio de cultura fresco no dia 6. Fazendo isto, as células não aderentes também serão removidos. </li><li> Dia 8: <ol><li> Separe as células, incubando-as a 5 mno a 37 ° C em 10 ml de solução salina de citrato (135 mM de cloreto de potássio mais citrato de sódio 15 mM em H2O, autoclavado) e lava-se com 10 ml de PBS. Contagem macrófagos osso maduro derivadas da medula (BMDM) no dia 8, utilizando um contador de células. </li><li> Verifique a formação de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM por inspeção visual ou por citometria de fluxo. Bloco 10 5 células com anti-CD16 1/100 / CD32 em PBS durante 20 minutos em 100 ul de PBS, incubar com 1/200 anti-CD11b-FITC mais 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 à RT, lavagem e analisar por citometria de fluxo. Nota: os macrófagos derivados da medula óssea de rato A cultura foi publicada em detalhes anteriormente neste jornal por Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Semente 50.000 células (contagem de células óptimas devem ser optimizados) por cavidade em uma microplaca de cultura de células em 100 ul de meio de cultura. Não semear células em poços de correção de fundo (A1, A12, H1, H12) e colocar apenas meio (sem células) nesses poços. Sugestão: Segure a pipeta em um ângulo umluta a meio do lado dos poços para camada de células mais homogênea. </li><li> Permitir que as células de resolver à temperatura ambiente numa capa de cultura de células durante 1 h. Isto irá promover uma distribuição uniforme de células e reduzir efeitos de borda. Monitorar a aderência usando um microscópio e cultura num banho a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Três horas após o plaqueamento, estimular as células durante 24 horas com 10 ng / ml de LPS, ou 20 ng / ml de rato recombinante da IL-4 para gerar M1 ou M2 macrófagos, respectivamente. Incluir naïve (M0) macrófagos não tratados como um controle. Avaliar adequada M1 e M2 macrófagos polarização medindo induzida por LPS a secreção de IL-6, IL-12, TNF (ELISA) e IL-4 induzida pela arginase-1 atividade e / ou MMR (CD206) e MGL (CD301) a expressão de superfície (citometria de fluxo) conforme descrito anteriormente 3,11. Nota: Neste ponto, as células podem ser (pré) tenha sido tratada com com compostos farmacológicos de interesse ou os macrófagos podem ser estimuladas com outros factores. Uma vez que, a variação entre os poços separados pode ser substantial, é aconselhável a utilização de, pelo menos, 4 e, idealmente 6 poços por condição. </li></ol> 2. Preparação do Ensaio de Fluxo Extracelular <ol><li> Hidratar o cartucho do sensor, um dia antes de realizar o teste: <ol><li> Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. </li><li> Encher cada poço da placa de utilidade com 200 ul de solução de calibração e diminuir o cartucho do sensor sobre a placa de utilidade submergindo os sensores na solução de calibração. </li><li> Verificar o nível da solução de calibração é alta o suficiente para manter os sensores e submersos num lugar não-CO 2 37 ° C incubadora S / N. </li></ol></li><li> Prepare meio de ensaio no dia do ensaio como se segue: <ol><li> 50 ml de meio de base XF Aquece-se até 37 ° C. </li><li> Adicionar 500 ul de 200 mM de L-glutamina para obter uma concentração final de 2 mM. </li><li> Ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 1 N e esterilizar com um filtro de 0,2 uM e manter o meio de ensaio a 37 ° C. </li></ol></li><li> Suavemente remover o meio de cultura de células de macrófagos polarizadas e armazená-lo a -20 ° C para uso futuro (por exemplo, ELISA para examinar a polarização adequada de macrófagos). Lavam-se as células com meio de ensaio de 100 ul, adicionar meio de ensaio de 180 ul por poço e verificar ao microscópio as células que não foram lavados. Colocar a placa de cultura de células em um temperatura de 37 ° C sem incubadora de CO2 durante 1 hora antes do procedimento de ensaio. </li><li> Preparar 10 x compostos para injecção misturas A até D, tal como descrito na Tabela 1, aquecer até 37 ° C, ajustar o pH para 7,4 e esterilizar filtro. <ol><li> Fazer todos os compostos nessas misturas em 10x a concentração final em poços de cultura de células e optimizar estas concentrações para cada tipo de célula. </li></ol></li><li> Coloque o cartucho do sensor usando as guias de carregamento fornecidos com volumes indicados (Tabela 1) das misturas de compostos 10x injeção preparados nos portos A, B, C e D, respectively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Mistura / Injecção </td><td> Compostos </td><td> Volume adicionado para obter 10x mistura (ul) </td><td> Ensaio Volume Médio (ml) </td><td> Volume injetado durante a execução (ul) </td><td> A concentração final no ensaio </td></tr><tr><td> UMA </td><td> 2,5 M (45%) de glucose </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> B </td><td> 5 mM de oligomicina A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 uM </td></tr><tr><td> C </td><td> MM FCCP 5 </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 uM </td></tr><tr><td></td><td> Solução 100 mM de piruvato de sódio </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 mM antimicina A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 uM </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM rotenone (Rot) </td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 1. misturas de injecção. 3. Caracterização bioenergética da Polarizada M1 e M2 BMDM usando um Extracelular Flux Analyzer <ol><li> Criar um modelo de ensaio com o assistente de ensaio com MIX 2 minutos e 3 vezes minuto medir e (pelo menos) 3 mix e de taxa de medições laços antes de cada um dos 4 injecções (Tabela 1) e após a última injecção. Nota: Estas concentrações são válidas para os macrófagos derivados da medula óssea e RAW264.7 linhas celulares de macrófagos, mas deve ser optimizada para cada tipo de célula. Adição de piruvato na mistura FCCP é necessário para abastecer respiração máxima. </li><li> Comece a correr, empurrando o fundo de início e siga as instruções do aparelho. Primeira carga do carroplaca cartucho com as sondas hidratados para permitir calibração por aparelhos e próxima carga da placa de células. </li><li> Após o ensaio, descartar cuidadosamente todos meio de ensaio e armazenar a microplacas de cultura celular analisada a -20 ° C para futuro normalização celular utilizando o kit de ensaio de proliferação celular, como descrito em detalhe pelo fornecedor. <ol><li> Resumidamente, preparar um tampão de lise de células-1x diluindo o componente B de 20 vezes em água destilada e dilui-se o composto A de 400 vezes no tampão de lise de células-1x. Adicionar 200 ul por poço, incubar 5 minutos à temperatura ambiente e medir a fluorescência com excitação a 180 nm ~ e ~ 520 nm de emissão máximos. Nota: Quando se trabalha com células não-aderentes ou se baixa adesão é uma preocupação, o kit de proliferação de células directo pode ser usado como uma alternativa uma vez que este protocolo não necessita descartando todos meio de ensaio. No entanto, este protocolo direto é um pouco menos sensível em comparação com o protocolo utilizado neste laboratório. </li></ol></li><li> Após a medição de fluorescência, normalizara contagem de células em cada poço como uma razão em que a contagem média de células de todas as cavidades sem tratamento prévio de macrófagos é fixada em 1. Nota: a quantificação de proteínas (por exemplo, utilizando um ensaio BCA) poderia ser utilizado como uma forma alternativa para normalizar as contagens de células. No entanto, nas nossas mãos este ensaio foi menos sensível em comparação com o kit de ensaio de proliferação celular. </li></ol>

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</ol>

Acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Seahorse Bioscience.

O objetivo do nosso laboratório é entender como polarização e função dos macrófagos pode ser influenciada com o objetivo final de melhorar o resultado da aterosclerose e outras condições inflamatórias 12. Para avaliar macrófagos polarização, um mede tipicamente o LPS (+ IFN-y) e induzidas por IL-4 induzida a expressão do gene de M1 e M2 genes marcadores (qPCR), determina a IL-6, IL-12, TNF e nenhuma secreção (por ELISA e reacção de Griess) e examina induzida por IL-4 CD71, CD206, CD273 e CD301 expressão de superfície (por citometria de fluxo) e actividade da arginase 3,13. Além disso, ensaios de apoptose (por Anexina-V / coloração PI), ensaios de fagocitose (com esferas fluorescentes de látex e / ou pHrodo de E. coli) e ensaios de formação de células espumosas (por absorção Dil-oxLDL, LipidTOX coloração lípido neutro) podem ser realizados para avaliar a funcionalidade de macrófagos 14. Além disso, a análise de fluxo extracelular pode ser realizado para medir a bioenergética perfis de Mac polarizadarophages como uma leitura funcional novo e alternativo. Este manuscrito polarização mostra que macrófagos induz reprogramação metabólica com macrófagos induzida por LPS de comutação para o aumento da glicólise como fonte de energia. Inversamente, M2 macrófagos induzida por IL-4 utilizar a fosforilação oxidativa mitocondrial, como a principal fonte de ATP. É importante ressaltar que a reprogramação metabólica não só fornece energia para os requisitos particulares do M1 e M2 macrófagos polarizadas. Com efeito, as alterações metabólicas afetam as concentrações do metabolito que são reguladores diretos do fenótipo de macrófagos 10,15,16. Assim, o metabolismo de macrófagos não é apenas uma característica (como mostrado aqui na Figura 2), mas também um controlador de estados de polarização de macrófagos e esse novo conhecimento apoiado o rápido crescimento da área de pesquisa do immunometabolism durante o último par de anos. No entanto, as medidas robustas de perfis metabólicos em macrofagos permaneceu difícil e tinha suas limitações. Neste estudo, um analisador de fluxo extracelular é aplicado para medir de forma robusta glicólise, reserva glicolítica, capacidade glicolítica máxima, acidificação não glicolítica, respiração basal e máxima, a produção de ATP, a capacidade respiratória de reposição, vazamento de protões e respiração não-mitocondrial em tempo real em uma quantidade mínima de macrófagos. Portanto, modificada e melhorada protocolos do fabricante, conforme se segue. O Teste de Estresse Mito padrão (# 103015-100) sugere o uso de meio com glicose e piruvato e um protocolo com 3 injecções (OM, FCCP, AA / rot). Nós optar para iniciar o ensaio com meio de glucose /-piruvato livre, adicionar glucose como uma primeira injecção no canal A (como no teste de stress glicólise # 103020-100) e adicionar piruvato em conjunto com o desacoplador FCCP no porto C. Desta maneira , todos os parâmetros relevantes glicólise são derivados a partir das medições eCar 1-9 e todas as informações relevantes sobre mitochondrial função a partir de medições de OCR 4-15. Note-se que é fundamental para injetar piruvato juntamente com FCCP para abastecer respiração máxima em cima do desacoplamento. Antes de utilizar este protocolo combinado, deve-se verificar que a 2-desoxi-D-glicose (2-DG) reduz os níveis de eCar após o ensaio com os valores basais (1-3) e que as taxas eCar gravadas 4-6 são, de facto, devido a glicólise. Além disso, deve-se compreender que as concentrações do composto e o número de células utilizadas neste manuscrito são válidas para os macrófagos derivados da medula óssea e RAW264.7 linhas celulares de macrófagos e devem ser optimizados para outros tipos de células. Além disso, deve-se notar que o FEC-M, que é usado para gerar os macrófagos derivados da medula óssea promove um fenótipo anti-inflamatória M2-like. Os resultados apresentados a partir de macrófagos derivados de medula óssea, por conseguinte, pode não ser totalmente comparáveis ​​às medições com macrófagos residentes de tecido primário ou macrófagos linhas de células que não necessitem de M-CSF durante culturi célulang. Em comparação com os métodos existentes, este protocolo requer quantidades mínimas de macrófagos e fornece rapidamente praticamente todos os celulares características metabólicas fundamentais. Isto resulta em células excedentes suficientes para realizar outros ensaios imunológicos e até mesmo as células utilizadas para a bioenergética perfilamento pode ainda ser utilizado para outros propôs após o ensaio. Além disso, em particular o formato de placa de 96 bem permite avaliar múltiplos condições em tempo real, ao mesmo tempo. No entanto, a variação entre os poços individuais pode ser considerável e, por conseguinte, a utilização de pelo menos 4 poços por condição é muitas vezes desejado. Tomados em consideração esta limitação, a análise de fluxo extracelular descrito ainda permite executar mais de 10 condições experimentais (n = 6) de uma só vez, o que é muito mais do que as técnicas tradicionais. No geral, este artigo fornece um ensaio funcional fácil e reprodutível, que permite medir tudo glicólise relevante e param mitocondrialtros em subconjuntos de macrófagos polarizada. Esta técnica pode servir como uma aplicação futura para avaliar a função de macrófagos e para avaliar o efeito de manipulações distintas (por exemplo, gene batida para baixo, novos fármacos, etc.) no (metabólica) do fenótipo de macrófagos. Como tal, os dados de fluxo extracelular pode ser usado em conjunto com outros ensaios para permitir a caracterização detalhada do estado da activação do macrófago.

Enquanto os macrófagos desempenham um papel central em praticamente todas as doenças, os mecanismos moleculares que regulam o seu fenótipo ainda não são completamente desvendados. Macrófagos apresentam elevada heterogeneidade e em resposta ao microambiente adoptar diferentes fenótipos 1. LPS (+ IFN-y) induzida classicamente activado M1 ou M (LPS) macrófagos promovem a inflamação e proteger o hospedeiro contra diferentes tipos de ameaças microbianos 2. Outros usam IFNy por si só ou em combinação com TNF como estímulos para provocar M1 polarização. IL-4 e / ou IL-13 induz a activação de macrófagos alternativa e estes M2 ou células M (IL-4) são supressores potentes e controladores de respostas imunitárias em curso 3. Macrófagos polarizadas exibir um regulamento distinto do metabolismo celular com macrófagos M1 LPS-ativados passando por um interruptor metabólica para o reforço da glicólise 4-6. Oxidação de ácido gordo Por outro lado, o reforço (FAO) e oxidativ mitocondriale fosforilação (OXPHOS) fornece energia sustentada no induzidas por IL-4 macrófagos M2 7-9. Assim, a alteração do metabolismo não é apenas uma característica de subconjuntos de macrófagos polarizadas, é também um pré-requisito para a polarização adequada e regulação inflamatória. Importante, a inibição da glicólise ou OXPHOS / FAO tem sido demonstrado para prejudicar M1 ou M2 activação, respectivamente, 8,10. Como tal, a identificação de mudanças metabólicas em macrófagos pode ser aplicado como uma ferramenta para avaliar o seu estado de polarização e potencial inflamatório. Um ensaio que mede o metabolismo consistente macrófagos podia, portanto, ser usadas para prever se uma droga, gene derrubar ou outro tratamento afecta a polarização e função dos macrófagos. Neste vídeo, um analisador de fluxo extracelular é usado para caracterizar os perfis de bioenergética naïve, M1 e M2 macrófagos. Este manuscrito apresenta detalhes de um protocolo optimizado que permite a mediçãode todos os parâmetros relevantes glicólise (glicólise, glicólise máxima e reserva glycolytic) e características da função mitocondrial (respiração total, a respiração basal mitocondrial, produção de ATP, vazamento de prótons, respiração máxima e capacidade respiratória de reposição) em um único ensaio. Usando esta configuração experimental, bioenergética pode ser comparado entre o controle e &#39;alterado&#39; (eg gene knock down, a superexpressão transgênica ou tratamento farmacológico) células.

<table><tbody><tr><td>Agulhas 23G e 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 e #300600</td> Para seringas de 10 ml <td>de medula óssea lavadas</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td> Para placas de Petri <td>de medula óssea lavadas</td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>Para cultivar células de medula óssea</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proliferação celular CyQUANT&nbsp;</td><td>Sondas Moleculares</td><td>#C7026</td><td>Para quantificação celular em um ponto de tempo posterior (funciona apenas para células aderentes)</td></tr> <tr><td>Kit de Ensaio de Proliferação Celular Direta CyQUANT&nbsp;</td><td>Sondas Moleculares</td> <td># 35011</td><td>Para quantificação celular imediatamente após o ensaio (células não aderentes)</td></tr> <tr><td>Microplaca de cultura de células XFe96</td><td>Seahorse Bioscience</td> <td># 101085-004</td><td>Placa de 96 poços na qual as células são cultivadas e na qual o ensaio é feito</td></tr><tr><td>interleucina-4 de camundongo recombinante (IL-4)</td> <td>Peprotech</td> <td># 214-14-B</td><td>Usado para induzir ativação</td></tr> <tr><td>alternativa de macrófagoslipopolissacarídeo (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td> Cartucho de Sensor de Cavalo Marinho de <td>Estímulo Pró-inflamatório</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biociência do Cavalo Marinho</td><td>#102416-100</td><td>Contém as sondas para medição de pH e O2</td></tr><tr><td>Calibrante Seahorse XF&nbsp;</td><td>Biociência do Cavalo-marinho</td><td>#100840-000</td><td>Necessário para hidratar as sondas durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>Base XF média&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>Meio sem tampão que permite a medição eficiente das mudanças de pH</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>Alimenta a glicólise uma vez adicionada às células</td></tr><tr><td>oligomicina A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td><td>Inibe a ATP sintase mitocondrial</td></tr><tr><td>FCCP( Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Desacopla a respiração mitocondrial</td></tr><tr><td>100 mM Solução de piruvato de sódio</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>Permite a respiração mitocondrial máxima sem a necessidade de glicólise</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674</td><td>Inibe o complexo III das mitocôndrias</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674R8875</td><td>Inibe o complexo I do mitocôndrias</td></tr><tr><td>Casy Cell Counter</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>Instrumento para contagem de células</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161</td><td>Citometria de fluxo de bloqueio do receptor Fc</td></tr><tr><td>anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience</td><td></td><td>#47-4801</td><td>Anticorpo para corar macrófagos</td></tr><tr><td>anti-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>Anticorpo para corar macrófagos</td></tr></tbody></table>

caracterização metabólica de polarizada m1 e m2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Vias metabólicas específicas estão sendo cada vez mais reconhecidas como características críticas dos subconjuntos de macrófagos. Enquanto os macrófagos M1 ou M (LPS) classicamente ativados induzidos por LPS são pró-inflamatórios, a IL-4 induz a ativação alternativa de macrófagos e esses chamados M2 ou M (IL-4) auxiliam na resolução da inflamação e na cicatrização de feridas. Evidências recentes mostram o papel crucial da reprogramação metabólica na regulação da polarização dos macrófagos M1 e M2. 
Neste manuscrito, um analisador de fluxo extracelular é aplicado para avaliar as características metabólicas de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos polarizados M1 e M2 virgens. Este instrumento usa sensores de pH e oxigênio para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR), que podem estar relacionadas ao metabolismo oxidativo glicolítico e mitocondrial. Como tal, tanto a glicólise quanto o metabolismo oxidativo mitocondrial podem ser medidos em tempo real em um único ensaio.
Usando esta técnica, demonstramos aqui que os macrófagos inflamatórios M1 exibem metabolismo glicolítico aprimorado e atividade mitocondrial reduzida. Por outro lado, os macrófagos M2 anti-inflamatórios apresentam alta fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) e são caracterizados por uma capacidade respiratória sobressalente (SRC) aumentada. 
O ensaio funcional apresentado serve como uma estrutura para investigar como citocinas específicas, compostos farmacológicos, nocautes genéticos ou outras intervenções afetam o fenótipo metabólico e o estado inflamatório do macrófago.

Depois de terminar o ensaio celular e a quantificação de fluxo extracelular, os dados podem ser normalizada para contagem de células e analisado. Isto irá tipicamente produzir ECAR e OCR lotes como se mostra na Figura 1A e Figura 1B. Após a injecção de glucose (A), o aumento em ECAR representa a taxa de glicólise. O aumento adicional na ECAR após a inibição ATP sintase com oligomicina (B) fornece informações sobre a reserva glycolytic ea capacidade (Figura 1A). Ao analisar os valores de OCR, oligomicina injecção (B) permite o cálculo do consumo de oxigénio utilizado para a síntese de ATP mitocondrial. FCCP (C) desacopla respiração mitocondrial e as medidas correspondentes de OCR produzir dados sobre a capacidade respiratória máxima e de reposição. Finalmente, a injeção de rotenona (Rot) e antimicina A (AA) bloquear mitocondrial complexo I e III eo OCR residual representa os contras de oxigênio não-mitocondriaisumption (Figura 1B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figura 1: parâmetros metabólicos derivados a partir de um ensaio de fluxo de XF extracelular. (A) Os seguintes parâmetros da glicólise celular são calculados a partir dos valores ECAR (em mph / min): glicólise, capacidade máxima glicolítica e reserva glicolítica. Medições (B) OCR (em pMoles / min) são utilizados para calcular os parâmetros fundamentais próximos da função mitocondrial: respiração basal, a produção de ATP, vazamento de prótons, respiração máxima e capacidade respiratória de reposição. Gluc = glucose; OM = oligomicina A; FCCP = cianeto de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; AA = antimicina A; Rot = Rotenone <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Após a corrida, eCar e OCR medições 1 til15 l para cada cavidade podem ser exportados para Excel e os seguintes parâmetros glicolíticas podem ser calculados a partir das medições ECAR como se segue: Acidificação não glycolytic = avg. ECAR (1,2,3) Glicólise = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) Capacidade glicolítica máximo = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Reserva Glicosidases = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) A partir das taxas de OCR, os próximos características metabólicas podem ser determinados: Respiração não-mitocondrial = avg. OCR (13,14,15) Respiração basal = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) Produção de ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Proton vazamento =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respiração = avg máxima. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) Capacidade respiratória Spare (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4.5.6) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figura 2:. Metabólicas características de ingénuos (M0), LPS (M1) e IL-4 (M2) macrófagos polarizadas Para cada medição, a média e o erro padrão da média (SEM) de 8 poços individuais é apresentada. (A) taxas de acidificação extracelular (ECAR, em mph / min) e (B) taxas de consumo de oxigênio (OCR, em pMoles / min) são medidos para diferencialmente polarizado (M1 e M2) e macrófagos naïve (M0). Todas as medições foram normalizadas para a contagem de células (tal como medido com CyQUANT) e a contagem média de células de macrófagos sem tratamento prévio foi fixado em 1. EmUm jecção = glucose; B = oligomicina; C = FCCP; D = antimicina A + Rotenone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Como mostrado na Figura 2A, a activação de macrófagos com LPS induz aumento do metabolismo glicolítico. As diferenças entre as LPS e macrófagos tratados com IL-4 são ainda mais evidentes quando se olha para as taxas de consumo de oxigênio (OCR) na Figura 2B. Com efeito, enquanto o metabolismo oxidativo máxima é altamente suprimida em M (LPS), a IL-4 induz a respiração basal e especialmente máxima em macrófagos M2. Deve-se notar que o aumento glycolytic é bastante singular para M (LPS) macrófagos e não é necessariamente uma característica de macrófagos M1 desde M (IFN-y) macrófagos não exibem melhorar a glicólise. No geral, esta análise demonstra fluxo extracelular thaT com IL-4 induzida por macrófagos M2 são caracterizadas por metabolismo oxidativo aumentado e especialmente uma elevada capacidade respiratória de reposição (SRC), ao passo que os macrófagos activados por LPS visualização melhorada metabolismo glicolítico e não possuir qualquer capacidade respiratória de reposição.

A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

O objetivo geral desta análise de fluxo extracelular é avaliar as características metabólicas de macrófagos derivados da medula óssea polarizados em M1 e M2 ingênuos. Este método pode servir como uma base para investigar como citocinas específicas, compostos ou códigos genéticos afetam o fenótipo metabólico dos macrófagos. A principal vantagem desta técnica é que ela requer apenas uma pequena quantidade de macrófagos.Além disso, mede todos os parâmetros relevantes da glicólise e mitocondriais em um único ensaio. Embora este método forneça informações sobre o fenótipo metabólico de macrófagos derivados da medula óssea, ele também pode ser aplicado a todos os tipos de macrófagos ou células imunes. Tivemos a ideia de publicar este método na J, pois frequentemente recebemos pedidos de outros cientistas para ajudá-los com seus ensaios de fluxo celular metabólico. No oitavo dia de cultivo, verifique a presença de macrófagos maduros por inspeção visual e incube os macrófagos maduros derivados da medula óssea em 10 mililitros de solução salina de citrato durante cinco minutos.A 37 graus Celsius quando as células tiverem se destacado. Lave o cultivo com 10 mililitros de PBS e conte o número de células viáveis. Em seguida, semeie cinco vezes 10 à quarta potência de células por poço.Em uma placa de cultura celular XFE 96, com 100 microlitros de meio de cultura por poço, mantenha a pipeta em um ângulo cerca da metade da lateral de cada poço. Para dispensar as células, adicione apenas meio nos poços de correção de fundo A1, A12, H1 e H12. Em seguida, deixe as células sedimentarem à temperatura ambiente em uma câmara de cultura celular por uma hora.Após confirmar a aderência celular, mantenha as células em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Três horas após a semeadura, estimeule de quatro a seis poços de células por condição, conforme apropriado, durante 24 horas. Para polarizar os macrófagos derivados da medula óssea no dia anterior ao ensaio de fluxo extracelular, posicione o cartucho de sensores de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade e preencha cada poço da placa com 200 microlitros de solução crin.Em seguida, posicione o cartucho do sensor sobre a placa de utilidade para submergir os sensores na solução de Cain e verifique se o nível da solução de Cain é suficientemente alto para manter o sensor submerso. Em seguida, coloque o cartucho em uma incubadora não suplementada com dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova suavemente o sobrenadante dos macrófagos polarizados e lave as células com 100 microlitros do ensaio recém-preparado.Meio por poço. Adicione 180 microlitros de meio de ensaio a cada poço e use o microscópio para verificar se as células não foram removidas. Se as células ainda estiverem aderidas, coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por uma hora antes da execução do ensaio, enquanto as células estão em incubação.Prepare 10 x misturas de compostos de injeção conforme indicado na tabela e aqueça as misturas a 37 graus Celsius. Em seguida, carregue a cartela do sensor com os volumes apropriados do composto e das portas A, B, C e D utilizando os guias de carregamento fornecidos para caracterizar a bioenergia dos macrófagos polarizados por ensaio de fluxo extracelular. Use o assistente de ensaio para criar um modelo de ensaio com tempos de mistura de dois minutos e medição de três minutos, e pelo menos três ciclos de mistura e medição de taxa antes de cada uma das quatro injeções e após a última injeção.Em seguida, inicie o ensaio e siga as instruções indicadas pelo aparelho. Carregue a placa de cartucho com as sondas hidratadas para permitir a calibração pelo aparelho e pela placa de células. Quando orientado, ao final do ensaio, descarte cuidadosamente todo o meio do ensaio e armazene a microplaca de cultura celular analisada a menos 20 graus Celsius até a normalização.Para normalizar as células utilizando o kit de ensaio de proliferação celular, descongele a placa e incube as células em 200 microlitros de tampão de lise celular recém-preparado por poço durante cinco minutos à temperatura ambiente. Por fim, meça a fluorescência com excitação de aproximadamente 480 nanômetros e emissão máxima de aproximadamente 520 nanômetros. Utilize as medições de fluorescência adquiridas para calcular a razão na qual a contagem média de células de todos os poços de macrófagos ingênuos é definida como um, e então exporte essas razões para o software de análise Seahorse Wave.Para normalizar os dados, um ensaio de fluxo extracelular normalmente fornece as taxas de acidificação extracelular ou ECAR e a taxa de consumo de oxigênio, ou gráficos de OCR, como demonstrado nesta figura representativa após a injeção de glicose; o aumento observado no ECAR representa a taxa de glicólise. O aumento adicional observado no ECAR após a inibição da sintase de TP com oligomicina fornece mais informações sobre a reserva e a capacidade glicolítica. Ao analisar os valores de OCR, a injeção de CIN facilita o cálculo do consumo de oxigênio utilizado para a síntese mitocondrial de ATP, enquanto o FCCP desacopla a respiração mitocondrial.As medições correspondentes de OCR fornecem dados sobre a capacidade respiratória máxima e a capacidade respiratória de reserva; no entanto, a injeção de rotenona e antimicina A bloqueia os complexos mitocondriais um e três, sendo o OCR residual representativo do consumo de oxigênio não mitocondrial. A ativação de macrófagos com LPS induz um aumento do metabolismo glicolítico. As diferenças entre macrófagos tratados com LPS e IL-4 tornam-se ainda mais evidentes ao observar as taxas de consumo de oxigênio.De fato, embora o metabolismo oxidativo máximo seja altamente suprimido em macrófagos tratados com LPS, a IL-4 induz uma respiração robusta em macrófagos M2. Uma vez dominado, o ensaio de fluxo extracelular pode ser concluído em duas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de injetar vet juntamente com FCCP para alimentar a respiração máxima após o desacoplamento.Após esta técnica, ensaios adicionais, como o Eliza, podem ser realizados para avaliar a polarização eficiente de macrófagos. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem as características metabólicas de uma ampla gama de células imunes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise de fluxo extracelular para avaliar o fenótipo metabólico de macrófagos.

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Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

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