Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

O objetivo geral deste método de imagem é estudar organelas subcelulares em um vertebrado in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular neuronal, como a dinâmica das mitocôndrias ou centrossomas em um contexto in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que todo o experimento pode ser realizado em um vertebrado intacto, sem a necessidade de nenhum procedimento cirúrgico.

Este método pode fornecer informações não apenas sobre a dinâmica subcelular sob condições fisiológicas, mas também pode ser aplicado a estudos de modelos de tese, como a doença de Alzheimer. Depois de gerar embriões que expressam transitoriamente por microinjeção ou obter embriões de linhagens transgênicas estáveis, de acordo com o protocolo de texto, no final do primeiro dia, rastreie os óvulos mortos ou não fertilizados. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira os embriões viáveis para a solução de Danieau contendo 1x PTU para evitar a formação de pigmento e mantenha os embriões na solução de Danieau contendo 1x PTU até a triagem para expressão de transgenes.

No dia do experimento de imagem, use um microscópio de dissecação de fluorescência para rastrear embriões anestesiados quanto à expressão de transgenes. Em seguida, transfira os embriões selecionados para uma placa de Petri separada contendo o tampão de Danieau com 1x PTU e 1x tricaína. Uma vez que os embriões tenham sido anestesiados, pipete suavemente alguns na agarose de baixo ponto de fusão contendo 1x PTU e 1x tricaína, transferindo o mínimo de líquido possível para evitar a diluição da agarose.

Transfira os embriões com uma pequena quantidade de agarose para uma placa de Petri com fundo de vidro. Em seguida, trabalhando relativamente rápido, use uma pinça para posicionar os embriões na orientação desejada, dependendo da estrutura a ser visualizada. Os embriões devem ser orientados adequadamente, por exemplo, planos na lateral para obter imagens da retina ou de um neurônio de Rohon-Beard.

Uma orientação precisa garantirá a melhor qualidade de imagem e otimizará a velocidade de aquisição. Depois de permitir que a agarose solidifique por pelo menos 15 minutos, adicione o tampão de Danieau com 1x PTU e 1x tricaína para cobrir os embriões. Para realizar a microscopia de campo amplo, depois de equilibrar um prato de peixes montados em uma câmara de aquecimento a 28,5 graus Celsius, no estágio de um microscópio de campo amplo e escolher uma área de interesse, abra o software do microscópio.

Em Iluminação, clique em Definições de configuração para definir os conjuntos de filtros corretos para o comprimento de onda de interesse. Em Configurações da câmera, insira o tempo de exposição necessário para adquirir uma imagem adequada. Em seguida, escolha uma objetiva de cone de imersão em água de longa distância de trabalho, variando de 40x a 100x de ampliação, que tenha a maior abertura numérica e seja corrigida cromaticamente.

Clique em Ao vivo para escolher o campo de visão. No caso de um neurônio R-B, imagem do transporte mitocondrial no axônio do tronco, emanando do corpo celular ou na árvore periférica. Em seguida, no menu ImageJ, clique no botão de seleção retangular e defina uma região de interesse, ou ROI.

E clique em ROI na janela do microgerenciador. Depois de selecionar o ROI para imagem, clique em Parar e Salvar para registrar a morfologia neuronal no canal YFP. Para obter imagens do transporte mitocondrial, clique em Aquisição Multi-D.

Em seguida, na janela chamada Aquisição multidimensional, selecione o número de pontos de tempo e o intervalo entre os pontos de tempo. Na janela Aquisição multidimensional, clique em Canais e adicione e defina o comprimento de onda da imagem e o tempo de exposição. Clique em Salvar imagens para salvar automaticamente os arquivos na pasta específica descrita na rota do diretório.

Agora, clique em Adquirir no canto superior direito para iniciar a imagem de lapso de tempo. Para microscopia confocal, depois de colocar os embriões montados em uma câmara de aquecimento a 28,5 graus Celsius no estágio confocal, abra o software do microscópio e clique em Trans Lamp ou Epi Lamp. Em seguida, através das oculares do microscópio, use luz transmitida ou fluorescente, respectivamente, para identificar a região de interesse.

Na janela de configuração Aquisição, verifique se a objetiva escolhida para geração de imagens corresponde à objetiva que aparece no menu suspenso das objetivas disponíveis. Em seguida, na janela Controle de aquisição de imagem, clique no botão da lista de corantes e selecione os fluoróforos apropriados. Como alternativa, clique no botão Caminho de luz e corantes para definir manualmente os parâmetros.

Na janela Configuração de aquisição, ajuste o fator de zoom e a taxa de proporção de tamanho da imagem digitalizada para obter o tamanho de pixel necessário para resolver melhor as estruturas que estão sendo visualizadas. Defina o tamanho do pixel para ser cerca de metade da resolução teórica da objetiva, seguindo assim os critérios de amostragem de Nyquist. Para determinar o tamanho do pixel de uma imagem adquirida, na janela Controle de aquisição de imagem, clique no botão I.

Em seguida, defina a velocidade de digitalização para a mais rápida possível. Em seguida, na janela Controle de aquisição de imagem, clique na média da linha de Kalman e defina um fator de dois ou três para reduzir o ruído. Para selecionar um modo de varredura sequencial para fluoróforos de imagem com espectros sobrepostos, clique em Sequencial e Linha.

Em seguida, ajuste a potência de saída das linhas de laser relevantes. Para varrer continuamente a região selecionada enquanto ajusta as configurações do detector para cada canal, clique em XY Repeat ou Focus x2 ou Focus x4. Em seguida, ajuste HV, Ganho e Deslocamento para cada canal para adquirir imagens que tenham a faixa dinâmica mais alta de valores de cinza.

Agora, pressione Control mais H para visualizar as imagens adquiridas por meio de uma tabela de pesquisa que identifica pixels subsaturados em azul e pixels supersaturados em vermelho, ambos os quais devem ser evitados. Reavalie a potência de saída das linhas de laser relevantes e as configurações do detector. Para definir os limites superior e inferior do volume a ser visualizado, em Configuração de aquisição, clique no botão End Set no limite superior e, em seguida, concentre-se no limite inferior e pressione Start Set.

Para verificar a resolução Z da objetiva, no Controle de Aquisição de Imagem, clique no símbolo I. Em seguida, selecione um tamanho de etapa que seja metade da resolução Z para o objetivo fornecido. Na subjanela TimeScan, insira a frequência na qual as pilhas Z devem ser adquiridas e o número de vezes que as imagens devem ser adquiridas, para configurar uma série temporal apropriada para a dinâmica da estrutura subcelular a ser visualizada.

Clique nos botões Profundidade e Tempo para confirmar que a pilha Z e a série temporal serão adquiridas. Por fim, clique no botão XY Zt para começar a adquirir imagens de lapso de tempo. Após a aquisição da imagem, na interface do software, clique em Série Concluída.

E salve as imagens no formato OIB para registrar as imagens e os metadados associados. Esta figura mostra organelas e neurônios RB localizados na superfície do embrião usando campos amplos e microscopia confocal. Aqui, a imagem de lapso de tempo em um microscópio de campo amplo foi usada para rastrear o movimento de um mitocôndrio individual na árvore periférica de um neurônio RB.

A imagem confocal é significativamente mais lenta e pode levar a uma subestimação da dinâmica de eventos subcelulares específicos. Imagens de células da retina adquiridas por microscopia de campo amplo sofrem de baixo contraste, pois os sinais fluorescentes de um grande volume de tecido obscurecem os detalhes no plano focal. Aqui, a capacidade de seccionamento óptico da microscopia confocal melhora visivelmente o contraste.

As inserções mostram detalhes de uma região da camada nuclear interna, com marcação de membranas celulares e mitocôndrias. Impulsionada pelo driver Gau-4 específico de um neurônio sensorial, a expressão em mosaico das injeções de UAS-mito-CFP e UAS MAY-FP permite o rastreamento de células individuais ao longo de dias, como visto neste neurônio sensorial RB dois e três dias após a fertilização. Além das mitocôndrias, outras organelas subcelulares, como os centrossomas, podem ser marcadas com fluorescência.

Neste exemplo, dois UAS em uma única construção contígua impulsionaram a expressão de YFP direcionado ao centrossomo e cerúleo direcionado à membrana nas células da retina. As inserções mostram uma célula na fase M. Todo esse procedimento requer vários dias desde o acasalamento, coleta de óvulos, injeções e, finalmente, imagens três ou quatro dias após a fertilização.

O experimento de imagem real no microscópio pode levar de vários minutos a um dia inteiro. Após este procedimento, outras organelas, como microtúbulos ou peroxissomos, podem ser rotuladas e visualizadas para entender sua dinâmica in vivo. Não se esqueça que a PTU é cancerígena e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.