Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

O objetivo geral desta análise de fluxo extracelular é avaliar as características metabólicas de M1 e M virgens de dois macrófagos derivados da medula óssea polarizados. Este método pode servir como uma estrutura para investigar como citocinas, compostos ou códigos geno específicos afetam o fenótipo metabólico dos macrófagos. A principal vantagem desta técnica é que ela requer apenas uma pequena quantidade de macrófagos.

Além disso, mede todos os parâmetros relevantes de glicólise e mitocondriais em um único ensaio. Embora este método forneça informações sobre o fenótipo metabólico de macrófagos derivados da medula óssea, ele também pode ser aplicado a todos os tipos de macrófagos ou células imunológicas. Tivemos a ideia de publicar este método em J, pois frequentemente recebemos solicitações de outros cientistas para auxiliá-los em seus ensaios de fluxo celular de acesso metabólico No oitavo dia de cultura, verifique a presença de macrófagos maduros por inspeção visual e incube os macrófagos derivados da medula óssea madura em 10 mililitros de solução salina de citrato por cinco minutos.

A 37 graus Celsius quando as células se separaram. Lave a cultura com 10 mililitros de PBS e conte o número de células viáveis. Em seguida, semeie cinco vezes 10 elevado ao quarto de células por poço.

Em uma cultura de células XFE 96, microplaca em 100 microlitros de meio de cultura por poço, segurando a pipeta em um ângulo na metade da lateral de cada poço. Para dispensar as células, adicione apenas o meio aos poços de correção de fundo A um, A 12, H um e H 12. Em seguida, deixe as células assentarem à temperatura ambiente em uma capela de cultura de células por uma hora.

Depois de confirmar a cultura de adesão, as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5%. Três horas após o plaqueamento, estimular entre quatro a seis poços de células por condição, conforme apropriado, por 24 horas. Para polarizar os macrófagos derivados da medula óssea no dia anterior ao ensaio de fluxo extracelular, coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade e encha bem cada placa com 200 microlitros de solução de cinto.

Em seguida, abaixe o cartucho do sensor na placa de utilidade para submergir os sensores na solução de Cain e verifique se o nível da solução de Cain é alto o suficiente para manter o sensor submerso. Em seguida, coloque o cartucho em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova suavemente o sobrenadante dos macrófagos polarizados e lave as células com 100 microlitros de ensaio recém-preparado.

Médio por poço. Adicione 180 microlitros de meio de ensaio a cada poço e use o microscópio para verificar se as células não foram lavadas. Se as células ainda estiverem presas, coloque a placa na incubadora de dióxido de carbono sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora antes da execução do ensaio enquanto as células estão incubando.

Prepare 10 misturas de compostos de injeção conforme designado na tabela e aqueça as misturas a 37 graus Celsius. Em seguida, carregue o cartucho do sensor com os volumes apropriados de composto e portas A, B, C e D usando os guias de carregamento fornecidos para caracterizar a bioenergia dos macrófagos polarizados por ensaio de fluxo extracelular. Use o assistente de ensaio para criar um modelo de ensaio com tempos de mistura de dois minutos e de medição de três minutos e pelo menos três loops de medição de mistura e taxa antes de cada uma das quatro injeções e após a última injeção.

Em seguida, inicie o ensaio e siga as instruções indicadas pelo aparelho. Carregar a placa do cartucho com as sondas hidratadas para permitir a calibração pelo aparelho e pela placa celular. Quando instruído, no final do ensaio, descarte cuidadosamente todo o meio de ensaio e armazene a microplaca de cultura de células analisada a menos 20 graus Celsius até a normalização.

Para normalizar as células usando o kit de ensaio de proliferação celular, descongele a placa e incube as células em 200 microlitros de tampão de lise celular recém-preparado por poço por cinco minutos à temperatura ambiente. Finalmente, meça a fluorescência com cerca de 480 nanômetros de excitação e cerca de 520 nanômetros de emissão máxima. Usando as medições de fluorescência adquiridas para calcular a proporção na qual a contagem média de células de todos os poços de macrófagos ingênuos é definida em um, exporte essas proporções para o software de análise de ondas de cavalos-marinhos.

Para normalizar os dados, um ensaio de fluxo extracelular normalmente produzirá taxa de acidificação extracelular ou ECAR e taxa de consumo de oxigênio, ou gráficos de OCR conforme demonstrado nesta figura representativa após a injeção de glicose, o aumento observado no ECAR representa a taxa de glicólise. O aumento adicional observado no ECAR após uma inibição da TP sintase com toda a liga micina fornece mais informações sobre a reserva glicolítica e a capacidade. Ao analisar os valores de OCR, a injeção de CIN facilita o cálculo do consumo de oxigênio usado para a síntese mitocondrial de A TP, o FCCP desacopla a respiração mitocondrial.

As medições de OCR correspondentes fornecem dados sobre a podridão da capacidade respiratória máxima e sobressalente conhecida e a injeção de antimicina a, no entanto, bloqueiam os complexos mitocondriais um e três com o OCR residual representando o consumo de oxigênio não mitocondrial. A ativação de macrófagos com LPS induz um aumento do metabolismo glicolítico. Com as diferenças entre LPS e IL, quatro macrófagos tratados tornam-se ainda mais aparentes quando as taxas de consumo de oxigênio são observadas.

De fato, enquanto o metabolismo oxidativo máximo é altamente suprimido em macrófagos tratados com LPS, IL quatro induz uma respiração robusta em M dois macrófagos. Uma vez dominado, o ensaio extracelular da gripe pode ser concluído em duas horas se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de injetar veterinário junto com FCCP para alimentar a respiração máxima após o desacoplamento.

Após esta técnica, ensaios adicionais como Eliza podem ser realizados para avaliar a polarização eficiente de macrófagos. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia explorarem as características metabólicas de uma ampla gama de células imunológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise do fluxo extracelular para avaliar o fenótipo metabólico dos macrófagos.