Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

O objetivo geral deste procedimento é descrever como analisar com precisão o teor de endotoxina e DNA de partículas aéreas extraídas coletadas em filtros. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de aerossóis biológicos internos e externos, como a compreensão de razões relacionadas à saúde. A demonstração do procedimento de amostragem com filtros será feita por Yinon Mazar, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para amostragem de alto volume, utilize filtros feitos de fibra de quartzo. Ou escolha o tipo específico de filtro, bem como o tamanho de corte do filtro, que melhor atenda às necessidades da pesquisa. Pré-aqueça os filtros destinados à amostragem de compostos orgânicos e biológicos envolvendo-os individualmente em folha de alumínio.

E então aquecê-los em um forno de laboratório a 450 graus Celsius por pelo menos cinco horas. Isso destruirá quaisquer resíduos orgânicos preexistentes. Armazene os filtros aquecidos a 20 graus Celsius até que sejam utilizados para amostragem.

Em seguida, limpe e desinfecte o amostrador de alto volume, como o descrito no protocolo de texto complementar. Depois, coloque o filtro pré-assado na cápsula de filtro e opere o amostrador de acordo com as instruções do fabricante para coletar uma amostra apropriada. Dentro de uma cabine de segurança biológica classe dois, corte 22 pedaços circulares de material de filtro limpo e pré-assado utilizando um saca-rolhas limpo com diâmetro de 1,12 centímetro.

Use esses pedaços para preparar uma variedade de filtros com endotoxinas adicionadas, que serão utilizados como controles. Em seguida, corte os filtros contendo a amostra coletada utilizando um furador de cortiça limpo com diâmetro de 1,12 centímetro e coloque cada amostra em um tubo estéril livre de pirogênios de dois mililitros. Além disso, transfira os filtros secos com endotoxinas adicionadas para tubos estéreis livres de pirogênios separados de dois mililitros.

Adicione um mililitro de água pirogênica livre a cada tubo e agite-os por 60 minutos à temperatura ambiente utilizando um agitador laboratorial. Em seguida, centrifugue os tubos de amostra em uma microcentrífuga a 375 vezes G por 10 minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante, que contém os endotoxinas, para um novo tubo de dois mililitros livre de pirogênios. Prepare uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo plano e tampa, livre de pirogênios, para o teste de endotoxinas, organizando primeiro as posições das amostras.

Em seguida, ligue o leitor de microplacas e programe-o para uma reação cinética a 37 graus Celsius com agitação a cada cinco minutos, seguida por leituras a 405 nanômetros. Repita a agitação de cinco minutos e a leitura da placa 18 vezes.

Carregue as amostras na placa colocando 50 microlitros das soluções padrão de endotoxinas previamente utilizadas para contaminar os filtros nas linhas A1 a A10 e B1 a B10. Coloque as amostras brancas em A11, A12, B11 e B12. Em seguida, adicione o sobrenadante do extrato do filtro contaminado centrifugado e seus respectivos brancos nas linhas C e D. Depois, adicione os sobrenadantes das amostras experimentais e seus brancos nos poços restantes conforme necessário.

Para ativar o teste, adicione rapidamente 50 microlitros da solução de glicato de amebócito de Limulus a cada poço. Agite suavemente a placa na posição horizontal. Antes de levantá-la para o leitor de placas e iniciar a execução do experimento.

Após a conclusão, remova a placa do leitor de placas. Determine o nível de endotoxina em cada amostra utilizando a curva padrão e calcule também a eficiência com que as endotoxinas são extraídas dos filtros das amostras. Primeiro, prepare os filtros com DNA adicionado conforme descrito no protocolo textual complementar.

Para cada amostra de filtro, prepare uma mistura de esferas de vidro lavadas com ácido em tubos estéreis de 0,5 mililitro, contendo 0,1 gramas de esferas com diâmetro entre 425 e 600 micrometros e 0,3 gramas de esferas com diâmetro menor ou igual a 106 micrometros. Em seguida, corte três pedaços circulares de locais selecionados aleatoriamente em cada amostra de filtro, utilizando um furador esterilizado com diâmetro de 1,12 centímetro. Coloque as amostras de filtro em tubos individuais de dois mililitros com tampa de rosca.

Em seguida, adicione a mistura de esferas de vidro a cada tubo junto com 60 microlitros do tampão de lise celular fornecido com o kit de extração de DNA. Feche os tubos e coloque as amostras no homogeneizador de esferas. Utilize o homogeneizador de esferas para romper mecanicamente as células filtradas durante um minuto e, em seguida, resfrie as amostras colocando-as sobre gelo por um minuto adicional.

Repita este ciclo cinco vezes. Prossiga seguindo o protocolo do fornecedor do kit e extraia o DNA das células lisadas. Após a eluição, recarregue a amostra eluída através da coluna de extração uma segunda vez para melhorar o rendimento de DNA.

Ligue o instrumento de PCR quantitativa com antecedência para permitir que ele aqueça. Em um novo arquivo de programa, insira os detalhes da corrida de PCR quantitativa no software operacional do instrumento. Em seguida, desinfecte a superfície de trabalho com descontaminante de DNA para superfícies e trabalhe apenas com tubos, ponteiras e reagentes estéreis.

Além disso, coloque um balde com gelo ao lado da bancada de trabalho e coloque a mistura de tac polemoraris no balde. Prepare a mistura de reação de PCR quantitativa conforme descrito na tabela quatro do protocolo textual complementar. E armazene a mistura de reação no escuro e sobre gelo até o uso.

Em seguida, coloque uma microplaca limpa em um suporte para placas para evitar que entre em contato com a superfície de trabalho e para mantê-la limpa. Adicione um microlitro de DNA padrão, DNA da amostra ou água livre de nucleases nos poços da microplaca de PCR quantitativa em triplicata. Em seguida, adicione nove microlitros da mistura mestra de reação em cada poço de reação.

Quando terminar, cubra a placa com filme adesivo óptico e feche-a firmemente em todos os lados. Centrifugue a placa em centrífuga equipada com baldes para placas durante um minuto a 1000 vezes G antes de colocá-la no termociclador. Por fim, ative e execute o programa de PCR quantitativo preparado.

Na extração de endotoxinas, as amostras filtradas são centrifugadas para extrair a endotoxina do filtro. Diferentes velocidades de centrifugação resultam em várias eficiências de extração. Especialmente em concentrações mais altas de endotoxinas.

Um teste preliminar de eficiência de extração deve ser realizado para o filtro específico escolhido e o protocolo executado. Obtêm-se maiores eficiências de extração a partir da adição de padrão em filtros limpos, em comparação com filtros de quartzo amostrados, e ambas essas eficiências são menores do que a alcançada por meio da detecção direta da solução padrão. Uma vez dominada, a análise de endotoxina pode ser realizada em três horas e meia, se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos como o sequenciamento de DNA podem ser realizados para responder questões adicionais sobre o transporte de organismos na atmosfera. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair de forma eficiente endotoxinas e DNA de filtros de amostras de ar e analisá-los com precisão.