Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

O objetivo geral deste método é melhorar a eficiência e a sensibilidade da derivatização pós-coluna de cromatografia líquida de alta eficiência, ou método PCD, por meio do uso de uma coluna de fluxo de reação. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave em áreas como ciências farmacêuticas, biomédicas e ambientais, onde são analisados compostos com baixa resposta aos detectores de HPLC. A principal vantagem dessa técnica é que não são necessárias bobinas de reação.

Como a mistura do efluente da coluna e do reagente derivatizante ocorre de forma mais eficiente do que os métodos convencionais. Este método tem sido usado para fornecer informações sobre antioxidantes, aminoácidos e fenóis. Também pode ser aplicado a outros compostos de classe, como tióis, metais, antibióticos e toxinas.

Embora toda a amostra não seja derivatizada, devido ao menor alargamento da banda, a concentração do analito dentro da corrente de fluxo do efluente é maior do que na análise convencional de derivatização pós-coluna. Para iniciar este procedimento, prepare o instrumento de HPLC com 100% de água na Linha A e 100% de metanol na Linha B como fase móvel, purgando as bombas de acordo com os requisitos do fabricante. Configure os componentes instrumentais de HPLC e a bomba de derivatização adicional.

Em seguida, defina o detector UV/VIS para analisar em um comprimento de onda de 520 nanômetros. Conecte a entrada da coluna de fluxo de reação, ou RF, ao instrumento de HPLC. Conecte uma porta periférica de saída ao detector UV/VIS usando um tubo de 15 centímetros de comprimento de 0.13 milímetros de diâmetro interno.

Em seguida, conecte a linha da bomba DPPH a uma porta periférica na saída da coluna de RF. Bloqueie a porta periférica não utilizada na saída da coluna de RF usando um batente de coluna. Conecte uma tubulação de 15 centímetros de diâmetro interno de 0.13 milímetros de comprimento à porta central de saída da coluna de RF.

Leve a vazão da bomba de HPLC a um milímetro por minuto a 100% de metanol. Em seguida, equilibre a coluna com 100% de metanol por 10 minutos. Neste ponto, prepare uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de DPPH e metanol.

Sonicar o balão que contém o reagente DPPH durante 10 minutos. Purgue a bomba DPPH com o reagente DPPH preparado de acordo com os requisitos do fabricante. Em seguida, pegue dois recipientes secos e limpos e rotule um como central e o outro como periférico

Colete o efluente que sai da porta central para o navio identificado como central "por um minuto. Depois de pesar novamente o vaso da porta central, calcule o peso do fluxo da porta central. Repita as etapas anteriores para o efluente que sai do UV/VIS que está conectado à porta periférica da coluna de RF.

Calcule o peso do vaso de porta periférica. Em seguida, calcule a porcentagem do fluxo proveniente das portas central e periférica. Repita as etapas anteriores até que a taxa de fluxo esteja correta e, em seguida, defina a vazão da bomba DPPH para 0.5 mililitros por minuto.

Uma vez terminada a corrida, interrompa o fluxo da bomba de reagente de derivatização. Remova a linha de bomba de reagente DPPH da porta periférica e pare a porta. Equilibre a coluna com a fase móvel na qual ela será armazenada, permitindo que a fase móvel passe pela coluna a um milímetro por minuto por 10 minutos.

Em seguida, pare o fluxo da bomba de fase de bolha no instrumento de HPLC. Por fim, substitua o reagente DPPH por metanol e purgue a bomba adicional. Dois cromatogramas de uma amostra de café ristretto, derivatizada com um radical DPPH usando instrumentação PCD convencional e RF-PCD, são mostrados aqui.

Os limites calculados de quantificação e detecção para cada um dos aminoácidos analisados nos modos RF-PCD e PCD convencional estão listados aqui. Um cromatograma dos quatro aminoácidos analisados usando o método PCD convencional, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é mostrado aqui. Uma comparação dos sinais obtidos para os picos devidos à glicina e leucina usando os métodos convencionais de PCD e RF-PCD é exibida aqui.

Uma comparação da largura do pico do triptofano ao analisar usando o método PCD convencional, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é mostrada aqui. Uma amostra de teste de 21 componentes que continha alguns componentes que mostram uma resposta ao esquema de derivatização e alguns que não foram separados, derivatizados e detectados. A mesma mistura também foi separada e detectada não derivatizada para comparação.

Uma comparação da forma do pico do para-Cresol, tanto derivatizado usando a coluna RF-PCD quanto não derivatizado, é mostrada aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser configurada ao mesmo tempo que a análise convencional de derivatização pós-coluna. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de estar o mais próximo possível das taxas de fluxo prescritas.

Seguindo este procedimento, outros reagentes de derivatização pós-coluna, como OPA, ninidrina ou halogênios, podem ser usados para analisar outros compostos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como configurar e ajustar uma coluna de fluxo de reação.