Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como gerar de forma eficiente cardiomiócitos induzidos a partir de fibroblastos cardíacos com um construto MGT policrônico, expressando uma proporção ideal de GATA4, F2C e TBX5. Este método fornece uma plataforma valiosa para a pesquisa de cardiomiócitos induzidos e facilitará triagens de alto rendimento e estudos mecanicistas da programação de cardiomiócitos induzidos, além de impulsionar a área rumo a aplicações clínicas. A principal vantagem desta técnica é que, utilizando apenas um único construto retroviral, fibroblastos cardíacos podem ser eficientemente convertidos em cardiomiócitos.

Limpe o camundongo transgênico neonatal com GFP no gene da cadeia pesada da alfa miosina com etanol a 75% volume por volume. Realize eutanásia. Em seguida, abra a cavidade corporal fazendo uma incisão horizontal de baixo de uma axila até a outra, utilizando pinças estéreis, rombas e curvadas.

Disseque o coração e coloque-o em um poço de uma placa de 24 poços contendo gelo. PBS frio, observe a expressão de GFP em todo o coração utilizando microscopia de fluorescência. Coloque três a quatro corações positivos para GFP em uma placa de cultura de 60 milímetros com poço central usando pinça e tesoura estéreis e pique os corações em pequenos fragmentos menores que um milímetro cúbico.

Transfira os corações picados para uma placa de 10 centímetros e cubra com dois mililitros de meio fibroblasto ou meio FB. Deixe as placas em repouso por pelo menos três horas em um incubador a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione lentamente oito mililitros de meio FB pré-aquecido à placa contendo o tecido cardíaco picado.

Em seguida, incubar o tecido sem perturbação, exceto para trocar o meio a cada três dias. No sétimo dia, aspirar o meio de cultura e lavar as células com DPBS. Adicionar três mililitros de tripsina a 0,05% com EDTA a cada placa e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Adicione cinco mililitros de meio FB para desativar a tripsina e, em seguida, desprenda suavemente as células com um espátula celular. Em seguida, colete as células e filtre através de peneiras celulares de 40 mícrons para evitar contaminação com fragmentos de tecido cardíaco. Pelotize as células por centrifugação a 200 vezes G durante cinco minutos, começando com corações neonatais de camundongo isolados.

Corte cada coração em quatro pedaços que ainda estejam fracamente conectados. Transfira os corações para um tubo cônico de 15 mililitros contendo oito mililitros de tripsina EDTA 0,05% aquecida e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, descarte a tripsina EDTA e adicione cinco mililitros de colagenase tipo II aquecida, vortexe por um minuto em velocidade média e, em seguida, incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.

Em seguida, agite o tubo novamente por um minuto. Deixe os fragmentos de tecido sedimentarem e colete o sobrenadante em um novo tubo contendo cinco mililitros de meio FB frio. Adicione cinco mililitros de colagenase tipo dois fresca aos fragmentos de tecido e repita os passos de agitação e incubação.

Combine todos os sobrenatantes contendo células filtrando-os através de um estrainer de células de 40 micrômetros. Centrifugue essas células a 200 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após qualquer método de isolamento de fibroblastos cardíacos.

Lave o pellet final de células uma vez com 10 mililitros de tampão de triagem magnética ativada de células ou tampão máx. Remova 10 microlitros para contagem de células viáveis e centrifugue as células restantes a 200 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius para menos de uma vez 10 à sétima células. Re-suspenda o pellet celular com 10 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com thigh 1.2 em 90 microlitros de tampão máx gelado e misture.

Incube bem as esferas a quatro graus Celsius por 30 minutos. Para obter o pellet celular, adicione 10 mililitros de tampão max e centrifugue as amostras a 200 ×g por cinco minutos. Lave uma vez com 10 mililitros de tampão max e reconstitua o pellet celular em um volume total de dois mililitros em uma capela de cultura celular.

Configure um separador max e adicione uma coluna LS. Equilibre a coluna com três mililitros de tampão max. Passe a suspensão celular através da coluna LS e lave três vezes com dois mililitros de tampão max.

Em seguida, remova a coluna LS do separador e elua três vezes com dois mililitros de tampão max. Colete o EIT em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue o EIT a 200 × g durante cinco minutos.

Resuspenda os fibroblastos isolados em 10 mililitros de meio FB e conte as células; semeie as células em placas de cultura de tecidos em densidades apropriadas em uma placa de 24 poços pré-revestida com gelatina para reprogramar fibroblastos cardíacos. Adicione 500 microlitros de meio de cardiomiócito induzido ou meio ICM contendo poli cérebro a cada poço da placa de 24 poços semeada com células. Adicione 10 microlitros do retrovírus a cada poço contendo fibroblastos isolados.

Incube a placa com partículas retrovirais por 24 a 48 horas em uma estufa de cultura celular. Em seguida, substitua o meio contendo o vírus por 500 microlitros de meio ICM fresco, trocando o meio a cada dois ou três dias. Inicie a seleção positiva das células transduzidas pelo vírus suplementando o meio ICM com dois microgramas por mililitro de puromicina.

Após três dias de seleção, mude o meio para uma dose de manutenção de um micrograma por mililitro de puromicina para visualizar a conversão de fibroblastos cardíacos em cardiomiócitos. Observe as placas selecionadas com puromicina quanto à expressão de GFP utilizando um microscópio invertido. Por fim, 14 dias após o tratamento viral, substitua o meio ICM pelo meio B 27.

Lócus de células com batimento espontâneo moderado podem aparecer de três a quatro semanas após a transdução viral, com expressão de marcadores cardíacos, incluindo troponina cardíaca T e alfa. A actinina pode ser detectada por imunoquímica entre os dias 10 e 14. Aqui, a expressão de troponina cardíaca T é observada nas CMI convertidas a partir de fibroblastos, que expressam GFP. A expressão de alfa actinina nas CMI pode ser vista aqui.

A análise por citometria de fluxo mostra aumentos semelhantes na expressão da troponina T cardíaca, especialmente após a seleção com puromicina de cardiomiócitos induzidos. A metodologia descrita aqui permite a geração eficiente de cardiomiócitos induzidos com base na entrega retroviral de fatores de transcrição NGT em um único construto.