Name: Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a cultivar comunidades fotossintéticas de alta densidade em um biorreator inovador para tratamento de efluentes. Este método elimina a necessidade de separação externa e facilita a produção de biomassa algal em larga escala.

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Os autores gostariam de agradecer a Aspen Walker, da Universidade da Pensilvânia, por sua assistência na manutenção do reator e coleta de amostras.

1. Assembleia Reactor <ol><li> Dispor os componentes do reactor de acordo com o esquema na Figura 1. <ol><li> Coloque o reactor (R) em uma placa de mistura, adicionar uma barra de agitação para o reactor. Coloque o tanque de reciclagem (RT) ao lado da placa de agitação e o reactor de modo que a porta de efluente (topo) do reservatório é dirigida para a borda da bancada do laboratório. </li><li> Coloque o recipiente de resíduos (W) por baixo da porta de efluente (topo) do tanque de reciclagem (RT). Coloque o tanque de alimentação (FT) ao lado do tanque de reciclagem (RT). Nota: O tanque de alimentação tem uma capacidade total de 5 L. </li></ol></li><li> Prenda o reactor (R) contra a inclinação com um stand de tamanho adequado e grampo. Da mesma forma, assegurar o tanque de reciclagem (RT) para impedir o movimento. </li><li> Insira neoprene tubulação bomba peristáltica na reciclagem (Bomba A) e alimentá-cabeças (Bomba B) da bomba. Consulte a tabela de especificações de materiais para tubos adicionais. Instale as cabeças de bomba para as unidades de bomba com o provi parafusosded com as unidades de bomba. </li><li> Conecte tubagem da bomba A para as portas no reactor e o tanque de reciclagem. Insira a extremidade do tubo de bomba B para o tanque de alimentação e o tanque de reciclagem. Ligue a porta reactor superior ao tanque de reciclagem com tubulação. Aplicar grampos para o tubo do reactor nos portos. Nota: comunidades fotossintéticas podem beneficiar de iluminação artificial fornecida por lâmpadas. </li></ol> 2. Preparação das soluções de reserva, Soluções Influente / alimentação, e Algas Inoculante <ol><li> Preparar a solução estoque mineral. Adicionar o seguinte a um balão volumétrico de 1 L com 500 ml de água desionizada: 200 g de bicarbonato de sódio, 40 g de fosfato monobásico de potássio, sulfato de magnésio 4 g, 4 g de cloreto férrico, cloreto de cálcio 4 g, 1 g de cloreto de cobre, 1 g de cobalto hexa-hidrato de cloreto de, 1 g de hexa-hidrato de cloreto de níquel, 1 g de sulfato de zinco hepta-hidratado. Adicionar um adicional de 400 ml de água deionizada. Agite vigorosamente para incentivar a dissolução de sais. Seguindo Dissolução de sais, adicionar água desionizada para levar o volume total da solução para 1 L. </li><li> Prepare a solução de amônia. Em um balão volumétrico de 1 L, dissolve-se 38.214 g de cloreto de amónio em aproximadamente 900 ml de água desionizada. Após dissolução, adicionar água desionizada para levar o volume total até 1.000 ml. Nota: 1 ml de solução de estoque diluído para 1 L produz uma 10 mg L-1 NH4 + -N solução. </li><li> Preparar a solução de nitrato. Em um balão volumétrico de 1 L, dissolve-se 72,413 g de nitrato de potássio em cerca de 900 ml de água desionizada. Após dissolução, adicionar água desionizada para levar o volume total até 1.000 ml. Nota: 1 ml de solução de estoque diluído para 1 L produz uma 10 mg L-1 NO 3 - -N solução. </li><li> Prepare solução de alimentação / afluente. Para fazer uma solução de alimentação contendo 20 mg L-1 + -N NH 4 e 20 mg L-1 NO 3 - -N, dilui-se 2 ml de umasolução estoque mmonia e 2 ml de solução de nitrato ao volume total de 1 L. Antes da diluição, adicionar 0,5 ml de solução mineral / L de solução a ser feita. Prepare 5 L de influente no total para o arranque do reactor. </li><li> Prepara-se o inoculante algas. <ol><li> Recolher um volume grande (pelo menos de 10 L) de água a partir de uma massa de água que contém algas, tais como uma corrente ou tanque. Permitir que as algas para resolver, deixando as amostras de água em repouso por 24 horas. </li><li> Decantar e rejeitar o claro (não contendo algas) de água na parte superior das amostras, deixando uma suspensão de algas concentrada dentro dos frascos de amostras. Combinar a suspensão de algas a partir de todas as amostras em um recipiente e repetir a sedimentação e passos de decantação. </li><li> Medir a biomassa no interior da amostra concentrada. <ol><li> Seca-se um filtro de papel sob vácuo (filtro de vácuo de 0,45 um MCE) de alumínio e pesar barco O / N em um forno que tenha sido definido a 103 ° C Depois de arrefecimento num exsicador durante 30 min à TA medir a combined massa do filtro e pesar barco. </li><li> Filtro de vácuo 20 ml de suspensão concentrada de algas e devolver o filtro e pesar barco para forno para secar S / N. </li><li> Medir a massa combinada do filtro e pesar barco. Calcula-se a densidade de biomassa no interior da amostra concentrada. Nota: O volume total da amostra de água que os investigadores terá de recolher dependerá da massa de água fonte. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Sementeira e iniciando o Reactor <ol><li> Adicionar 750 ml de solução de alimentação para o reactor. Encha o tanque de reciclagem com 500 ml de solução de alimentação. </li><li> Usar uma pipeta longa para adicionar suavemente uma suspensão inoculante contendo 1,5 g de algas perto da parte inferior do reactor. Permitir que o inoculo para assentar no fundo do reactor, assegurar esta por observação visual, antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Uma vez que as células se instalaram, retire os grampos de tubo e ligue Bomba A a uma taxa de fluxo lento (10 revolutioNS min -1 / 38 mL min -1). Ar preso no tubo vai ser expelida para dentro do reactor. Nota: A adição de 750 ml para o reactor vai prevenir qualquer biomassa perturbado pela bomba de deixar o reactor. Espremer o tubo para assegurar que todo o ar foi expulso. </li><li> Gradualmente adicionar solução de alimentação para o tanque de reciclagem, como a solução é bombeada para dentro do reactor. Continuar a adição até que tanto o reactor e o tanque de reciclagem são no capacidade de efluentes e começa a sair do tanque de reciclagem através do topo da porta. Nota: O volume da solução de alimentação para ser adicionado ao tanque de reciclagem irá variar com o volume de inoculante adicionado ao reactor. </li><li> Verter a solução de alimentação remanescente no tanque de alimentação. </li><li> Defina a bomba de reciclagem (Bomba A) a 19 rotações min -1, estabelecendo uma taxa de fluxo de reciclagem de 72,5 ml min -1. Observar as algas para loft começar a partir do fundo do reactor. Usando as gradações no reactor, determinar o bi algasaltura zona omass. Assegure-se que a altura é constante antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Ligue a placa de mistura a uma velocidade muito baixa; uma configuração de 1 ou 2 é apropriado para iniciar. O bar mistura irá ajudar na lofting biomassa mais longe, mas mistura agressiva fará com que as algas para deixar o reator, insira o tanque de reciclagem, e deixar no efluente. Ajuste a velocidade de mistura em uma configuração necessárias para estabelecer uma fronteira clara algas no interior do reactor (Figura 2A); a zona de biomassa de algas deve ser de aproximadamente de 10-15 cm de altura. </li><li> Comece a bomba de alimentação depois de observar uma clara fronteira entre o plugue de algas e do fluido reactor. Definir a bomba a 25 rotações min -1, estabelecendo uma taxa de fluxo de 1,5 ml min -1. Observe a saída de fluido do reactor a porta de efluentes devido à gravidade e deslocamento causado pela corrente influente de entrada. </li></ol> 4. Colheita e Análise <ol><li> Realizar atividades de coleta de amostras priou para a manutenção do sistema de reactor. Coletar 20 ml de amostras de efluentes e influentes diária. Coletar amostras de efluentes de dentro do tanque de reciclagem. Coletar amostras influentes diretamente do tanque de alimentação. </li><li> Amostras de filtro a vácuo para remover os sólidos antes do armazenamento e análise suspensa. </li><li> Armazenar o influente e amostras de efluente à temperatura de -20 ° C até análise posterior. Limitar o número de ciclos de descongelamento congelamento as amostras são submetidas a. Se necessário, as amostras podem ser divididas em alíquotas para manter a integridade da amostra. </li><li> Realizar a análise da amostra de nitrato, nitrito e amônia, utilizando técnicas convencionais 17. Nota: Os autores utilizaram Ion Chromatography (IC) para produzir os resultados aqui apresentados. Consulte a tabela de Materiais para a especificação. </li></ol>

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<li>Cooper, E. D., Bentlage, B., Gibbons, T. R., Bachvaroff, T. R., Delwiche, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptome+profiling+of+a+harmful+algal+bloom%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptome profiling of a harmful algal bloom.</a> Harmful Algae. 37, 75-83 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar e declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Esta secção irá começar com uma discussão sobre variações de protocolo necessárias para lidar com possíveis problemas operacionais, bem como a utilização de diferentes comunidades microbianas. Os pontos fortes deste projeto do reator será discutido, incluindo a capacidade de governar o controle de fluxo de oxigênio ea formação de flocos de alta densidade no interior do reactor. Os desafios actuais e possíveis vias de investigação também serão mencionados. Protocolo de nuances e variações...

Águas residuais municipais é comumente tratado com processos de lodos ativados, a fim de reduzir os sólidos em suspensão (SS), demanda biológica de oxigênio (DBO), nitrogênio orgânico e inorgânico, e teor de fósforo 5,6. O processo de lamas activadas, um meio de tratamento de águas residuais secundário, implica a oxidação do carbono orgânico num tanque de arejamento enchida com um líquido misturado e de águas residuais recebidas microorganismo heterotrófica reciclado (vulgarmente designado por lamas activadas) 5-7. A lixívia mista, em seguida, entra em uma relativamente grande clarificador (decantador) onde a lama liquida para facilitar a recolha, quer para ser descartado ou reciclado de volta para o tanque de arejamento, enquanto a clarificada, água residual tratada pode continuar a tratamento terciário ou desinfecção antes de ser libertado para águas receptoras 5-7. Separação eficiente do efluente tratado e sólidos (lodo) no clarificador secundário é essencial para o bom funcionamento de um estavatewater sistema de tratamento, como qualquer lama activada continuada para além dos clarificadores irá aumentar o BOD e SS no efluente 5-8. Um número de processos biológicos alternativas existem para o tratamento secundário de águas residuais de, que reduzem ou eliminam a necessidade de grandes tanques de esclarecimento, incluindo o crescimento fixadas (biofilme) reactores, bioreactores de membrana (MBR), e reactores de lamas granulares. Em reactores de biofilme, a formação de biofilmes, no qual os microorganismos naturalmente agregado e anexar como uma camada sobre uma superfície sólida, permite a retenção e acumulação de biomassa, sem a necessidade de um tanque de clarificação. Biofilme reactores podem ser classificados em três tipos: reatores de leito fixo, reactores de leito fluidizado, e contactores biológicos rotativos. Reatores de leito fixo, como uma filtros biológicos e torres biológicas, utilizar uma superfície estacionária sólido crescimento 5,6. Os reactores de leito fluidizado (FBRs) dependem da fixação de microrganismos às partículas,tais como areia, carvão activado granular (GAC), ou esferas de vidro, que são mantidas em suspensão por uma alta taxa de fluxo ascendente 9,10. Rotação reactores biológicos dependem biofilmes formados em meios ligados a um eixo de rotação, permitindo o biofilme a ser alternadamente exposto ao ar e o líquido a ser tratado 5,6. MBRs usar unidades de filtração de membrana, quer dentro do biorreator (configuração submersa) ou externamente através de recirculação (configuração side-stream) 5,11. As membranas servem para conseguir uma boa separação entre a biomassa e as partículas sólidas a partir do líquido tratado 11,12. Reactores de lamas granulares são reactores de fluxo ascendente, em que a formação de grânulos extremamente densos e bem-sedimentação de microorganismos ocorre quando são expostos a altas velocidades de fluxo ascendente de ar superficial 13. Como uma outra alternativa para o processo de lamas activadas, num sistema de fluxo ascendente reactor de novo, agora chamado bioreactor de alta densidade (HDBR), foi designed e construído por Vendas e Shieh (2006) para estudar remoção de DQO por lamas activadas a partir de fluxos de resíduos sintéticos em condições de baixa F / M que são conhecidos por causar a formação de lamas de decantação pobres (ou seja, de volume de lodo) 1,7,14. O sistema utilizado HDBR modificado reactores de leito fluidizado, que consistem tipicamente de um reactor de fluxo ascendente e um tanque de reciclagem externa. Reactores de leito fluidificado estão tipicamente operado com caudais de fluxo de recirculação de alta o suficiente para manter o substrato de crescimento de biofilme suspenso, mas baixa o suficiente para que o substrato coberto-biofilme é retida. Ao contrário dos reactores de leito fluidizado, o HDBR descrito em Vendas e Shieh (2006) utilizadas taxas de fluxo relativamente baixa corrente de reciclagem a qual, juntamente com arejamento externo, impediram ruptura da zona de biomassa formada no interior do reactor 1. Estudos posteriores demonstraram a capacidade deste projeto do reator de tratar com sucesso uma série de fluxos de nitrogênio usando nitrificantes / desnitrificadores 3,4. Ao todo parafuso prisioneiroies a formação de, uma zona densa de biomassa estável dentro do HDBR eliminou a necessidade de um processo de / sedimentação floculação externo 1-4. À medida que relatamos aqui, a utilização da HDBR a crescer culturas densas também foi testado numa configuração fotobiorreactor (PBR) para o cultivo de algas. Discutimos as vantagens e desvantagens deste sistema reactor romance para o cultivo de algas e seu potencial para superar um grande obstáculo na comercialização de biocombustíveis de algas associadas a colheita de biomassa (ou seja, uma boa separação sólido-líquido 15,16). O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para a montagem, arranque, a partir de amostra, e manter uma HDBR com algas como a comunidade microbiana de interesse. As variações no protocolo de inicialização e operação de culturas heterotróficas e nitrificação / desnitr também será mencionado. Por último, vantagens, desvantagens, gerais e incógnitas deste projeto do reator novela será destacado.

<table><tbody><tr><td>Pedra de aeração</td><td>Alita</td><td>AS-3015C</td><td></td></tr><tr><td>Aerador</td><td>Top Fin</td><td>Air-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de análise de ânions</td><td>Shodex</td><td>IC SI-52 4E</td><td></td></tr><tr><td>Béquer (600 ml)</td><td>Corning Pyrex</td><td>1000-600</td><td>Usado como recipiente de mistura (MV). Adição de farpas de mangueira na parte inferior e níveis de 500 ml. Diâmetro externo das farpas da mangueira 3/8".</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de análise catiônica</td><td>Shodex</td><td>IC YS-50</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>222011</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto férrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (vácuo)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719-2E</td><td>0,45 &#956; m filtro de membrana, MCE, 47&nbsp; mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Cilindro graduado (1.000 ml)</td><td>Corning Pyrex</td><td>3025-1L</td><td>Usado como vaso de reator (R). Adição de farpas de mangueira na parte inferior, níveis de 500 ml e 1 L. Diâmetro externo das farpas da mangueira 3/8".</td></tr><tr><td>HPLC/IC</td><td>Shimadzu</td><td>Proeminência</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S acionamento de velocidade variável</td><td>Masterflex</td><td>07553-50</td><td>Acionamento para bombas de reciclagem e alimentação (2 necessárias)</td></tr><tr><td>Cloreto de níquel hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>(Monobásico) Fosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça da bomba</td><td>Masterflex</td><td>07018-20</td><td>Cabeça da bomba de reciclagem</td></tr><tr><td>Cabeça da bomba</td><td>Masterflex</td><td>07013-20</td><td>Cabeça da bomba</td></tr><tr><td>de alimentação Tubagem da bomba</td><td>Masterflex</td><td>6404-18</td><td>Tubagem da bomba de reciclagem</td></tr><tr><td>Tubagem da bomba</td><td>Masterflex</td><td>6404-13</td><td>Tubagem da bomba de alimentação</td></tr><tr><td>Sódio bicarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinco heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr></tbody></table>

um biorreator novel de cultivo de alta densidade de diversas comunidades microbianas

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Um novo projeto de reator, denominado biorreator de alta densidade (HDBR), é apresentado para o cultivo e estudo de comunidades microbianas de alta densidade. Estudos anteriores avaliaram o desempenho do reator para a remoção de DQO1 e espécies de nitrogênio2-4 por bactérias heterotróficas e quimioautotróficas, respectivamente. O projeto HDBR elimina a necessidade de processos externos de floculação/sedimentação enquanto ainda produz efluentes contendo baixos sólidos suspensos. Neste estudo, o HDBR é aplicado como um fotobiorreator (PBR) para caracterizar as características de remoção de nitrogênio de uma comunidade microbiana fotossintética baseada em algas. Conforme relatado anteriormente para este projeto HDBR, uma zona de biomassa estável foi estabelecida com uma delimitação clara entre a porção biologicamente ativa do reator e o fluido do reator de reciclagem, o que resultou em um efluente sólido de baixa suspensão. Observou-se que a comunidade de algas no HDBR removeu 18,4% do total de espécies de nitrogênio no afluente. A variação das concentrações de NH4+ e NO3- na ração não teve efeito na remoção de NH4+ (n=44, p=0,993 e n=44, p=0,610, respectivamente), enquanto a concentração de ração NH4+ foi negativamente relacionada com a remoção de NO3- (n=44, p=0,000) e a concentração de NO3- foi positivamente correlacionada com NO3- remoção (n=44, p=0,000). A remoção consistente de NH4+, combinada com o acúmulo de espécies de nitrogênio oxidado em altos fluxos de NH4+, indica a presença de bactérias oxidantes de amônia e nitrito na comunidade microbiana.

O HDBR foi usada para cultivar algas ao longo de várias proporções de concentrações de amônia e nitrato influente, mantendo um teor de nitrogênio total na ração a 40 mg -NL -1. Influente e amostras de efluentes foram tomados diariamente; amostras de densidade de biomassa foram tomadas no início e no final de cada condição. O reactor necessário em média 3-5 dias para atingir o equilíbrio de estado estacionário, após as condições foram alteradas. Ao longo de um vasto leque de condições influentes uma zona disti...

Um novo projeto de reator, denominado biorreator de alta densidade (HDBR), é apresentado para o cultivo e estudo de comunidades microbianas de alta densidade. Aqui, o HDBR é aplicado com sucesso em uma configuração de fotobiorreator (PBR) para o estudo do metabolismo do nitrogênio por uma comunidade mista de algas de alta densidade.

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

O objetivo geral deste projeto de biorreator e experimento é demonstrar o cultivo de uma comunidade fotossintética mista altamente densa em um biorreator inovador para o tratamento eficaz de águas residuais. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais, como como projetar e operar biorreatores de algas para remediação de efluentes, bem como como cultivar biomassa de algas. A principal vantagem desta técnica é o cultivo de biomassa de algas de alta densidade na ausência de métodos externos de separação.Tivemos pela primeira vez a ideia para esta aplicação quando percebemos que este sistema de biorreator de alta densidade foi extremamente bem-sucedido no cultivo de bactérias heterotróficas a partir de lodo ativado no tratamento de compostos orgânicos presentes em águas residuais, bem como de bactérias autotróficas nitrificadoras e desnitrificadoras no tratamento do contaminante nitrogenado amônia em águas residuais. Apresentando este procedimento está Thomas Thompson, estudante de mestrado na Universidade Drexel, que também atua como estagiário e técnico em meu laboratório. Para começar, coloque o reator sobre uma placa de agitação e adicione uma barra de agit

a-novel-bioreactor-for-high-density-cultivation-diverse-microbial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocolo para Otimização da Produção de Proteínas Heterólogas Utilizando Tecnologia Automatizada de Microbioreator. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra o uso de um microbiorator automatizado para monitorar o crescimento bacteriano e a secreção de proteínas fluorescentes em resposta a diferentes formulações de meio. Uma bactéria geneticamente modificada que expressa uma proteína fluorescente secretora é cultivada sob seleção antibiótica e inoculada em poços...

Monitorando o Crescimento Bacteriano em Diferentes Formulações de Meios com um Microbiorator Automatizado

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

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Usando um biorreator pneumático, demonstramos a montagem, operação e desempenho deste sistema de biorreator de uso único para o crescimento de células de mamíferos.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Este manuscrito descreve uma abordagem genérica de design à medida dos meios de cultivo microbiano. Isso é ativado por um fluxo de trabalho iterativo combinando Kriging experimental design e microbioreactor tecnologia para throughput de cultivo suficientes, que é apoiado pela robótica de laboratório para aumentar a confiabilidade e a velocidade em mídia de manuseio de líquidos preparação.

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É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

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Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

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Montagem de biorreatores para cultura contínua de comunidades fecais complexas

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Protocolo atualizado para montagem e uso do arranjo de minibiorreatores (MBRA)

Aprenda a cultivar comunidades fotossintéticas de alta densidade em um biorreator inovador para tratamento de efluentes. Este método elimina a necessidade de separação externa e facilita a produção de biomassa algal em larga escala.

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

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