Name: Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a analisar endotoxinas e DNA em partículas atmosféricas amostradas em filtros de fibra de quartzo. Este método permite estudar aerossóis biológicos em ambientes internos e externos com precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem ao Dr. Yoav Barak, da Faculdade de Química do Instituto Weizmann, pelo apoio e aconselhamento. Este estudo foi apoiado pela Israel Science Foundation (concessão # 913/12) e pela Minerva Foundation com financiamento do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%22">Methods of Air Sampling and Analysis</a>. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).</li>
<li>Costa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+carbonaceous+aerosols+in+Emilia-Romagna+%28Northern+Italy%29+based+on+two+fall%2Fwinter+field+campaigns%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Res%22%5BJournal%5D)">Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns.</a> Atmos. Res. , (2015).</li>
<li>Brent, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development%2C+enhancement%2C+and+evaluation+of+aircraft+measurement+techniques+for+national+ambient+air+quality+standard+criteria+pollutants+%5B%5D%22">Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]</a>. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Hospodsky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+airborne+fungal+and+bacterial+concentrations+and+emission+rates+in+six+occupied+children%27s+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms.</a> Indoor air. , (2014).</li>
<li>Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Bacterial+Populations+Above+Desert+Soils+of+the+McMurdo+Dry+Valleys%2C+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica.</a> Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).</li>
<li>Ovadnevaite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+NE+Atlantic+marine+aerosol+chemical+composition+and+abundance%3A+Seasonal+trends+and+air+mass+categorization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Geophys.+Res.+Atmos%22%5BJournal%5D)">Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization.</a> J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).</li>
<li>Lodge, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ES%26T+Books%3A+Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%2C+3rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed.</a> Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aerosol+Measurement%3A+Principles%2C+Techniques%2C+and+Applications%22">Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications</a>. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Vincent, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JH+%22Aerosol+Sampling%3A+Science%2C+Standards%2C+Instrumentation+and+Applications%22">Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Endotoxins+in+Bioaerosols+at+Workplace%3A+A+Critical+Review+of+Literature+and+a+Standardization+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue.</a> Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Lewtas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+combustion+emissions%3A+Characterization+of+causative+agents+and+mechanisms+associated+with+cancer%2C+reproductive%2C+and+cardiovascular+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.-Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects.</a> Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).</li>
<li>Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+as+a+possible+source+for+endotoxins+in+coastal+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total.+Environ%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas.</a> Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3A+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Diath.+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
<li>O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+production%3A+a+review+of+the+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol production: a review of the current knowledge.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).</li>
<li>O'Dowd, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenically+driven+organic+contribution+to+marine+aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biogenically driven organic contribution to marine aerosol.</a> Nature. 431, 676-680 (2004).</li>
<li>Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+next-generation+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+with+quantitative+PCR+%28qPCR%29+for+enumeration+of+Cryptosporidium+oocysts+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples.</a> Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).</li>
<li>Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+enumeration+of+airborne+biocontaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detection and enumeration of airborne biocontaminants.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).</li>
<li>Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+housing+characteristics+on+bacterial+and+fungal+communities+in+homes+of+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children.</a> Indoor air. , (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+emissions+as+a+primary+source+of+airborne+allergenic+fungal+particles+in+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms.</a> Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6, 1801-1811 (2012).</li>
<li>Karottki, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+lung+function+in+relation+to+outdoor+and+indoor+exposure+to+fine+and+ultrafine+particulate+matter+in+middle-aged+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects.</a> Environ Int. 73, 372-381 (2014).</li>
<li>Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuy%2C+D+%22Industrial+Pharmaceutical+Microbiology%3A+Standards+and+Controls%22">Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls</a>. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf</a> (2006).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf</a> (2007).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pageCOA.php">http://www.acciusa.com/pageCOA.php</a> (2015).</li>
<li>Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Five+Extraction+Protocols+for+Quantification+of+Endotoxin+in+Metalworking+Fluid+Aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol.</a> Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+MT+%22Brock+Biology+of+Microorganisms%22">Brock Biology of Microorganisms</a>. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).</li>
<li>Watson, J. G., Chow, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+JG+%22Aerosol+Measurement%3A+Principles+and+Techniques%22">Aerosol Measurement: Principles and Techniques</a>. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).</li>
<li>Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+endotoxin+concentrations+in+PM10+from+Southern+California%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California.</a> Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).</li>
<li>Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy%2C+Precision%2C+and+Method+Detection+Limits+of+Quantitative+PCR+for+Airborne+Bacteria+and+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).</li>
<li>Kutyavin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2-Minor+groove+binder-DNA+probes+increase+sequence+specificity+at+PCR+extension+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures.</a> Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).</li>
<li>Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+absolute+quantification+method+correcting+for+quantitative+PCR+efficiency+variations+for+microbial+community+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+enhancement+in+the+analysis+of+airborne+endotoxin+levels+in+various+occupational+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Ind+Hyg+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments.</a> Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).</li>
<li>Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization+%3A+the+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization : the essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Endotoxin+Testing+Methods+for+Pharmaceutical+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm+Compd%22%5BJournal%5D)">Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products.</a> Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).</li>
<li>Ebentier, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+a+suite+of+qPCR-based+microbial+source+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods.</a> Water Res. 47, 6839-6848 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho descreve métodos de extração e detecção para quantificar tanto endotoxinas e DNA presente em amostras de aerossóis recolhidas em filtros. Os métodos requerem rotinas precisas e pode ser executada facilmente, desde que o experimentalista adere a alguns pontos essenciais e importantes discutidos aqui. Para o passo de detecção de endotoxina, note que o lisado solução é bastante viscosa e tende a produzir bolhas mediante pipetagem. É difícil de remover ti bolhas, e eles levam a alt...

Amostragem de ar em filtros é uma ferramenta básica na investigação aerossóis atmosférica. 1 Os filtros são amostrados o ponto de partida para várias propriedades químicas, físicas e biológicas das caracterizações partículas ambiente recolhida. 2-11 A vantagem desta abordagem é que várias análises podem ser realizado fora de linha na mesma amostra. Compilando os dados de todas as diferentes análises permite ao pesquisador obter uma boa compreensão das características das partículas e auxiliares colhidos em resolver questões complexas nas ciências atmosféricas. 12,13 Por exemplo, aparelhos de ar amostras marinhas e fluviais tomada durante o mesmo período pode ser comparado com respeito à toxicidade de partículas amostrado e composição biológica. 14 para este estudo, lipopolissacáridos (LPS), componentes de células, as paredes bacterianas gram-negativas, também conhecidos como endotoxinas, foram extraídos a partir de filtros amostrados em terra e em um site para o interior, e foram avaliados usando olimulus amebócito lisado (LAL) de teste. Em paralelo, uma avaliação do conteúdo genómico bacteriano (bactérias totais, bactérias gram negativas, e cianobactérias) foi realizada na mesma amostra, utilizando a reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR). O teste LAL baseia-se em medições de turvação formada após a adição de um extracto aquoso de amebócitos do caranguejo-ferradura, Limulus polyphemus, a uma solução aquosa que contém as endotoxinas. Quanto maior for a concentração de endotoxinas na amostra, a turbidez mais rapidamente se desenvolve. 15 A análise Q-PCR baseia-se num sinal de fluorescência emitido como um fragmento de ADN específico é amplificado. 16 por monitorização em tempo real do sinal durante a fase exponencial da PCR reacção e de calibragem com uma curva padrão, a quantidade inicial de ADN pode ser quantificada. A combinação destas duas análises em conjunto com os outros, como detalhado em outra parte, 14 pode fornecer uma boa estimativa dos níveis de endotoxina e aquantidade de bactérias nas amostras de origem. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. Embora os métodos para a amostragem das características físico-químicas e inorgânicos dos aerossóis são bem conhecidos e, mais recentemente, têm sido desenvolvidos métodos para investigar a sua componente de matéria orgânica, 17 houve uma pesquisa escassa no componente biológico de aerossóis. 18 A razão para a corrente de método é preencher esta lacuna, apresentando em pormenor um método robusto para extrair, analisar e identificar a fração biológica de aerossóis 14. O método detalhado aqui é esperado para encontrar uma ampla utilização em projectos de investigação biológicos interiores e exteriores de aerossol que envolvem a análise de filtro 20-24.

<table><tbody><tr><td>Filter sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - Amostrador de Ar de Alto Volume</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz Microfiber Filters</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - Fornos de Câmara de Laboratório</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Opala</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Endotoxina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>Reagente de laboratório, 96%</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Airstream Classe II AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates de Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Associados de Endotoxina Padrão</td><td>de Controle de Cape Cod, Inc.</td><td>E0005-1</td><td>Escherichia coli&nbsp; O113:H10, 0.5 &micro; g/frasco 1 Pacote</td></tr><tr><td>de Água Reagente LAL</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de 10 ml com ponta Luer-Lok</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>Agulha de seringa BD Precisionglide</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>Estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita de vedação Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Número de catálogo Sigma</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, livre de pirogênio</td></tr><tr><td>1,12 cm de diâmetro Broca de Cortiça</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 Série BD - Aço</td><td>Parte de um conjunto de broca de cortiça contendo brocas com vários diâmetros.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 50 mm</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td><td>Aseptic</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2&nbsp;</td><td>Indústrias Científicas, Inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5415 D</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI c/tampa</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Poços de fundo plano (com tampa (embalados individualmente)), estéreis, livres de pirogênio</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multidetecção Synergy HT</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA away</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>DNA padrão das espécies microbianas de interesse</td><td>ATCC ou outra coleção</td><td></td> de cultura <td>A cepa microbiana apropriada para extração de DNA ou o DNA</td></tr> <tr><td>extraídoNeubauer-improved</td><td>Marienfeld</td><td>640030</td><td>hemocitômetro</td></tr><tr><td>TE tampão, baixo EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)&nbsp; 0,1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Água de grau PCR livre de nuclease&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>Primers PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Tem como alvo as espécies microbianas de interesse</td></tr><tr><td>Sondas duplamente marcadas</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Tem como alvo as espécies microbianas de interesse</td></tr><tr><td>Tubos com tampa de rosca</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA PowerSoil&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro, lavadas com ácido 425-600 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro, lavadas com ácido < 106 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>Tampão de lise celular, Kit de solo de energia</td></tr><tr><td>Balde de gelo Magic Touch</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR em tempo real</td><td>aplicado Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>rápido SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica rápida de 96 poços MicroAmp com código de barras, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Base sem respingos MicroAmp Base de 96 poços</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>Filme</td> <td>adesivo óptico MicroAmpCentrífuga</td><td>4311971</td><td></td>Applied Biosystems</tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotor A-4-62 com baldes MTP&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise filtro amostrado-air para endotoxinas e conteúdo de dna

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Aerosol Research Outdoor comumente utiliza partículas amostradas em filtros. Este procedimento permite que várias caracterizações das partículas recolhidas para ser realizado em paralelo. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. A extracção de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, tais como lipopolissacáridos, de filtros amostrados envolve a agitação da amostra, num meio à base de água livre de pirogénio. A subsequente análise baseia-se numa reacção enzimática que pode ser detectada utilizando uma medição turbidimétrica. Como resultado do elevado teor orgânico nos filtros da amostra, a extracção de ADN a partir de amostras é realizada usando um kit de extracção de DNA comercial que foi originalmente concebido para solos e modificados para melhorar o rendimento de ADN. A detecção e quantificação de espécies microbianas específicas usando Reacti cadeia da polimerase quantitativaem análise (Q-PCR) são descritos e comparados com outros métodos disponíveis.

É comum para estudar aerossóis atmosféricos usando &quot;off-line&quot; análises de filtros amostra (ver Figura 2). Analisa 32 química do material incluem orgânico (por exemplo, proteínas, as moléculas de hidrocarboneto, sacáridos) e inorgânico (por exemplo, metais, sais) conteúdo amostrado . análises biológicas incluem conteúdo viáveis ​​e não viáveis ​​microrganismo, identificação de espécie utilizando uma abordagem de ADN ou microscopia, b...

Duas análises complementares de partículas biológicas atmosféricas de filtros de amostras de ar são descritas aqui: a extração e detecção de endotoxina e de DNA.

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever como analisar com precisão o teor de endotoxina e DNA de partículas aéreas extraídas coletadas em filtros. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de aerossóis biológicos internos e externos, como a compreensão de razões relacionadas à saúde. A demonstração do procedimento de amostragem com filtros será feita por Yinon Mazar, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para amostragem de alto volume, utilize filtros feitos de fibra de quartzo. Ou escolha o tipo específico de filtro, bem como o tamanho de corte do filtro, que melhor atenda às necessidades da pesquisa. Pré-aqueça os filtros destinados à amostragem de compostos orgânicos e biológicos envolvendo-os individualmente em folha de alumínio.E então aquecê-los em um forno de laboratório a 450 graus Celsius por pelo menos cinco horas. Isso destruirá quaisquer resíduos orgânicos preexistentes. Armazene os filtros aquecidos a 20 graus Celsius até que sejam utilizados para amostragem.Em seguida, limpe e desinfecte o amostrador de alto volume, como o descrito no protocolo de texto complementar. Depois, coloque o filtro pré-assado na cápsula de filtro e opere o amostrador de acordo com as instruções do fabricante para coletar uma amostra apropriada. Dentro de uma cabine de segurança biológica classe dois, corte 22 pedaços circulares de material de filtro limpo e pré-assado utilizando um saca-rolhas limpo com diâmetro de 1,12 centímetro.Use esses pedaços para preparar uma variedade de filtros com endotoxinas adicionadas, que serão utilizados como controles. Em seguida, corte os filtros contendo a amostra coletada utilizando um furador de cortiça limpo com diâmetro de 1,12 centímetro e coloque cada amostra em um tubo estéril livre de pirogênios de dois mililitros. Além disso, transfira os filtros secos com endotoxinas adicionadas para tubos estéreis livres de pirogênios separados de dois mililitros.Adicione um mililitro de água pirogênica livre a cada tubo e agite-os por 60 minutos à temperatura ambiente utilizando um agitador laboratorial. Em seguida, centrifugue os tubos de amostra em uma microcentrífuga a 375 vezes G por 10 minutos.Em seguida, transfira o sobrenadante, que contém os endotoxinas, para um novo tubo de dois mililitros livre de pirogênios. Prepare uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo plano e tampa, livre de pirogênios, para o teste de endotoxinas, organizando primeiro as posições das amostras.Em seguida, ligue o leitor de microplacas e programe-o para uma reação cinética a 37 graus Celsius com agitação a cada cinco minutos, seguida por leituras a 405 nanômetros. Repita a agitação de cinco minutos e a leitura da placa 18 vezes.Carregue as amostras na placa colocando 50 microlitros das soluções padrão de endotoxinas previamente utilizadas para contaminar os filtros nas linhas A1 a A10 e B1 a B10. Coloque as amostras brancas em A11, A12, B11 e B12. Em seguida, adicione o sobrenadante do extrato do filtro contaminado centrifugado e seus respectivos brancos nas linhas C e D. Depois, adicione os sobrenadantes das amostras experimentais e seus brancos nos poços restantes conforme necessário.Para ativar o teste, adicione rapidamente 50 microlitros da solução de glicato de amebócito de Limulus a cada poço. Agite suavemente a placa na posição horizontal. Antes de levantá-la para o leitor de placas e iniciar a execução do experimento.Após a conclusão, remova a placa do leitor de placas. Determine o nível de endotoxina em cada amostra utilizando a curva padrão e calcule também a eficiência com que as endotoxinas são extraídas dos filtros das amostras. Primeiro, prepare os filtros com DNA adicionado conforme descrito no protocolo textual complementar.Para cada amostra de filtro, prepare uma mistura de esferas de vidro lavadas com ácido em tubos estéreis de 0,5 mililitro, contendo 0,1 gramas de esferas com diâmetro entre 425 e 600 micrometros e 0,3 gramas de esferas com diâmetro menor ou igual a 106 micrometros. Em seguida, corte três pedaços circulares de locais selecionados aleatoriamente em cada amostra de filtro, utilizando um furador esterilizado com diâmetro de 1,12 centímetro. Coloque as amostras de filtro em tubos individuais de dois mililitros com tampa de rosca.Em seguida, adicione a mistura de esferas de vidro a cada tubo junto com 60 microlitros do tampão de lise celular fornecido com o kit de extração de DNA. Feche os tubos e coloque as amostras no homogeneizador de esferas. Utilize o homogeneizador de esferas para romper mecanicamente as células filtradas durante um minuto e, em seguida, resfrie as amostras colocando-as sobre gelo por um minuto adicional.Repita este ciclo cinco vezes. Prossiga seguindo o protocolo do fornecedor do kit e extraia o DNA das células lisadas. Após a eluição, recarregue a amostra eluída através da coluna de extração uma segunda vez para melhorar o rendimento de DNA.Ligue o instrumento de PCR quantitativa com antecedência para permitir que ele aqueça. Em um novo arquivo de programa, insira os detalhes da corrida de PCR quantitativa no software operacional do instrumento. Em seguida, desinfecte a superfície de trabalho com descontaminante de DNA para superfícies e trabalhe apenas com tubos, ponteiras e reagentes estéreis.Além disso, coloque um balde com gelo ao lado da bancada de trabalho e coloque a mistura de tac polemoraris no balde. Prepare a mistura de reação de PCR quantitativa conforme descrito na tabela quatro do protocolo textual complementar. E armazene a mistura de reação no escuro e sobre gelo até o uso.Em seguida, coloque uma microplaca limpa em um suporte para placas para evitar que entre em contato com a superfície de trabalho e para mantê-la limpa. Adicione um microlitro de DNA padrão, DNA da amostra ou água livre de nucleases nos poços da microplaca de PCR quantitativa em triplicata. Em seguida, adicione nove microlitros da mistura mestra de reação em cada poço de reação.Quando terminar, cubra a placa com filme adesivo óptico e feche-a firmemente em todos os lados. Centrifugue a placa em centrífuga equipada com baldes para placas durante um minuto a 1000 vezes G antes de colocá-la no termociclador. Por fim, ative e execute o programa de PCR quantitativo preparado.Na extração de endotoxinas, as amostras filtradas são centrifugadas para extrair a endotoxina do filtro. Diferentes velocidades de centrifugação resultam em várias eficiências de extração. Especialmente em concentrações mais altas de endotoxinas.Um teste preliminar de eficiência de extração deve ser realizado para o filtro específico escolhido e o protocolo executado. Obtêm-se maiores eficiências de extração a partir da adição de padrão em filtros limpos, em comparação com filtros de quartzo amostrados, e ambas essas eficiências são menores do que a alcançada por meio da detecção direta da solução padrão. Uma vez dominada, a análise de endotoxina pode ser realizada em três horas e meia, se for executada corretamente.Após este procedimento, outros métodos como o sequenciamento de DNA podem ser realizados para responder questões adicionais sobre o transporte de organismos na atmosfera. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair de forma eficiente endotoxinas e DNA de filtros de amostras de ar e analisá-los com precisão.

air-sampled-filter-analysis-for-endotoxins-and-dna-content

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Este vídeo demonstra um bioensaio rápido para investigar a atividade da endotoxina em uma amostra de sangue total por meio de um método baseado em quimioluminescência. Este ensaio é um teste de biomarcador rápido e sensível para o diagnóstico em estágio inicial de sepse mediada por endotoxina.

Ensaio de atividade de endotoxina: um bioensaio baseado em quimioluminescência para investigar a atividade de endotoxina em amostra de sangue

Este vídeo descreve o formato turbidimétrico do lisado de amebócitos Limulus, ou LAL, ensaio para estimar a contaminação por endotoxinas em nanoformulações de doxorrubicina lipossomal PEGilado. A turbidez da solução após a reação da endotoxina com o reagente LAL ajuda a estimar a endotoxina na amostra.

Ensaio de lisado de amebócitos Limulus turbidimétrico: uma técnica para detectar e quantificar a contaminação por endotoxinas em medicamentos nanoformulados

Este vídeo descreve um ensaio de coágulo de gel para determinar a presença de endotoxinas bacterianas em nanoformulações usando lisado de amebócitos Limulus derivado das células sanguíneas de caranguejos-ferradura. O ensaio ajuda a testar a contaminação por endotoxinas de produtos farmacêuticos, incluindo formulações à base de nano.

Ensaio de lisado de amebócitos de Limulus de coágulo de gel: um método para detecção de endotoxinas bacterianas em formulações de nanopartículas

Este vídeo demonstra um ensaio para examinar a atividade dependente do receptor toll-like (TLR) dos fatores de transcrição fator nuclear kappa-B (NF-κB) e proteína ativadora-1 (AP-1) em macrófagos. Os TLRs desencadeiam uma cascata de sinalização pró-inflamatória ao reconhecer padrões moleculares associados a danos (DAMPs), ativando NF-κB e AP-1. Os macrófagos repórteres modificados produzem a enzima fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) após a ativação de NF-κB e AP-1, que é detectada...

Um ensaio para sinalização do fator de transcrição NF-&kcy;B/AP-1 dependente de TLR em macrófagos

Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente é um método utilizado em estudos de saúde ocupacional para identificar riscos para a saúde. Este protocolo descreve a extração de DNA de amostras de ar ocupacional para amplificação e sequenciamento de regiões ITS fúngicas. Esta abordagem detecta muitas espécies de fungos que podem ser negligenciados pelos métodos tradicionais de avaliação.

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Nós apresentamos um protocolo para medir na cabeceira a atividade da endotoxina de amostras de sangue inteiras humanas. O ensaio da atividade da endotoxina é um teste simples a executar e pode ser um biomarcador útil em pacientes criticamente doentes com sepsis.

Ensaio da atividade da endotoxina para a deteção do endotoxemia do sangue inteiro em pacientes criticamente doentes

Compreender a composição biológica das partículas ambientais é importante para o estudo de seus impactos significativos na saúde humana e a doença se espalhou. Aqui, usamos três tipos de métodos de amostragem de bioaerosol e uma análise biológica de micróbios no ar para melhor explorar comunidades microbianas no ar sob diferentes condições ambientais.

Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Deteção de endotoxinas em nanomateriais engenharia representa um dos grandes desafios no campo da nanomedicina. Aqui, apresentamos um estudo de caso que descreve a estrutura composta por três diferentes formatos LAL para estimar a contaminação potencial de endotoxinas em nanopartículas.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Formas confiáveis e precisas de análise de DNA implantável em campo são cruciais para muitas indústrias. Este artigo oferece dois métodos para análise microbiana ambiental em campo: 1) o isolamento de DNA microbiano de amostras ambientais usando um kit de extração biológica de campo, e 2) a análise do DNA via unidade qPCR de campo.

Análise de DNA microbiano em campo usando um kit de extração biológica de campo e uma unidade qPCR de campo

Aprenda a analisar endotoxinas e DNA em partículas atmosféricas amostradas em filtros de fibra de quartzo. Este método permite estudar aerossóis biológicos em ambientes internos e externos com precisão.

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

Explorar mais vídeos