Name: Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu) 6 tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em E. coli (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a purificar e redobrar a proteína recombinante Shadoo expressa em corpos de inclusão em E. coli. Este método cromatográfico permite obter fibrilas amiloides para estudo de desordens conformacionais proteicas.

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Os autores gostariam de agradecer a Natalie Doude e David Westerway (Universidade de Alberta) por nos fornecerem Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) pela construção de plasmídeos, Michel Brémont (INRA) por nos fornecer bactérias BL21Sol; Christine Longin (INRA) pela assistência TEM e Edith Pajot-Augy (INRA) pelos comentários e revisão.

1. Produção de plasmídeo e Shadoo Expressão Nota: O gene que codifica a proteína de murino Shadoo (Shadoo 25-122), foi subclonado no vector de expressão pET-28 11. Este clone foi usado para transformar E. SoluBL21 coli estirpe bacteriana, para expressar a proteína Shadoo com uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), como explicado anteriormente 11. O plasmídeo pode ser solicitado dos autores. O peso molecular calculado a partir da Shadoo sua sequência de aminoácidos é 12,243.2 Da. Nota: Executar todas as manipulações com bactérias sob uma capela de fluxo laminal ou perto de Bunsen chama. <ol><li> Transformar bactérias competentes SoluBL21 com o pET-28-Sua 6 -Shadoo plasmídeo, usando um protocolo de choque térmico padrão. Para esta mistura de 1 a 5 ul do plasmídeo (tipicamente de 10 a 100 pgng) em 50 ul de as bactérias num tubo. Realizar a choque térmico a 42 ° C durante 45 seg. </li><li> Cultura de bactérias transformadas a 37 ° C até 600 um de 0,5-0,7 em meio de Luria Bertani suplementado com 40 mg / ml de canamicina (Figura 1B). </li><li> Shadoo induzir expressão O / N através da adição de 240 ug / ml de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido, ITPG, para a cultura. As bactérias de cultura sob agitação a 150 rpm a 37 ° C. Nota: Normalmente, cultura bacteriana alcança A 600, de 3 de O / N. Nota: Transformado bactérias podem ser armazenadas a -80 ° C para a produção de proteína futuro. Para isso, adicionam-se 10% -50% (v / v) de glicerol estéril em alíquotas de culturas bacterianas e congelá-las a -80 ° C. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de Shadoo construção de expressão, transformação de bactérias e de indução de expressão Shadoo (tal como descrito no passo 1). </strong&gt; (A) A construção de expressão para Shadoo codifica uma marca de hexa-histidina fundida com o N-terminal da proteína, Nt. O esquema mostra que a proteína contém repetições Shadoo básicos arginina / glicina (cilindro verde), um domínio hidrófobo (HD), e um único local de N-glicosilação (CHO), seguido por um terminal-C (TC). (B) 28 pET-6-His -Shadoo plasmídeo é transformado em bactérias SoluBL21 por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C. Bactérias transformadas são plaqueadas em placas de agar selectivo que continha 40 ug / ml de canamicina. Uma única colónia da placa é utilizada para inocular um cultura num frasco agitador de 1.000-3.000 ml. A expressão da proteína recombinante é induzida com IPTG 1 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Purificação de Proteínas Shadoo por Cromatografia Líquida de Baixa Pressão (LPLC) <ol><li> A lise celular e Emcorpos conclusão preparação <ol><li> Recolha a suspensão bacteriana e transferi-la para dentro de tubos de centrifugação (Figura 2). </li><li> Rotação a 2.500 xg, durante 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante por decantação e pelotas ressuspender em 15 ml de tampão (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8, com anti-proteases) para cada sedimento derivado de 500 ml de cultura de células. Nota: Os sedimentos ressuspensos podem ser congeladas e armazenadas a -20 ° C durante vários dias. Congelamento facilita a lise de células bacterianas. </li><li> Verifique a sobre-expressão de proteína recombinante utilizando bactérias peletes bruto por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie. <ol><li> Para isso, de centrífuga de 1 ml de cultura bacteriana para sedimentar as células. Adicionar 100 ul de solução de desnaturação de Laemmli (277,8 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% de SDS, 44,4% w / v de glicerol, 0,02% azul de bromofenol) para sedimentar e aquece-se a 100 ° C durante 5 min. </li><li> Carga de 10 ul da amostra num gel de acrilamida a 12%, executar SDS-PAGE e visuAlize proteínas separado por coloração com Coomassie. </li></ol></li><li> Adicionar Triton X-100 a 0,5% de concentração final para o sedimento completamente ressuspenso de 2.1.2). </li><li> Incubar a suspensão em banho de água a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Sonicar a suspensão durante 5 minutos a 6-12 microns amplitude pico-a-pico em água gelada para lisar células bacterianas. </li><li> Transferência suspensão sonicada em 50 ml de tubos de centrifugação limpas. </li><li> Tubos de centrifugação a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante por decantação e adicionam-se 5 ml de tampão de ligação (tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M, 5 mM de imidazole) por tubo. </li><li> Colocar os tubos na roda girando O / N para proteínas a partir de corpos de inclusão voltar a suspender completamente. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de purificação de inclusãocorpos (tal como descrito no passo 2.1). transformadas que expressam Shadoo bactérias são colhidas por centrifugação e ressuspensas no tampão de lise. A suspensão é incubada a 37 ° C durante 30 min e, em seguida sonicada para romper mecanicamente células bacterianas. A sonicação é feito em gelo para evitar o aquecimento da amostra. Quebrados células são colhidas por centrifugação e ressuspensas num tampão contendo 8 M ureia para solubilizar proteínas a partir de corpos de inclusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Cromatografia em Ni 2+ -affinity Nota: A cromatograf ia é realizada no FPLC usando um Sistema de Ni 2+ -charged, 5 ml de Sepharose quelante (Figura 3A). Todas as soluções são carregados na coluna com um caudal de 1 mL / min. <ol><li> Injectar 10 ml de solução 4 M Niso água de 0,2 para a coluna de Sepharose, a fim de carregá-lo-ions com Ni 2+. </li><li> Equilibrar a coluna carregada com Ni 2+ -ions por injecção de 30-50 ml de tampão de ligação contendo uma baixa concentração de imidazolo (tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M, 5 mM de imidazole). </li><li> Coloque as proteínas solubilizadas-ureia com um dispositivo de injecção de 50 ml. </li><li> Recuperar a fracção de fluxo mediante a lavagem da coluna com 10 ml de tampão de baixa concentração de imidazole de ligação (tampão Tris-HCl a 20, pH 7,4, 0,5 M de NaCl, 8 M de ureia, mM de imidazole 5), a fim de remover um máximo de proteínas não ligadas a partir da coluna. </li><li> Lava-se a coluna com 50-100 ml do tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, ureia 8 M, imidazol 80 mM) para eluir as proteínas não especificamente ligadas à coluna. </li><li> Aplicar um gradiente linear de 15 min de imidazolo 80-800 mM no tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M. Recolher fracções de 1 ml durante a aplicação do gradiente. Nota: proteínas-His-tag são eluídos sagacidadegradiente ha de tampão contendo imidazole (utilizado como competidor). </li><li> Tomar uma alíquota de 8 mL de cada fração e adicione 4 mL solução de desnaturação 4x Laemmli (ver 2.1.3.1). Soluções de aquecer a 100 ° C durante 5 min. </li><li> Carga de 10 ul de marcador de tamanho de proteína e 10 ul de cada amostra para o gel de acrilamida a 12%, executar SDS-PAGE e visualizar as proteínas separadas por coloração com Coomassie. Nota: O peso molecular calculado de Shadoo formar a sua sequência de aminoácidos é 12,243.2 Da. </li><li> Piscina todas as fracções contendo Shadoo. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> Figura 3. Procedimento de purificação (tal como descrito nos passos 2,2-2,4). (A) Ni2 + -ions pode ser coordenado por resíduos de histidina, que permite a purificação selectiva de proteínas marcadas com poli-histidina. Imidazole é utilizado para eluir a proteína, atravéssua capacidade para coordenar com o Ni 2+ -ion e deslocar a proteína ligada. (B) As proteínas de diferentes raio hidrodinâmico que foram retidas na Ni 2+ -column são separados numa coluna de exclusão de tamanho. As proteínas são eluídas a partir da maior para os mais pequenos. (C) antes de usar, as fracções contendo Shadoo são reunidas e dessalinizadas para remover a ureia, imidazol e os seus sais. Os ensaios de controlo de qualidade incluem SDS-PAGE / coloração com Coomassie, Western blotting. Purificada Shadoo pode ser liofilizado. Liofilizado Shadoo é estável durante meses, quando armazenadas a -20 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> A cromatografia de exclusão de tamanho Nota: Um segundo passo de purificação consiste na cromatografia de exclusão de tamanho que separa proteína Shadoo das outras proteínas co-eluídas no primeiro passo de purificação(Figura 3B). <ol><li> Equilibrar coluna Superdex de 120 ml de volume total do leito através da injecção de 250 ml de tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M a uma taxa de fluxo de 1,5 ml / min. </li><li> Carregar fracções reunidas contendo a partir de 2.2.9 Shadoo na coluna equilibrada. Recolher fracções de 1 ml após o volume vazio da coluna de 40 ml sobre o fluxo constante do tampão anterior. </li><li> Tomar uma aliquota de 10 ul de cada fracção e realização de uma análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie, tal como descrito acima para saber quais as fracções contêm Shadoo. </li><li> Piscina fracções contendo Shadoo. </li></ol></li><li> Dessalinização Nota: A dessalinização procedimento remove os sais, ureia e imidazole para se obter a proteína recombinante Shadoo num tampão adequado para estudos bioquímicos e biofísicos (Figura 3C). O mesmo resultado pode ser obtido por diálise contra o tampão de amostras. <ol><li> Equilibrar uma coluna de dessalinização de 53 ml com 150 mlde tampão de acetato de amónio 10 mM, pH 5, a uma taxa de fluxo de 5 ml / min. </li><li> Carga reunidas fracções Shadoo na coluna. Após a injecção do tampão acetato de amónio recolher manualmente fracções que mostram um aumento do sinal a 280 nm na saída do detector de UV. </li><li> Liofilizar a Shadoo dessalinizada e armazená-lo a -20 ° C. </li><li> Dissolver Shadoo liofilizado num tampão adequado, o tampão de acetato de sódio tal como 10 mM, pH 5, antes da utilização. Nota: A etiqueta de poli-histidina pode ser removida com enteroquinase. </li></ol></li></ol> 3. In Vitro Montagem dos Shadoo em amilóide fibrilas no pH fisiológico Nota: Os agregados proteicos Shadoo e espontaneamente forma fibrilhas a pH ≥ 7 11. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema da Shadoo redobragem para fibrilas amilóides (como descricama no passo 3). Purificada Shadoo converte-se espontaneamente para fibrilas amilóides quando dissolvido em tampão de pH 7. ≥ numa solução ácida, Shadoo converte em fibrilas amilóides após incubação com 1 M Gdn-HCl enquanto se agita. Os ensaios de controlo de qualidade incluem microscopia eletrônica e coloração TT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Diluir Shadoo para uma concentração final de 2 ^ M num tampão 20 mM Tris-HCl, pH 7,4. Medir a concentração, medindo a densidade óptica da solução a 280 nm e utilizando o coeficiente de extinção deduzida a partir da composição de aminoácidos Shadoo de 20.970. </li><li> Incubar 500 ul da solução em um tubo de plástico cónico a 4 ° C durante um par de semanas, para permitir a conversão de proteína espontânea de estruturas amilóides (Figura 4). </li><li> Add preparados na hora tioflavina T (TT) para um conce definitivantration de 10 uM a uma alíquota de 100 ul da solução Shadoo. Incubar a solução durante 5 min à TA. Medir emissão de fluorescência a partir de 460 a 520 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 435 nm, para verificar a presença de estruturas amilóides 17. </li></ol> 4. In Vitro Montagem dos Shadoo para amilóide fibrilas no ácida pHs <ol><li> Diluir Shadoo em 1 M GdnHCl, tampão de 20 mM de acetato de Na, pH de 5 a uma concentração final de 2 ^ M. </li><li> Incubar 500 ul desta solução num tubo cónico com agitação contínua a 37 ° C, durante 3-7 dias. </li><li> Verifique a presença de fibrilhas amilóides por adição de TT a uma alíquota da solução como em 3.3. </li><li> Dialisar suspensão obtida contra tampão de 10 mM de acetato de Na, pH 5,0, para purificar Shadoo fibrilas amilóides. </li><li> Armazenar fibrilas purificada a 4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; As fracções de proteína Figura 5. Os resultados representativos. Eluídas a partir da coluna carregada com Ni2 + quelante (A) e uma coluna de exclusão de tamanho (B) foram analisadas usando SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Identificação de Shadoo purificada foi avaliada utilizando anticorpo anti-Shadoo SPRN (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+at+the+crossroads+of+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Prion protein at the crossroads of physiology and disease.</a> Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).</li>
<li>Colby, D. W., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">De novo generation of prion strains.</a> Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435, 773-778 (2005).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+amyloid+formation+and+membrane+interaction+with+amyloidogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).</li>
<li>Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+of+lipid-prion+interactions%3A+insights+on+charge+effect%2C+Cu%28II%29-ions+binding+and+prion+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).</li>
<li>Watts, J. C., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion+protein+family%3A+diversity%2C+rivalry%2C+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).</li>
<li>Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PrP-like+proteins+Shadoo+and+Doppel%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The PrP-like proteins Shadoo and Doppel.</a> Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).</li>
<li>Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+versus+doppel+protein+misfolding%3A+new+insights+from+replica-exchange+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations.</a> Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).</li>
<li>Daude, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Shadoo+proteins+convert+to+amyloid-like+forms+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions.</a> Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadoo+binds+lipid+membranes+and+undergoes+aggregation+and+fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CNS+glycoprotein+Shadoo+has+PrP%28C%29-like+protective+properties+and+displays+reduced+levels+in+prion+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections.</a> The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-resistant+prions+selectively+decrease+Shadoo+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002382(2011).</li>
<li>Westaway, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Shadoo+in+prion+infections+traces+a+pre-clinical+event+inversely+related+to+PrP%28Sc%29+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002391(2011).</li>
<li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PB1-F2+influenza+A+virus+protein+adopts+a+beta-sheet+conformation+and+forms+amyloid+fibers+in+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).</li>
<li>Tarus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+paths+of+the+nucleoprotein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus.</a> Biochimie. 94, 776-785 (2012).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+Thioflavin-T+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).</li>
<li>Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+system+as+a+screening+tool+for+pharmacological+assessment+of+g+protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors.</a> Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).</li>
<li>Schein, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cool+way+to+make+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cool way to make proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+genetic+strategies+for+recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+glycosylation+enhances+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation+of+Shadoo+in+Scrapie-infected+rodents+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells.</a> Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).</li>
<li>Englund, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+biosynthesis+of+glycosyl+phosphatidylinositol+protein+anchors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors.</a> Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).</li>
<li>Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPI-anchoring+of+PrP%3A+implications+in+sorting+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis.</a> Prion. 8, 11-18 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um protocolo de fácil e eficiente tanto para expressão e purificação de uma grande quantidade de proteína recombinante de ratinho Shadoo é apresentado. O método descrito permite a solubilização e purificação bem sucedida de (His 6) tagged Shadoo proteína recombinante. É importante, tal como referido no título, que quando expresso em uma bactéria procariota E. Shadoo coli acumula-se em corpos de inclusão. Antes da purificação Shadoo, as bactérias têm que ser lisadas por sonicação em um tampão...

Doenças neurodegenerativas causadas por príons, que incluem a encefalopatia espongiforme bovina em bovinos, scrapie em ovinos ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos, são fatal e incurável. Prion doenças são caracterizadas por mudanças conformacionais da proteína príon celular composta principalmente de hélices, no-β-sheet cruz enriquecido amilóide conformer 1,2. Cross-beta-estruturas contêm densamente embalado e beta-folhas-cristalinos como altamente ordenadas estabilizado com ligações de hidrogênio 3,4. Amyloids Príon se auto-replicar devido aos beta-fios na borda crescente que fornecem um modelo para recrutar e converter uma unidade de proteína monomérica. De acordo com a hipótese do &quot;única proteína&quot;, o conformador de proteína amilóide prião é o agente infeccioso único. No entanto, algumas outras biomoléculas têm sido propostos como sendo essencial para distúrbios do prião. Por exemplo, as membranas celulares são pensados ​​para ser um lugar onde conversiocorre e em alguns lípidos carregados negativamente têm sido mostrados para melhorar o processo de conversão de 5,6. Além disso, algumas proteínas também podem estar envolvidos em patologias prião. Especificamente, existem dois outros membros da família de proteínas prião: Duplo e Shadoo 7,8. Doppel tem uma estrutura relativamente rígida estabilizado com pontes de di-sulfureto e não autopolimerização, e agregada para fibrilas amilóides 9. Em contraste, semelhante à da proteína do prião, Shadoo pode adoptar uma estrutura β folhas enriquecido e auto-associar-se em estruturas de fibrilas amilóides. Foi demonstrado que pode Shadoo fibrilar em condições nativas ou sobre as membranas carregadas negativamente 10,11 ligação. Conversão de Shadoo em fibras de amilóide-like pode ser associada com patologias. Com efeito, os mecanismos pelos quais as estruturas amilóides como causam a doença são mal compreendidos. Shadoo tem um domínio hidrofóbico (HD) e uma série de conjunto Arg / Gly repete t semelhanteO a parte N-terminal da proteína do prião (Figura 1A). À medida que a parte N-terminal da proteína do prião, Shadoo é altamente carregada positivamente e parece ser uma proteína nativa desestruturado 11,12. Shadoo parece ser funcionalmente relacionados com distúrbios do prião, uma vez que se pode ligar directamente a proteína prião. Além disso, a sua expressão é regulada negativamente durante prião patologia 13,14. No entanto, o papel de Shadoo na doença do prião ainda não foi estabelecido. Foi desenvolvido um plasmídeo que transporta a sequência de codificação do gene de rato Shadoo. O plasmídeo foi usado para transformar E. coli para a produção de N-terminal His Shadoo 6 fusão. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e é comumente usado em nossos projetos em andamento 6,15,16. Um problema importante para a expressão de Shadoo é a escolha da E. estirpe de E. coli. Enquanto BL21 competente estirpe bacteriana é geralmente utilizado para a expressão de pró recombinanteteínas Shadoo foi expressa e purificada a partir da estirpe única bacterianas transformadas com sucesso SoluBL21. SoluBL21 E. competente coli é um mutante melhorada da estirpe BL21 de acolhimento desenvolvido para a produção de proteínas cuja expressão na estirpe BL21-mãe deu nenhum produto detectável solúvel. Expressão de alto nível de Shadoo em SoluBL21 E. coli conduz a acumulação da proteína em corpos de inclusão. Como uma característica geral, quando uma proteína não nativa é altamente expressa em E. coli, esta proteína tende a acumular-se em corpos de inclusão insolúveis. Shadoo agrega provavelmente através de interacções não covalentes ou iónicas hidrofóbicas (ou uma combinação de ambos) para estruturas dinâmicas altamente enriquecidos formadas pela proteína dobrada para vários graus. Em consequência, a purificação compreende pelo menos dois passos: (i) uma separação selectiva da proteína a partir de outras biomoléculas em um meio de desnaturação, e (ii) uma renaturação da proteína purificada utilizando na dobragem in vitrotécnicas. A separação selectiva de Shadoo foi conseguida numa solução tampão contendo ureia 8M (ou, alternativamente, 6M guanidina-HCl). A remoção da ureia e a renaturação da proteína pode ser realizada por aplicação de vários protocolos de: (i) renaturação em uma solução de pH ácido para se obter uma proteína Shadoo monomérica desestruturado, ou (ii) renaturação em uma solução de pH ≥ 7 para se obter Shadoo polimerizado em fibras de amilóide estáveis ​​com motivos característicos cross-β-folha.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60</td><td>Superdex GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Coluna de dessalinização</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Competente E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de Coquetel Inibidor de Protease</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>marcador de tamanho de proteína&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante shadoo expresso como corpos de inclusão em<em&gt; e. coli</em

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

O sistema de expressão de Escherichia coli é uma ferramenta poderosa para a produção de proteínas eucarióticas recombinantes. Nós usá-lo para produzir Shadoo, uma proteína pertencente à família de prião. Um método de cromatografia para a purificação de (His) 6 tagged Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão é descrito. Os corpos de inclusão solubilizados em ureia 8 M e ligado a uma coluna de Ni 2+ -charged para realizar cromatografia de afinidade de iões. As proteínas ligadas são eluidas com um gradiente de imidazole. As fracções contendo proteína Shadoo são submetidas a cromatografia de exclusão de tamanho para obter uma proteína altamente purificada. No passo final é purificado Shadoo dessalinizada para remover os sais, ureia e imidazole. Shadoo proteína recombinante é um reagente importante para estudos bioquímicos e biofísicos de distúrbios conformação da proteína que ocorrem nas doenças de priões. Muitos relatórios demonstraram que as doenças neurodegenerativas priões são originários da deposição de facadale, ordenou fibrilas amilóides. Protocolos de exemplo que descrevem como fibrilar Shadoo em fibrilas amilóides no ácido e neutro / pHs básicos são apresentados. Os métodos de como produzir e fibrilar Shadoo pode facilitar a investigação em laboratórios que trabalham com doenças de príon, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteína de uma maneira rápida e de baixo custo.

Cerca de 5-10 mg de proteína Shadoo purificado é obtido por litro de cultura bacteriana. A purificação em duas fases é necessário para obter Shadoo recombinante de elevado grau de pureza. A primeira etapa é realizada por cromatografia de afinidade com uma coluna de Ni 2+ -charged que conserva as suas-proteínas marcadas. As fracções eluídas são sujeitas a SDS-PAGE e corados com Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). As fracções que contêm proteína são reunidas e Shadoo adicionalmente purificado...

Um método cromatográfico de duas etapas é descrito para a purificação da proteína Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão em Escherichia coli, bem como um protocolo para fibrilar Shadoo purificado em estruturas amilóides.

Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

O objetivo geral deste procedimento é purificar uma proteína shadu recombinante expressa como corpos de inclusão em Esia coli e refoldá-la em fibrilas amiloides. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo dos mecanismos moleculares de distúrbios conformacionais de proteínas, como os que ocorrem em doenças pré. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a produção de grandes quantidades de proteína de forma rápida e de baixo custo. Para transformar bactérias competentes solu BBL 21 com o plasmídeo PET 28, his seis SHADU, misture 10 a 100 picogramas de plasmídeo ou um a cinco microlitros em 50 microlitros de bactérias em um tubo.Submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 45 segundos. Adicione meio LB suplementado com 40 miligramas por mililitro de canamicina e bactérias e cultive. Incube as bactérias transformadas a 37 graus Celsius até que alcancem uma absorbância de 0,5 a 0,7 a 600 nanômetros, induza a expressão do gene de interesse pela adição de 240 microgramas por mililitro de IPTG e continue a cultura.As bactérias a 37 graus Celsius e 150 RPM durante a noite. Para purificar a proteína, transfira a suspensão bacteriana para tubos de ce

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Biology

Biologia

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de...

Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Análises bioquímicas e estruturais das proteínas glicosilados requerem relativamente grandes quantidades de amostras homogêneas. Aqui, apresentamos um método químico eficiente para site-specific glicosilação de proteínas recombinantes purificado a partir de bactérias pela segmentação reativa Cys tióis.

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Expressão e purificação de proteínas contendo domínio de fumarilacetoacetato hidrolase é descrita com exemplos (expressão em E. coli, FPLC). As proteínas purificadas são utilizadas para a cristalização e produção de anticorpos e empregadas para ensaios enzimáticos. Os ensaios fotométricos selecionados são apresentados para exibir a multifuncionalidade de FAHD1 como oxaloacetato descarboxilase e acylpyruvate hydrolase.

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Aprenda a purificar e redobrar a proteína recombinante Shadoo expressa em corpos de inclusão em E. coli. Este método cromatográfico permite obter fibrilas amiloides para estudo de desordens conformacionais proteicas.

Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu) 6 tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em E. coli (Vídeo) | JoVE Journal

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