Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como gerar eficientemente cardiomiócitos induzidos a partir de fibroblastos cardíacos com uma construção MGT policiônica, expressando uma proporção ideal de gata quatro, F dois C e TBX cinco. Este método fornece uma plataforma valiosa para a pesquisa de cardiomiócitos induzidos e facilitará estudos mecanicistas de pós-triagem e programação de cardiomiócitos induzidos, ao mesmo tempo em que move o campo para aplicações clínicas. A principal vantagem dessa técnica é que, usando apenas uma única construção retroviral, os cardiofibroblastos podem ser convertidos com eficiência em cardiomiócitos.

Limpe o camundongo transgênico GFP de cadeia pesada de alfamiosina neonatal com 75% de volume a volume. O etanol realiza a eutanásia. Em seguida, abra a cavidade corporal fazendo uma incisão horizontal de uma axila à outra usando uma pinça estéril, romba e dobrada.

Disseque o coração e coloque-o em um poço de um prato de 24 poços contendo gelo. O PBS frio observa a expressão de GFP em todo o coração usando microscopia de fluorescência. Coloque três corações positivos 4G FP em um prato de cultura de poço central de 60 milímetros usando uma pinça e tesoura estéreis, pique os corações em pedaços pequenos com menos de um milímetro cúbico.

Transfira os corações picados para um prato de 10 centímetros e cubra com dois mililitros de fibra Deixe as placas intactas por pelo menos três horas em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione lentamente oito mililitros de meio FB pré-aquecido ao prato que contém o tecido cardíaco picado.

Em seguida, incube o tecido sem perturbação, exceto para trocar o meio a cada três dias. No sétimo dia, aspire o meio de cultura e lave as células com DPBS. Adicione três mililitros de 0,05% de viagens em EDTA a cada placa e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Adicione cinco mililitros de meio FB para desativar a tripsina e, em seguida, retire suavemente as células com um raspador de células. Em seguida, colete as células e filtre através de filtros de células de 40 mícrons para evitar a contaminação com fragmentos de tecido cardíaco. Pulverize as células por centrifugação a 200 vezes G por cinco minutos, começando com corações isolados de camundongos neonatais.

Corte cada coração em quatro pedaços que ainda estão frouxamente conectados. Transfira os corações para um tubo cônico de 15 mililitros contendo oito mililitros de 0,05% de tripsin quente em EDTA e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, descarte as tripsinas EDTA e adicione cinco mililitros de vórtice de colagenase tipo dois quente por um minuto em velocidade média e, em seguida, incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.

Em seguida, vórtice o tubo novamente por um minuto. Deixe os pedaços de tecido assentarem e colete o sobrenadante em um novo tubo contendo cinco mililitros de meio FB frio. Adicione cinco mililitros de colagenase fresca tipo dois aos pedaços de tecido e repita as etapas de vórtice e incubação.

Combine todas as células contendo sobrenadantes, filtrando-as através de um filtro de células de 40 mícrons. Centrifugue essas células a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Seguindo qualquer um dos métodos de isolamento de fibroblastos cardíacos.

Lave o pellet de célula final uma vez em 10 mililitros de classificação de célula ativada magnética ou tampão máximo. Remova 10 microlitros para contagem de células vivas e centrifugue as células restantes a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius por menos de uma vez 10 elevado às sétimas células. Ressuspenda o pellet celular com 10 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas coxa 1.2 em 90 microlitros de tampão máximo resfriado e misture.

Bem, incube as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos. Para peletar as células, adicione 10 mililitros de tampão máximo e centrifugue as amostras a 200 vezes G por cinco minutos. Lave uma vez com 10 mililitros de tampão máximo e ressuspenda o pellet celular em um volume total de dois mililitros em uma capa de cultura de células.

Configure um separador máximo e adicione uma coluna LS. Equilibre a coluna com três mililitros de buffer máximo. Passe a suspensão celular pela coluna LS e lave três vezes com dois mililitros de tampão máximo.

Em seguida, remova a coluna LS do separador e elua três vezes com dois mililitros de tampão máximo. Recolha do EIT em tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar o EIT a 200 vezes G durante cinco minutos.

Ressuspenda os fibroblastos isolados em 10 mililitros de meio FB e conte as células, semeie as células em placas de cultura de tecidos em densidades apropriadas em uma placa de gelatina pré-codificada de 24 poços para reprogramar os fibroblastos cardíacos. Adicione 500 microlitros de cardiomiócito induzido ou meio ICM contendo poli cérebro a cada poço das placas de 24 poços assentadas com células. Adicione 10 microlitros do retrovírus a cada poço de fibroblastos isolados.

Incubar a placa com partículas retrovirais durante 24 a 48 horas numa incubadora de cultura de células. Em seguida, substitua o meio contendo vírus por 500 microlitros de meio ICM fresco, trocando o meio a cada dois ou três dias. Iniciar a seleção positiva das células transduzidas virais suplementando o meio ICM com dois microgramas por mililitro de pur micina.

Após três dias de seleção, mude o meio para uma dose de manutenção de um micrograma por mililitro de pur micina para visualizar a conversão de fibroblastos cardíacos em cardiomiócitos. Observe as placas selecionadas pur mycin para expressão de GFP usando um microscópio invertido. Finalmente, 14 dias após o tratamento viral, substitua o meio ICM por B 27.

Os loci celulares de batimento espontâneo médio podem aparecer três a quatro semanas após a expressão da transdução viral de marcadores cardíacos, incluindo troponina t e alfa cardíacas. A actinina pode ser detectada por imunoquímica nos dias 10 a 14. Aqui, a expressão de troponina T cardíaca é vista no I CMS convertido de fibroblastos, que expressam a expressão de GFP alfa actinina nos ICMs pode ser vista aqui.

A análise por citometria de fluxo mostra aumentos semelhantes na expressão de troponina T cardíaca, especialmente após a seleção de cardiomiócitos induzidos por micina pura. A mitologia descrita aqui permite a geração eficiente de cardiomiócitos induzidos com base na entrega retroviral de fatores de transcrição NGT em uma única construção.