Name: Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda a transformar leveduras probióticas para expressão de proteínas heterólogas em Saccharomyces boulardii sem seleção por antibióticos. Este método permite estudar adesão a tecidos gastrointestinais em camundongos.

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Os autores reconhecem o financiamento através do Centro Infantil de Imunologia e Vacinas e um Innovator Award New NIH (1DP2AI112242-01) atribuído à Tracey J. Lamb. Os autores também agradecem Natalya P. Degtyareva para a contribuição generosa de S. rad1 cerevisiae.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Juntos, os protocolos aqui descrever os passos essenciais necessários para o desenvolvimento e teste de estirpes probióticas de levedura auxotróficos para a entrega de proteína terapêutica heterólogo para o intestino. Esta manipulação e teste de levedura probiótica recombinante requer técnicas e recursos com os quais qualquer laboratório indivíduo não pode actualmente ser familiar. Assim, apesar de numerosos estudos anteriores descreveram os protocolos acima para várias cepas de leveduras e do rato, esses métodos não tê...

Os microorganismos probióticos são um meio potencial intrigantes de entrega eficiente e economicamente proteínas heterólogas para o tracto gastrointestinal. Estes organismos são capazes de sobreviver a passagem através do tracto gastrointestinal ainda não colonizam o 1, permitindo que a dosagem controlada e limitação da exposição ao fármaco expressa. Além disso, a capacidade para manipular facilmente destes organismos para a produção de proteína heteróloga em grande escala torna uma alternativa económica para entrega partículas sintéticas. No entanto, o desenvolvimento de uma tal abordagem, como foi recentemente demonstrado utilizando uma estirpe auxotrï¿½ica da levedura Saccharomyces probióticas boulardii 2, requer o conhecimento de técnicas laboratoriais que não são tradicionalmente combinadas dentro de um determinado estudo, variando de levedura e biologia molecular para técnicas de manejo de animais e métodos imunológicos. Assim, embora os procedimentos individuais aqui descritos não são em si novosprotocolos laboratoriais, o objectivo deste manuscrito é apresentar uma introdução unificada para as técnicas necessárias para ensaios experimentais de levedura probiótico como veículos de entrega de fármaco no tracto gastrointestinal de murino. Fornecida é uma compilação de protocolos essenciais para: 1) geração de cepas mutantes auxotróficos de levedura que podem ser facilmente manipulados geneticamente; 2) a transformação de culturas de leveduras para expressar a proteína heteróloga; 3) a administração de levedura recombinante para o intestino através de sonda oral; e 4) recuperação da levedura probiótica recombinante viável a partir do intestino murino e avaliação da sua expressão de proteínas heterólogas. Em primeiro lugar, apesar de existirem numerosos métodos de selecção positiva e negativa para a manipulação de espécies de levedura, tais como a selecção negativa através do uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto a eficiência e a facilidade com que a levedura pode ser transformada e seleccionada. selecção positiva de transformantes utilizando antibióticos, em contrast, aumenta significativamente o custo da manipulação de levedura. Além disso, a selecção de levedura em meio sólido contendo antibióticos pode permitir o aumento do crescimento de colónias não transformadas fundo em relação à selecção de levedura auxotróf ico em queda para fora sintético meios sólidos (observações não publicadas). levedura auxotróficos estirpes é que carecem de enzimas críticas para a síntese de aminoácidos essenciais ou uracilo. Essa levedura pode crescer somente se suplementado com o metabolito falta ou gene metabólica, permitindo assim seleção negativa quando a levedura é banhado em queda sintética fora de mídia que não tem o metabólito essencial. Muitos Saccharomyces comumente utilizadas estirpes laboratoriais cerevisiae são, na verdade já mutantes auxotróficos 3. Industrial, clínico, estirpes de levedura e probióticas, no entanto, são tipicamente prototrófica com a capacidade de sintetizar todos os nutrientes necessários. Para permitir a manipulação genética mais eficiente de tais leveduras, genes auxotróficas podem ser selectivamentepara gerar estirpes que podem ser seleccionados, sem antibióticos. Direccionamento específico de genes marcadores auxotróf icos pode ser conseguida através de ruptura do gene mediada por PCR confiando na recombinação homóloga, ou, mais recentemente, através de CRISPR / Cas9 segmentação 4-6. Alternativamente, a mutagénese UV pode gerar rapidamente mutantes auxotróficos mesmo em cepas de leveduras para os quais a transformação com vários plasmídeos é tecnicamente difícil 7. Enquanto segmentação PCR e CRISPR / Cas9 foram descritos extensivamente em outros lugares, apresentada na primeira parte deste manuscrito é um protocolo detalhado descrevendo uma abordagem de mutagénese UV para criar cepas auxotróficas que permitam seleção negativa, em vez de selecção de antibiótico positivo de transformantes de levedura. O próximo passo necessário para a utilização de tais estirpes auxotróf iças para a administração oral de proteína heteróloga é a transformação de levedura com ADN de plasmídeo. Uma vez que a primeira transformação bem sucedida de yeast esferoplastos relatados para Saccharomyces cerevisiae, em 1978, 8, numerosas modificações têm sido caracterizados para aumentar a eficiência e a facilidade com que espécies de leveduras pode ser geneticamente modificada. O uso de electroporação para a transformação bem sucedida de ADN em S. cerevisiae foi descrito pela primeira vez em 1985 9 e desde então tem sido melhorada através da adição de incubação de 1 M sorbitol para osmoticamente células de suporte 10. A electroporação eficiência tem sido demonstrado que, além disso, dependem das espécies de leveduras e estirpe, número de células e fase de crescimento, de volume electroporação, intensidade de campo, e os amortecedores 11 específicas. De etilo (LiOAc) transformação de lítio, originalmente descrita por Ito et al. 12, encontra-se entre os protocolos de transformação mais vulgarmente utilizados, uma vez que não requer nenhum equipamento especial. Análises adicionais mostraram que a eficiência de transformação de levedura LiOAc aumenta muito quando as células são recolhidas na fase mid-logde crescimento e estão sujeitas a choque térmico na presença de polietileno glicol (PEG) e de ADN a 42 ° C 12. A incubação de toda a levedura intacta com PEG é essencial para a transformação eficiente, possivelmente através de melhorar a ligação de ADN para a membrana celular, bem como através de outros efeitos sobre a membrana 13. Si lítio também aumenta a permeabilidade das células intactas 14. Embora a maioria laboratório S. cerevisiae pode ser facilmente transformada usando LiOAc transformação 3, outras espécies de levedura pode ser mais eficientemente transformada utilizando protocolos alternativos. Pichia pastoris, por exemplo, é mais eficientemente transformado através de electroporação, em vez de LiOAc transformação 13. É importante, por conseguinte, para testar múltiplos métodos de transformação e para otimizar períodos de incubação e concentração de reagentes ao tentar modificar geneticamente uma cepa de levedura descaracterizado. Este manuscrito descreve, assim, tanto LiOAc transformation e eletroporação como técnicas para a transformação do mutante auxotrï¿½ica e tipo selvagem S. boulardii. Os leitores interessados ​​são encaminhados para comentários recentes para descrições completas da evolução da transformação de levedura, protocolos alternativos e novas discussões de possíveis mecanismos de ação 13,15. Transformação de levedura com o plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, além disso, é essencial para o teste a jusante, a fim de assegurar a expressão e função da proteína heteróloga adequada. proteínas miríade de diferentes podem ser selecionados dependendo do objetivo final do estudo terapêutico e os anticorpos disponíveis para a detecção de proteína por immunoblotting, ELISA, e outras técnicas. Os protocolos para estas técnicas têm sido exaustivamente descritos em outra parte 16,17, e pode ser utilizado para determinar os níveis de produção de proteína heteróloga a partir de levedura transformada por comparação com curvas padrão. Para fins de demonstração e para mostrarprodução bem sucedida de uma proteína muito vulgarmente utilizados na biologia de levedura, este manuscrito apresenta transformação com o plasmídeo que codifica a proteína verde fluorescente (GFP), o que permite a detecção subsequente utilizando microscopia de fluorescência. Igualmente importante para a produção de organismos probióticos que expressam a proteína heteróloga é a correcta administração e detecção destes microrganismos em tecidos gastrointestinais, como descrito nas partes três e quatro. A administração de levedura recombinante através de sonda oral permite a entrega de quantidades controladas de levedura directamente no estômago, a partir do qual ratinhos C57BL / 6 são, naturalmente, incapazes de vómitos 18. No entanto, lidar com os animais imprópria e gavage pode levar a danos de esôfago e perfuração, perfuração gástrica, administração traqueal e pneumonia de aspiração 19,20. A dificuldade técnica e inexperiência pode ainda aumentar a variabilidade na resposta imune de murino e resu experimentallts, que foram atribuídos ao estresse dos animais mediante sonda oral 21,22. Prática na técnica apropriada pode, portanto, não apenas atenuar desconforto ao animal, mas também pode aumentar a precisão dos resultados experimentais. Este manuscrito descreve e demonstra manejo dos animais e sonda oral para a administração de doses controladas de levedura recombinante. Por fim, é vital para confirmar a entrega bem sucedida de levedura recombinante através da análise de tecidos linfóides para a presença de levedura e proteína heteróloga. Os tecidos gastrointestinais imunes que podem ser mais facilmente e previsivelmente examinados para a presença de leveduras são placas de Peyer. Placas de Peyer são órgãos linfóides secundários ao longo do intestino delgado, que são locais-chave da mucosa indução de resposta imune 23. Antígenos do lúmen são transferidos transcelular através microfold células (M) no epitélio e são libertados para placas de Peyer, expondo assim delimitard células apresentadoras de antígenos para intestinal conteúdo luminal. Embora a captação de partículas através do epitélio intestinal pode também ser conseguida por células caliciformes, estas células têm sido mostrados para só ocupam partículas inferior a 0,02 um de diâmetro 24. Dendrites transepitelial prorrogado a partir de células dendríticas CD103 + (DC) também ocupam pequenas partículas do intestinal lumen 25; No entanto, não existem actualmente relatórios que provam que CD103 + DCs ocupam as partículas maiores do que as bactérias. Assim, a levedura intacta probiótico, de tamanho médio entre 3-6 um de diâmetro, são mais susceptíveis de serem absorvidos pelas células M e transferidas para placas de Peyer. Aqui descrito é um protocolo para a recolha e rastreio de placas de Peyer de levedura recombinante viável, embora este procedimento pode também ser facilmente adaptada para avaliar a absorção de bactérias probióticas. Em resumo, a avaliação de levedura recombinante probiótico para a entrega doproteínas rapeutic para o intestino requer proficiência em técnicas laboratoriais que medem biologia molecular para manejo dos animais e imunologia. Aqui apresentadas são protocolos para 1) a geração e rastreio de estirpes de levedura auxotróf icos que pode ser facilmente seleccionadas negativamente sem antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar a levedura e permitir a expressão da proteína heteróloga, 3) demonstrações de técnicas de manipulação de animais apropriados e gavagem oral para intragástrico entrega de levedura recombinante, e 4) para protocolos de dissecção e placas de Peyer a triagem para levedura recombinante viável e funcional proteína heteróloga. Combinados, estes protocolos permitirá a geração e teste de uma estirpe de levedura capaz de entregar probiótico proteína terapêutica heterólogo para o tracto gastrointestinal.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotômetro SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Exemplo de espectrofotômetro para determinar a concentração celular e OD600 de culturas de levedura</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Exemplo de tambor de rolo para incubação de cultura de levedura</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Exemplo de stratalinker</td></tr><tr><td>Contador de Colônias Stuart SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Suporte de prato com registros de ampliação a contagem de colônias ao sentir a pressão da caneta</td></tr><tr><td>Contador de Colônias Scienceware&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Caneta de contador de colônia portátil</td></tr><tr><td>Dispositivo de revestimento de réplica</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Exemplo de suporte de revestimento de réplica e almofadas&nbsp;</td></tr><tr><td>Quadrados de veludo</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Espalhadores de células estéreis em forma de L&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucléico, de fita simples de testículos de salmão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Exemplo de DNA transportador para levedura Transformação LiOAc</td></tr><tr><td>Agulhas de gavagem</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Para camundongos de 15 a 20 g, a agulha sugerida é uma agulha de gavagem reutilizável reta de calibre 22 (bola de 1,25 mm), 1 polegada de comprimento. Para camundongos com peso superior a 20&nbsp; g, agulhas de gavagem reta ou curva de calibre 20 ou maiores podem ser usadas</td></tr><tr><td>Seringa de tuberculina descartável de ponta deslizante estéril de 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pinça romba, como Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) ponta serrilhada, pinça de aperto largo</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>Exemplo de pinça romba necessária para dissecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção reta e curva</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>72966-02 e 72966-03</td><td>Exemplos de tesouras necessárias para dissecação</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Tecnologias de vida</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

O desenvolvimento da terapia oral recombinante permitiria um direcionamento mais direto do sistema imunológico da mucosa e melhoraria a capacidade de combater distúrbios gastrointestinais. A adaptação da levedura probiótica, em particular, para essa abordagem traz várias vantagens. Essas cepas não têm apenas o potencial de sintetizar uma ampla variedade de proteínas heterólogas complexas, mas também são capazes de sobreviver e proteger essas proteínas durante o trânsito pelo intestino. Criticamente, no entanto, essa abordagem requer experiência em muitas técnicas laboratoriais diversas que normalmente não são usadas em conjunto. Além disso, embora os protocolos individuais para transformação de leveduras sejam bem caracterizados para cepas de laboratório comumente usadas, a ênfase é colocada aqui em abordagens alternativas e na importância de otimizar a transformação para cepas probióticas menos bem caracterizadas. Detalhar esses métodos ajudará a facilitar a discussão sobre as melhores abordagens para testar leveduras probióticas como veículos de administração oral de medicamentos e, de fato, servirá para avançar no desenvolvimento dessa nova estratégia para terapia gastrointestinal.

A geração de uma curva de sobrevivência após a irradiação UV requer plaqueamento das células de levedura diluídas de tal modo que as unidades formadoras de colónias (CFU) distintos são capazes de formar. Cada amostra de 500 ul recolhido como descrito acima contém cerca de 5 X 10 6 células; no entanto, maior do que 100 colónias por placa são difíceis de distinguir com precisão. Plaqueamento amostra não diluída em série, bem como diluições 1:10 de células irradiadas, assim, gara...

É apresentada aqui uma descrição unificada de técnicas que podem ser utilizadas para desenvolver, transformar, administrar, e testar a expressão da proteína heteróloga dos probióticos levedura Saccharomyces boulardii.

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

O objetivo geral desses procedimentos é desenvolver uma linhagem de levedura probiótica que possa ser facilmente transformada para expressar e entregar proteínas heterólogas ao trato gastrointestinal murino. A principal vantagem dessas técnicas é que permitem a geração rápida de linhagens oxitróficas de levedura probiótica. Essas leveduras mutantes podem então ser manipuladas geneticamente sem depender da seleção por antibióticos.A administração por gavagem oral em camundongos e a coleta de placas de Peyer também permitem a verificação da aderência de leveduras mutantes aos tecidos imunes gastrointestinais. Esses métodos ajudarão a responder perguntas fundamentais na área da vacinação oral e facilitarão experimentos que testam probióticos para a entrega de terapêuticas gastrointestinais. Após o preparo do meio YPD e o crescimento das leveduras durante a noite até a saturação, dilua as células de um para dez em água em uma cubeta de plástico.Em seguida, ligue um espectrofotômetro e determine a densidade óptica da cultura de crescimento noturno. Com 20 mililitros de água destilada estéril, dilua as células até uma concentração de 10 elevado à sétima células por mililitro. Em seguida,

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um procedimento de transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10 com inflamação do cólon. Os micróbios fecais colonizados no intestino liberam metabólitos secundários, provocando a liberação de citocinas anti-inflamatórias e reduzindo a inflamação do cólon.

Avaliando os efeitos do transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10

Este vídeo mostra a administração oral de células de levedura transformadas em um modelo de camundongo. As células de levedura transformadas são administradas por via oral usando uma técnica de gavagem, atingindo o estômago do camundongo. Mais tarde, as células migram para o intestino delgado, onde as células microdobradas as engolfam e facilitam sua transferência para as placas de Peyer e obtêm acesso ao sistema imunológico intestinal.

Entrega oral de células de levedura transformadas no sistema imunológico intestinal de camundongos

Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para a administração oral de antibióticos para ratos, coleta de amostras fecais, extração de DNA e quantificação de bactérias fecais por qPCR.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

Este estudo detalha o processo de quantidades precisas de gavaging de probióticos para camundongos neonatais. A montagem experimental foi otimizada para incluir, mas não está limitada ao probiótico dosagem, métodos de administração e quantificação de bactérias no intestino.

Estudos de probiótico em camundongos neonatais usando Gavage

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

O objetivo deste protocolo é visualizar candida albicans forma celular e localização no trato gastrointestinal de mamíferos.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

A interação da suscetibilidade genética, imunidade mucosa e ambiente microecológico intestinal está envolvida na patogênese da doença inflamatória intestinal (DII). Neste estudo, aplicamos o transplante de microbiota fecal em camundongos deficientes de IL-10 e investigamos seu impacto na inflamação cólon e na função cardíaca.

Avaliação Terapêutica do Transplante de Microbiota Fecal em um Modelo de Camundongo deficiente interleucina

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer o modelo de camundongo com colite induzida por sódio com sulfato de dextrano livre de germes induzido por antibióticos para investigar o papel da microbiota intestinal na regulação dos efeitos positivos do Bacillus cereus na colite.

Investigando os efeitos aliviadores da administração de Bacillus cereus na colite por meio da modulação da microbiota intestinal

Os bacteriófagos (fagos), vírus que infectam bactérias, são um componente integral do microbioma intestinal. Embora esses habitantes simbióticos impulsionem a aptidão bacteriana e a dinâmica populacional, pouco se entende sobre como eles afetam a homeostase intestinal e a doença. Este protocolo estuda fagos isolados de T4 dentro de um modelo murino, adaptável a outros pares fago-bactérias.

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Este protocolo descreve as melhores práticas para transferência e alojamento de camundongos livres de germes em isoladores experimentais de gaiola única (isocages), mantendo condições estéreis. Métodos para transplante fecal em camundongos livres de germes e a coleta de bactérias viáveis desses camundongos "humanizados" intestinais para outras aplicações são discutidos.

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Aprenda a transformar leveduras probióticas para expressão de proteínas heterólogas em Saccharomyces boulardii sem seleção por antibióticos. Este método permite estudar adesão a tecidos gastrointestinais em camundongos.

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

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