Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

O objetivo geral deste método é melhorar a eficiência e a sensibilidade da derivatização pós-coluna em cromatografia líquida de alta eficiência, ou método PCD, por meio do uso de uma coluna de fluxo reacional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em áreas como as ciências farmacêuticas, biomédicas e ambientais, nas quais são analisados compostos com baixa resposta aos detectores de CLAE. A principal vantagem desta técnica é que não são necessárias bobinas de reação.

Como a mistura do efluente da coluna e do reagente de derivatização ocorre de maneira mais eficiente do que pelos métodos convencionais. Este método tem sido utilizado para obter informações sobre antioxidantes, aminoácidos e fenóis. Também pode ser aplicado a outras classes de compostos, como tióis, metais, antibióticos e toxinas.

Embora toda a amostra não seja derivatizada, devido à menor alargamento de banda, a concentração do analito dentro do fluxo efluente é maior do que na análise convencional de derivatização pós-coluna. Para iniciar este procedimento, prepare o instrumento de CLAE com 100% de água na Linha A e 100% de metanol na Linha B como fase móvel, purgando as bombas conforme exigido pelo fabricante. Configure os componentes instrumentais de CLAE e a bomba adicional de derivatização.

A seguir, configure o detector UV/VIS para analisar no comprimento de onda de 520 nanômetros. Conecte a entrada da coluna de fluxo da reação, ou RF, ao instrumento de CLAE. Conecte uma porta periférica de saída ao detector UV/VIS utilizando um tubo com 15 centímetros de comprimento e diâmetro interno de 0,13 milímetro.

Em seguida, conecte a mangueira da bomba DPPH a uma porta periférica na saída da coluna RF. Bloqueie a porta periférica não utilizada na saída da coluna RF usando uma tampa de coluna. Conecte um trecho de 15 centímetros de tubo com diâmetro interno de 0,13 milímetros à porta central de saída da coluna RF.

Ajuste a vazão da bomba de CLAE para um milímetro por minuto com 100% de metanol. Em seguida, equilibre a coluna com 100% de metanol por 10 minutos. Neste momento, prepare uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de DPPH em metanol.

Sonicar o frasco contendo o reagente DPPH por 10 minutos. Purificar a bomba de DPPH com o reagente DPPH preparado conforme as exigências do fabricante. Em seguida, pegue dois recipientes secos e limpos e rotule um como "central" e o outro como "periférico". Pese com precisão os dois recipientes.

Colete o efluente que sai pela porta central no recipiente rotulado como "central" durante um minuto. Após reponderar o recipiente da porta central, calcule o peso do fluxo proveniente da porta central. Repita os passos anteriores para o efluente que sai do UV/VIS conectado à porta periférica da coluna RF.

Calcule o peso para o vaso do porto periférico. Em seguida, calcule a porcentagem do fluxo proveniente dos portos central e periféricos. Repita os passos anteriores até que a proporção de fluxo esteja correta, então ajuste a taxa de fluxo da bomba DPPH para 0,5 mililitros por minuto.

Após a conclusão da corrida, pare o fluxo da bomba do reagente de derivatização. Remova a linha da bomba do reagente DPPH do porto periférico e tampe o porto. Equilibre a coluna com a fase móvel na qual ela será armazenada, permitindo que a fase móvel passe através da coluna a uma velocidade de um milímetro por minuto durante 10 minutos.

Em seguida, interrompa o fluxo da bomba da fase com bolhas no instrumento de CLAE. Por fim, substitua o reagente DPPH por metanol e purgue a bomba adicional. Aqui são apresentados dois cromatogramas de uma amostra de café ristretto, derivatizada com um radical DPPH utilizando instrumentação PCD convencional e RF-PCD.

Os limites calculados de quantificação e detecção para cada um dos aminoácidos analisados nos modos RF-PCD e PCD convencional são listados aqui. Um cromatograma dos quatro aminoácidos analisados utilizando o método PCD convencional, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é mostrado aqui. Uma comparação dos sinais obtidos para os picos devidos à glicina e à leucina, utilizando ambos os métodos PCD convencional e RF-PCD, é exibida aqui.

Uma comparação da largura do pico do triptofano ao analisar utilizando o método convencional de PCD, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é apresentada aqui. Uma amostra-teste de 21 componentes, que continha alguns componentes que apresentam resposta ao esquema de derivatização e outros que não apresentam, foi separada, derivatizada e detectada. A mesma mistura também foi separada e detectada sem derivatização para comparação.

Uma comparação da forma do pico do p-Cresol, tanto derivatizado quanto não derivatizado, utilizando a coluna RF-PCD, é mostrada aqui. Uma vez dominada, esta técnica pode ser configurada no mesmo tempo que uma análise convencional de derivatização pós-coluna. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter-se o mais próximo possível das proporções de fluxo prescritas.

Após este procedimento, outros reagentes de derivatização pós-coluna, como OPA, ninidrina ou halogênios, podem ser utilizados para analisar outros compostos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como montar e ajustar uma coluna de reação em fluxo.