Name: Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda a derivatização pós-coluna com cromatografia líquida de alta eficiência utilizando colunas de fluxo de reação. Este método elimina bobinas de reação e melhora a sensibilidade na análise de compostos com baixa resposta em detectores HPLC.

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Este trabalho foi apoiado pela UWS e ThermoFisher Scientific. Um dos autores (DK) acusa o recebimento de um Prêmio Australiano de Pós-Graduação.

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados). Nota: Este protocolo descreve 3 métodos de fluxo de reacção de derivatização pós-coluna técnicas (RF-DCP), cada um com um reagente diferente específico para a natureza de um composto químico de interesse. Para a análise dos ROS vá para a seção &quot;1. Detecção de ROS usando DPPH •&quot;, para a análise de aminas primárias ver secção &quot;2. Detecção de aminas primárias usando fluorescamine&quot;, e para a análise de compostos fenólicos vá para a seção &quot;3 . Detecção de fenóisusando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio &quot;. Use água ultra-pura (por exemplo, água Milli-Q) por toda parte. Nota: A ligação a coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC. 1. Detecção de ROS Usando DPPH • <ol><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com 100% de água na linha A e 100% de metanol em linha B como a fase móvel. Purgar as bombas como por exigências do fabricante. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A. </li><li> Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 520 nm. </li></ol></li><li> Criação decoluna de RF <ol><li> Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférico de saída para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Ligue o DPPH • linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha B - 100% de metanol. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel de metanol a 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo deve ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação de DPPH • reagente <ol><li> Prepara-se uma solução / ml 0,1 mg de DPPH • em metanol. </li&gt; <li> Sonicar o balão contendo o DPPH • reagente durante 10 min. </li><li> Cobrir o balão em folha para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar o DPPH • bomba com o preparado DPPH • reagente como por exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustando a saída de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente de porta central e calcular o peso do caudal da ligação central, como segue: Peso de Port Central (g) = peso final de navios no porto Central (g) - peso inicial de Port Central Vessel (g) </li><li> Repita os passos 1.4.2 e 1.4.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e calcular o peso em relação ao navio porta periférica comosegue: Peso de Peripheral Porto (g) = Peso final do vaso periférico Porto (g) - peso inicial de Peripheral Porto Veículo (g) </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma: % Porto central = Peso da porta central (g) / (peso da porta central (g) + peso da porta periférica (g)) x 100 % Porta periférica = Peso da Peripheral Porto (g) / (peso de Port Central (g) + Peso do Peripheral Porto (g)) x 100 </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 30:70 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 30%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 30% de redução do comprimento da tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repetir o passo 1.4.1 a 1.4.6, até uma proporção de 30:70 de segmentação (Central: periférica) é alcançado. </li><li> Definir a taxa de fluxo do DPPH • bomba do reagente a 0,5 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com DPPH • reagente está pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, interrompa o fluxo da bomba de reagente de derivatização. </li><li> Remova o DPPH • linha de bomba do reagente a partir do porto periférica e tapar a porta. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel, em que é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento. </li><li> Substitua o DPPH • reagente com metanol e purgar a bomba adicional. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol> 2. Detecção de aminas primárias Usando fluoresamina <ol><li> Preparação da fase móvel <ol><li> Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 10 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume. </li><li> Adicionar 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) para o tampão acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95:05 (tampão: ACN). </li></ol></li><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba como por exigências do fabricante. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A. </li><li> Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para a bomba de derivação. </li><li> Defina-se o detector de fluorescência (FLD) com um comprimento de onda de excitação de 390 nm de comprimento de onda e de emissão de 475 nm. </li></ol></li><li> Criação de coluna RF <ol><li> Ligue the de entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector FLD utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Ligar a bomba de linha de derivação para um porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha A - 10 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de ACN. </li><li> Equilibrar a coluna com a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de fluorescamina <ol><li> Adicione 100 ml de uma solução a 0,1 mg mL -1 fluorescamina reagente. </li> &lt;li&gt; Sonicate durante 1 min. </li><li> Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar a bomba do reagente com o reagente fluorescamine preparado de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustando a saída de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3. </li><li> Repita os passos 2.5.2 a 2.5.3 para o efluente que sai do FLD que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4. </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5. </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e periféricofluxo é 43:57 (Central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 43%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 43%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repita o passo 2.5.1 a 2.5.6 até um rácio de segmentação das 43:57 (central: periférica) é alcançada. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de fase móvel a 0,7 ml min -1. </li><li> Defina a bomba de derivação a fluir a 0,1 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com reagente fluorescamine está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, desligue a bomba de derivação. </li><li> Remova a linha da bomba de derivação a partir do porto periférica e rolha. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel emque é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba da fase móvel. </li><li> Substitua o reagente fluorescamine com acetonitrilo e purgar a bomba de derivação. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol> 3. Detecção de fenóis utilizando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio <ol><li> Preparação da fase móvel <ol><li> Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 100 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume. </li><li> Adicionar 52,6 ml de metanol ao tampão de acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95: 5 (tampão: metanol). </li></ol></li><li> Criação de instrumento HPLC <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba de acordo com o fabricante &quot;; S exigências. </li><li> Defina-se os componentes instrumentais de HPLC e as duas bombas de reagentes adicionais, como ilustrado na Figura 4B. </li><li> Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para cada uma das bombas de reagentes. </li><li> Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 500 nm. </li></ol></li><li> Criação de coluna RF <ol><li> Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC. </li><li> Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF. </li><li> Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros. </li><li> Conectar cada reagente (isto é, 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio) A linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF. </li><li> Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% da linha A - 100 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de metanol. </li><li> Equilibrar a coluna Wom a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de 4-aminoantipireno <ol><li> Preparar um tampão de acetato de amónio com um pH de 9 seguindo a etapa 3.1.1. </li><li> Pesar 150 mg de 4-aminoantipireno e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio preparada (pH 9). </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purgar a primeira bomba do reagente com o reagente 4-aminoantipireno preparado de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de ferricianeto de potássio <ol><li> Pesar 150 mg de ferricianeto de potássio e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio (pH 9) preparados como no passo 3.1.1. </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cobrir em papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Purge a segunda bomba do reagente com o reagente de ferricianeto de potássio preparada de acordo com as exigências do fabricante. </li></ol></li><li> Ajustamento de coluna RF <ol><li> Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico. </li><li> Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min. </li><li> Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3. </li><li> Repita os passos 3.6.2 a 3.6.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4. </li><li> Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5. </li><li> Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 50:50 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 50%, diminuir oquantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros ao centro da porta de saída. Se o fluxo central estiver abaixo de 50%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central. </li><li> Repetir o passo 3.6.1 a 3.6.6, até uma proporção de 50:50 de segmentação (Central: periférica) é alcançado. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de 4-aminoantipireno a 0,5 ml min -1. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de ferricianeto de potássio a 0,25 ml min -1. Nota: A coluna RF configurado com os reagentes de dois componentes está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado. </li></ol></li><li> Pós-condições executar desligamento <ol><li> Uma vez que todas as amostras foram injetados a corrida terminou, indicando que a execução foi concluída, pare de ambas as bombas dos reagentes. </li><li> Remova as linhas de bomba de reagente a partir dos portos periféricos e substituí-los com um pedaço 15 cm de tubo 0,13 mm. </li><li> Equilibrar a coluna com a fase móvel em WHICH é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL min-1 durante 10 min. </li><li> Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento. </li><li> Substitua ambos os reagentes sobre o reagente bombas com metanol e purgar as bombas adicionais como por exigência do fabricante. Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

RF-PCD permite a mistura eficiente do reagente de derivatização com o efluente pós-coluna de HPLC, sem a utilização de bobinas de reacção, minimizando os efeitos de alargamento de banda e melhorar o desempenho da separação. métodos de RF-PCD também mostraram melhorias na resposta de sinal em relação ao método de detecção. Camenzuli et al. 28 foi o primeiro a reportar o uso de colunas de fluxo de reacção com DPPH • para a detecção de ROS em uma amostra de café espresso. O estudo envolveu a ...

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com pós-coluna de derivação (PCD) é uma poderosa ferramenta que é útil para resolver uma série de questões em laboratório analítico. Ele pode ser usado para detectar compostos que são de outra forma indetectável, com o conjunto de detectores disponíveis 1,2, aumentar o sinal do analito alvo, o que permite que os limites inferiores de detecção e quantificação 3-5 ou derivatizar selectivamente um analito alvo, a fim de evitar efeitos de matriz 6. PCD reacções comumente usados ​​incluem a reacção de aminas, tais como aminoácidos, com orto-phthaladehyde 7-9, ninidrina 9,10 ou 11,12 fluorescamina, a derivatização de espécies reactivas de oxigénio (ROS) com a 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicais DPPH (•) 13,14 ou 2,2&#39;-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) 15,16, e o uso do reagente de iodeto-azida para derivatizar enxofre ccompostos ontaining 17,18. Existem, no entanto, numerosos inconvenientes para a utilização de reacções de PCD com sistemas de HPLC 6. Principalmente entre estes é a utilização de bobinas de reacção entre o ponto de adição do reagente de derivatização (s) e o detector, que permite que o tempo para a mistura e a reacção ocorra 8. Estes laços de reacção muitas vezes têm volumes de 500 uL ou mais, o que é significativo em comparação com o volume do restante do sistema de HPLC 19. A utilização destes reacção alto volume ciclos resulta em aumento de alargamento do pico em relação ao que seria observada sem a presença do circuito de reacção. Isto resulta em picos menores, mais largas que têm limites superiores de quantificação e de detecção e resolução cromatográfica negativamente os efeitos. As Figuras 1 e 2 destacar a deterioração da forma do pico que resultam da adição de vários volumes de coluna de ansa reacção pós. esta análisefoi realizado com uma composição de fase móvel de 94% de metanol e 6% de água Milli-Q. O caudal da fase móvel foi de 1 ml / min, o volume de injecção foi de 20 pi e o comprimento de onda análise foi 265 nm. foram inseridos bobinas de diferentes volumes mortos a partir de 20 uL a 1.000 ul entre a coluna e o detector para simular os efeitos de volume morto ciclo de reacção em métodos de PCD. Estes laços foram preparados a partir de tubagem de aço inoxidável de diâmetro interno de 0,5 mm. A experiência foi realizada num sistema de HPLC consiste de um controlador (SCL-10AVP), uma pressão baixa Gradiente válvula (FCL-10ALVP), uma bomba (LC-20AD), um injector (SIL-10ADVP), e um detector de PDA ( SPD-M10ADVP). A fase móvel foi bombeada através de um desgaseificador, antes da introdução no sistema de HPLC. A separação foi efectuada utilizando um x 4,6 mm ID 5? M 250 milímetros. As condições experimentais foram escolhidas para ser típica de reacções de PCD que foram recentemente publicados na literatura. omais simples, mais comum pós configuração do reactor de coluna é denominado um reactor tubular não segmentada que é efectivamente um tubo longo, fino, através do qual o líquido pode fluir e a reacção pode ter lugar. Neste sistema de alargamento de pico é dependente não apenas o volume morto adicionado ao sistema, mas também o diâmetro interno do tubo, como realçado por Iijima et al. 8. Além disso, a geometria da bobina desempenha um papel na ampliação da marca observada. Stewart 20 indicou que enrolamento do reactor muda os perfis de fluxo secundário, o que resulta em uma melhor mistura, o que significa que o volume morto pode ser minimizada. Tem sido afirmado que o pico ampliação não é significativo quando se usa um tubo aberto malha bobina 21. Quando o alargamento do pico é excessivamente grande, outros tipos de reactores também podem ser considerados 20,22. Estes podem incluir reatores de leito ou reatores de fluxo segmentado. Estes reactores são particularmente úteis para reacções lentas que de outra forma protece grande reação laços. Como reactores tubulares não-segmentadas são os tipos mais comuns de reatores utilizados em aplicações de PCD, o resto deste artigo lida com este tipo de configuração do reator. O desenho da coluna de fluxo de reacção (RF) incorpora uma montagem final de multi-porta que permite fase móvel para sair (ou enter) a coluna, quer através de uma única porta situada na região central radial da coluna ou três portas localizadas no exterior zona da parede da coluna (ver Figura 3). Estes dois fluxos são separados usando uma montagem final contendo uma frita porosa central que está rodeada por um anel impermeável que é por sua vez rodeado por uma frita porosa externa que se estende para fora da parede da coluna. Devido ao fluxo de anel de cruzeta impermeável central não é possível entre as duas regiões porosas. Durante a cromatografia de fluxo reacção, o reagente (s) de derivatização são bombeados contra a direcção do fluxo da fase móvel em um ou TWo das portas exteriores da coluna de fluxo reacção. O eluente da coluna é misturado com o reagente (s) derivatização na frita exterior e passado para o detector por meio de uma porta exterior livre. fluxo reacção pode ser utilizada tanto para uma derivatização reagente único (uma porta para o reagente de derivatização, uma porta para passar o eluente da coluna para o detector e uma porta bloqueada) ou um sistema de reagentes dupla (2 portas para os reagentes de derivatização e uma porta de passar o eluente da coluna para o detector). O fluxo da corrente central pode ser usado para detectar o eluente da coluna não derivatizado, de forma eficaz de detecção de multiplexação 23, ou passado para o lixo. Uma técnica importante de sintonização que é disponível quando executado cromatografia RF-PCD é a razão entre os fluxos de centrais e periféricos. A razão óptima para cada derivação depende de um número de factores tais como se o fluxo central irá ser detectado ou passado para o lixo. Por conseguinte, uma vez que a razão óptima foi determinada, Deve garantir-se que o rácio fluxo correto é alcançado antes de cada corrida a ser realizada. Verificou-se que a utilização de uma frita para misturar o fluxo de eluente de coluna e o reagente de derivatização em RF-PCD resulta em uma mistura mais eficiente em comparação com técnicas de mistura tradicionais que empregam tipicamente uma peça em T volume morto zero ou de baixo volume morto W- peça de misturar as duas correntes. Isto permitiu a utilização de relativamente pequenas laçadas de reacção, ou mesmo a eliminação da laçada de reacção completamente. A redução dos resultados de reacção de tamanho de malha em mais nítidas picos em comparação com métodos tradicionais de derivatização pós-coluna. Isto significa que, apesar do facto de nem todo o eluente da coluna é derivatizado, maior sinal para relações de ruído são observados e, portanto, os limites inferiores de detecção e de quantificação pode ser conseguida. cromatografia de fluxo reacção foi desenvolvido para ultrapassar as dificuldades com a adaptação de reacção PCDs a colunas de HPLC modernos sistemas e, em particular a perda de eficiência causada por banda alargando devido a volumes mortos pós-coluna grandes causadas pela necessidade de empregar um grande volume de reacção de laços. Os processos de mistura mais eficientes na FR-PCD em comparação com PCD convencional significa que os volumes de ansa de reacção mais pequenas podem ser empregues levando a um aumento na eficiência de separação observada. Além disso cromatografia RF-PCD mostra tanto o aumento do sinal e ruído diminuiu em comparação com técnicas convencionais de PCD, resultando em limites inferiores de detecção e quantificação, em comparação com os métodos convencionais de PCD. Uma vantagem adicional de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é a capacidade de controlar o fluxo não derivatizado, que elui a partir da porta central da coluna de RF, assim como o fluxo de derivatizado que elui a partir da região periférica da coluna. RF-PCD é uma técnica relativamente nova, mas promissora que apresenta muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais de PCD. <p class="jove_content"&gt; Conexão da coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC.

<table><tbody><tr><td>Instrumento para HPLC</td><td></td><td>Agilent Série 1290 HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Bomba(s) adicional(is) para sistema de derivatização</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td> Tubulação <td>PEEK não comercial</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Rolhas de</td><td></td><td></td> coluna <td>Fornecido com</td></tr><tr><td>cortador de tubo PEEK</td><td>de coluna Sigma Balança Analítica</td><td>Aldrich Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Balança</td><td></td><td></td><td>Balança analítica de 4 pontos</td></tr><tr><td>Cronômetro</td><td></td><td></td><td>Equipamento não científico</td></tr><tr><td>Frascos de coleta de</td><td></td><td></td> eluentes <td>Qualquer frasco pequeno com fundo plano serve, e.g., frascos de HPLC Frascos</td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td> HPLC <td>Dependerá do instrumento usado</td></tr><tr><td>Recipientes para fase móvel e solução(ões) de derivatizaçãoSigma</td> <td>Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory vidraria</td><td></td><td></td><td>Frascos volumétricos, pipetas, etc. A quantidade e os volumes dependerão do método de preparação da amostra.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D9132</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Amônia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td> corrosiva <td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4- aminoantipireno&nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio&nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

pós coluna a derivação utilizando a reação fluxo cromatografia líquida de alta colunas

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado. Uma grande dificuldade na adaptação do PCD aos sistemas e colunas de HPLC modernos é a necessidade de bobinas de reação de grande volume que permitam a mistura de reagentes e, em seguida, a reação de derivatização. Esse grande volume morto da coluna de postes leva ao alargamento da banda, o que resulta em uma perda da eficiência de separação observada e, de fato, na detecção de sensibilidade. Na derivatização pós-coluna de fluxo de reação (RF-PCD), o(s) reagente(s) de derivatização é(são) bombeado(s) contra o fluxo da fase móvel para uma ou duas das portas externas da coluna de fluxo de reação, onde é misturado com o efluente da coluna dentro de uma frita alojada dentro do encaixe final da coluna. Essa técnica permite uma mistura mais eficiente do efluente da coluna e do(s) reagente(s) de derivatização, o que significa que o volume dos loops de reação pode ser minimizado ou mesmo eliminado completamente. Verificou-se que os métodos RF-PCD têm um desempenho melhor do que os métodos convencionais de PCD em termos de eficiência de separação observada e relação sinal-ruído. Outra vantagem das técnicas de RF-PCD é a capacidade de monitorar o efluente proveniente da porta central em seu estado não derivado. O RF-PCD foi atualmente testado em uma gama relativamente pequena de reações pós-coluna, no entanto, atualmente não há razão para sugerir que o RF-PCD não possa ser adaptado a qualquer reação de derivatização pós-coluna existente de um ou dois componentes (desde que ambos os reagentes sejam adicionados ao mesmo tempo).

O primeiro método de PCD que foi adaptado para utilização por RF-CPD foi a derivatização de antioxidantes, utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacção foi introduzido por Koleva et al. 25, e tem sido amplamente utilizada desde então. A detecção se baseia na descoloração do radical DPPH • na presença de espécies de oxigénio reactivas, portanto, a presença de antioxidantes resulta numa queda na absorvância observada. O DPPH • r...

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

O objetivo geral deste método é melhorar a eficiência e a sensibilidade da derivatização pós-coluna em cromatografia líquida de alta eficiência, ou método PCD, por meio do uso de uma coluna de fluxo reacional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em áreas como as ciências farmacêuticas, biomédicas e ambientais, nas quais são analisados compostos com baixa resposta aos detectores de CLAE. A principal vantagem desta técnica é que não são necessárias bobinas de reação.Como a mistura do efluente da coluna e do reagente de derivatização ocorre de maneira mais eficiente do que pelos métodos convencionais. Este método tem sido utilizado para obter informações sobre antioxidantes, aminoácidos e fenóis. Também pode ser aplicado a outras classes de compostos, como tióis, metais, antibióticos e toxinas.Embora toda a amostra não seja derivatizada, devido à menor alargamento de banda, a concentração do analito dentro do fluxo efluente é maior do que na análise convencional de derivatização pós-coluna. Para iniciar este procedimento, prepare o instrumento de CLAE com 100% de água na Linha A e 100% de metanol na Linha B como fase móvel, purgando as bombas conforme exigido pelo fabricante. Configure os componentes instrumentais de CLAE e a bomba adicional de derivatização.A seguir, configure o detector UV/VIS para analisar no comprimento de onda de 520 nanômetros. Conecte a entrada da coluna de fluxo da reação, ou RF, ao instrumento de CLAE. Conecte uma porta periférica de saída ao detector UV/VIS utilizando um tubo com 15 centímetros de comprimento e diâmetro interno de 0,13 milímetro.Em seguida, conecte a mangueira da bomba DPPH a uma porta periférica na saída da coluna RF. Bloqueie a porta periférica não utilizada na saída da coluna RF usando uma tampa de coluna. Conecte um trecho de 15 centímetros de tubo com diâmetro interno de 0,13 milímetros à porta central de saída da coluna RF.Ajuste a vazão da bomba de CLAE para um milímetro por minuto com 100% de metanol. Em seguida, equilibre a coluna com 100% de metanol por 10 minutos. Neste momento, prepare uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de DPPH em metanol.Sonicar o frasco contendo o reagente DPPH por 10 minutos. Purificar a bomba de DPPH com o reagente DPPH preparado conforme as exigências do fabricante. Em seguida, pegue dois recipientes secos e limpos e rotule um como "central" e o outro como "periférico". Pese com precisão os dois recipientes.Colete o efluente que sai pela porta central no recipiente rotulado como "central" durante um minuto. Após reponderar o recipiente da porta central, calcule o peso do fluxo proveniente da porta central. Repita os passos anteriores para o efluente que sai do UV/VIS conectado à porta periférica da coluna RF.Calcule o peso para o vaso do porto periférico. Em seguida, calcule a porcentagem do fluxo proveniente dos portos central e periféricos. Repita os passos anteriores até que a proporção de fluxo esteja correta, então ajuste a taxa de fluxo da bomba DPPH para 0,5 mililitros por minuto.Após a conclusão da corrida, pare o fluxo da bomba do reagente de derivatização. Remova a linha da bomba do reagente DPPH do porto periférico e tampe o porto. Equilibre a coluna com a fase móvel na qual ela será armazenada, permitindo que a fase móvel passe através da coluna a uma velocidade de um milímetro por minuto durante 10 minutos.Em seguida, interrompa o fluxo da bomba da fase com bolhas no instrumento de CLAE. Por fim, substitua o reagente DPPH por metanol e purgue a bomba adicional. Aqui são apresentados dois cromatogramas de uma amostra de café ristretto, derivatizada com um radical DPPH utilizando instrumentação PCD convencional e RF-PCD.Os limites calculados de quantificação e detecção para cada um dos aminoácidos analisados nos modos RF-PCD e PCD convencional são listados aqui. Um cromatograma dos quatro aminoácidos analisados utilizando o método PCD convencional, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é mostrado aqui. Uma comparação dos sinais obtidos para os picos devidos à glicina e à leucina, utilizando ambos os métodos PCD convencional e RF-PCD, é exibida aqui.Uma comparação da largura do pico do triptofano ao analisar utilizando o método convencional de PCD, o método RF-PCD e o fluxo não derivatizado do método RF-PCD é apresentada aqui. Uma amostra-teste de 21 componentes, que continha alguns componentes que apresentam resposta ao esquema de derivatização e outros que não apresentam, foi separada, derivatizada e detectada. A mesma mistura também foi separada e detectada sem derivatização para comparação.Uma comparação da forma do pico do p-Cresol, tanto derivatizado quanto não derivatizado, utilizando a coluna RF-PCD, é mostrada aqui. Uma vez dominada, esta técnica pode ser configurada no mesmo tempo que uma análise convencional de derivatização pós-coluna. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter-se o mais próximo possível das proporções de fluxo prescritas.Após este procedimento, outros reagentes de derivatização pós-coluna, como OPA, ninidrina ou halogênios, podem ser utilizados para analisar outros compostos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como montar e ajustar uma coluna de reação em fluxo.

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

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