Name: Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a fabricar superfícies nanoestruturadas termorresponsivas pelo método Langmuir-Schaefer para engenharia de tecidos. Este protocolo permite controlar a adesão e desprendimento celular por temperatura.

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Este estudo foi apoiado financeiramente pelo Projeto de Desenvolvimento de Sistemas de Inovação "Cell Sheet Tissue Engineering Center" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão.

1. Síntese de poli bloco Polystyrene- (N -isopropylacrylamide) por duas etapas reversível adição-fragmentação cadeia de transferência (RAFT) polimerização por radicais <ol><li> Dissolve-se estireno (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) ácido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmol), e 4,4&#39;-azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACVA; 0,04 mmol) em 40 ml de 1, 4-dioxano. Congelar a solução em azoto líquido sob vácuo durante 15-20 min para remover as espécies reactivas e gradualmente descongelar à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução é completamente descongelado e repetir este freeze-bomba de degelo ciclo de desgaseificação três vezes. </li><li> Obter o poliestireno (PSt) (PM: 13.500) como um agente RAFT macro de polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo. </li><li> Precipitado PSt agente macro balsa com 800 ml de éter e seco em vácuo. </li><li> Dissolver IPAAM monómero (4,32 mmol), PSt agente RAFT macro (0,022 mmol), e ACVA (0,004 mmol) em 4 ml de 1,4-dioxano. </li><li> Removero oxigénio na solução pelos ciclos de desgaseificação congelamento-descongelamento-bomba tal como mencionado no passo 1.1. </li><li> Executar uma polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo depois de desgaseificação. Obter molécula sintetizada St-IPAAM (PM: 32.800), da mesma maneira como o agente de macro RAFT PST. </li></ol> 2. Preparação de substratos de vidro silanada hidrofóbica Modificados <ol><li> Lavar substratos de vidro (24 mm x 50 mm) com um excesso de acetona e etanol e sonicado durante 5 min para remover os contaminantes da superfície. </li><li> Secam-se os substratos num forno a 65 ° C durante 30 min. Em seguida, usar plasma de oxigénio (400 W, 3 minutos) para activar as superfícies dos substratos à TA. </li><li> Mergulhar os substratos em tolueno contendo 1% hexyltrimethoxysilane durante a noite a RT para silanizar o substrato. </li><li> Lavar os substratos silanizadas em tolueno e mergulhe em acetona durante 30 min para remover os agentes que não reagiram. </li><li> substratos recozimento durante 2 horas a 110 ° C para imobilizar completamente o Sseu rosto. </li><li> Corte os substratos silanizadas por um cortador de vidro de 25 mm x 24 mm para caber os pratos de cultura de células (tamanho prato: φ35 mm). </li></ol> 3. Preparação de Langmuir Films ea superfície transferida-Film <ol><li> Colocar o aparelho de Langmuir película num gabinete para evitar a acumulação de poeiras. </li><li> Lava-se a calha de Langmuir (tamanho: 580 milímetros x 145 mm) e as barreiras com água destilada e etanol, para remover contaminantes. </li><li> Seque o cocho e barreiras, limpando com uma toalha sem fiapos. Em seguida, preencher a calha com aproximadamente 110 ml de água destilada, e ajustar as barreiras de ambos os lados da calha. Note-se que a água destilada devem ser adicionados sem que se prolonga nos seguintes passos 3,5-3,13. </li><li> Aquece-se uma placa de Wilhelmy platina (perímetro: 39,24 milímetros) para a monitorização da tensão de superfície com um queimador de gás até que a placa torna-se vermelha e, em seguida, lava-se com água destilada para remover os contaminantes. Suspender a placa de Wilhelmy em um fio ligado ao instrumento da superfície à pressão medida. </li><li> Zerar o instrumento-surface-medição de pressão de acordo com o protocolo do fabricante. Comprimir a interface ar-água na calha por as barreiras em ambos os lados da calha até que a interface atinge cerca de 50 cm 2, sem quaisquer gotas de polímero. </li><li> Aspirar pequenos contaminantes até que a pressão de superfície é cerca de 0 mN / m. </li><li> Reposicionar as barreiras de ambos os lados, e adicionar água destilada para compensar a diminuição de água destilada a partir do passo 3.6. </li><li> Dissolve-se 5 mg de a molécula de St-IPAAM sintetizado em 5 ml de uma solução de desenvolvimento de clorofórmio. Nota: diclorometano ou tolueno, também podem ser usados ​​como o solvente. </li><li> Gentilmente queda de 27 ul de St-IPAAM dissolvidos em clorofórmio para a calha utilizando uma micro ou micropipeta. </li><li> Após uma espera de 5 minutos para permitir a evaporação completa de clorofórmio, mover as duas barreiras horizontalmente para comprimir o molecu St-IPAAMle na interface. Manter a taxa de compressão das barreiras a 0,5 mm / seg, até a área de alvo de 50 cm 2 é alcançado. Nota: A taxa de compressão rápida provoca defeitos no filme de Langmuir. </li><li> Medir a pressão de superfície (π) -A m isotérmicas com a platina placa de Wilhelmy anexada ao instrumento-surface-medição de pressão durante a compressão de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Depois de atingir o tamanho da área de alvo, manter a superfície durante 5 min para permitir que as moléculas de St-IPAAM para relaxar; as moléculas não atingem o equilíbrio imediatamente após a compressão. </li><li> Transferir o filme de Langmuir para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado usando um aparelho de transferência durante 5 minutos para adsorver robustamente o filme. Fixar o substrato de vidro hidrofóbicas em paralelo no dispositivo. Conecte o dispositivo a uma fase de alinhamento e mover-se perpendicularmente. </li><li> Levantar o substrato horizontalmente com o aparelho de transferência e seco durante 1 dia num desiccator. </li></ol> 4. a cultura de células e Otimização de adesão celular e destacamento na superfície Transferido Langmuir Film <ol><li> Para preparar as suspensões de células, células endoteliais de cultura bovina da artéria carótida (BAECs) a um terço confluência a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de ar em polistireno para cultura de tecidos (TCPS), com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 10% de fetal de soro de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina. </li><li> Após confluência é atingido, tratar BAECs com 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de ar. </li><li> Desactivar a tripsina-EDTA, adicionando 10 ml de DMEM contendo FBS a 10%, e recolher a suspensão de células para um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 120 xg durante 5 min, e o sobrenadante aspirado. Re-suspender as células com 10 ml de DMEM. </li><li> Coloque as superfícies St-IPAAM sob luz ultravioleta sobre uma bancada limpa para esterilizar por 5 min. </li><li> Semear o ce recuperadolls sobre o St-IPAAM superfícies a uma concentração de 1,0 x 10 4 células / cm2 contados por um hemocitómetro descartável e observar as células sobre as superfícies de um microscópio equipado com uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% ar. Nota: Esterilizar as superfícies St-IPAAM por luz ultravioleta equipado para uma bancada limpa. </li><li> Gravação de imagens de lapso de tempo de BAECs aderentes para cerca de 24,5 horas a 37 ° C por um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x. Após BAEC adesão, ficha descolamento das BAECs da superfície de St-IPAAM a 20 ° C durante cerca de 3,5 h. </li></ol> Fabricação de chapas 5. celular nas superfícies Langmuir Film-transferidos <ol><li> BAECs cultura utilizados da mesma maneira descrita na Secção 4. </li><li> Semente um total de 1,0 x 10 5 células / cm2 em superfícies St-IPAAM e incubar durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Confluente BAECs espontaneamente isolada a 20 ° C.</li>
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Todos os autores contribuíram igualmente para a redação do manuscrito e aprovaram a versão final. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma superfície termicamente reativo foi fabricado pelo método de Langmuir-Schaefer, e as propriedades de superfície para adesão celular / descolamento e a folha de célula de recuperação foram optimizados. Ao utilizar este método para a fabricação de superfícies, vários passos são críticos. A composição molecular das moléculas de St-IPAAM tem um grande efeito sobre a estrutura da superfície e a estabilidade da superfície, e, por extensão, a adesão celular e descolamento. Em particular, as moléculas de St-IPAAM deve ter u...

superfícies nanoestruturados têm atraído recentemente a atenção substancial devido às suas várias aplicações potenciais, incluindo padronização, cultura de células, limpeza, e comutação de superfície. Por exemplo, as superfícies hidrofóbicas inspirados na nanoestrutura da folha de lótus e outras superfícies sensíveis são capazes de reagir a estímulos externos 1-4. O filme de Langmuir é um dos revestimentos de polímero mais amplamente estudados. Um filme de Langmuir é formada por moléculas anfifílicas deixando cair sobre uma interface ar-água 08/05. A película pode então ser transferida para uma superfície sólida por adsorção física ou química, e a conformação molecular sobre uma superfície sólida pode ser controlada usando métodos de transferência verticais e horizontais 9-12. A densidade do filme de Langmuir podem ser regulados com precisão por compressão da interface ar-água. Recentemente, este método também tem se mostrado eficaz para a fabricação nanométricos structur-ilha do marES, utilizando copolímeros de bloco anfifílicos. As nanoestruturas são considerados para consistir de um núcleo de segmentos hidrófobos e uma concha de segmentos hidrofílicos 13-17. Além disso, o número de nanoestruturas sobre uma superfície é regulada, controlando a área por molécula de (A m) do copolímero de bloco na interface. Nós nos concentramos em um original, abordagem de engenharia de tecido sem andaime única, engenharia camada de células, usando uma superfície de cultura termicamente reativo. A tecnologia desenvolvida foi aplicada a terapias de regeneração para vários órgãos 18. Uma superfície de cultura de temperatura-sensível foi fabricado por enxerto de poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), uma molécula de temperatura-sensível, para uma superfície de 19-27. PIPAAm e seus copolímeros exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), em meio aquoso, a temperaturas próximas de 32 ° C. A superfície da cultura também exibiu uma temperatura alternati-responsivo<html> em entre hidrofobicidade e hidrofilicidade. A 37 ° C, a superfície tornou-se PIPAAm-enxertado hidrofóbico, e as células proliferaram rapidamente ligados e sobre a superfície, bem como sobre poliestireno de cultura de tecidos convencional. Quando a temperatura foi baixada para 20 ° C, a superfície tornou-se hidrófila, e células espontaneamente isolada a partir da superfície. Portanto, células confluentes cultivadas na superfície poderia ser colhida como uma folha intacta, alterando a temperatura. Estas propriedades de adesão celular e descolamento também foram exibidos por uma superfície fabricada por revestimento de película Langmuir para o laboratório de demonstração 26, 27. Um filme de Langmuir de copolímeros em bloco composto por poliestireno (P (St)) e PIPAAm (St-IPAAM) foi fabricada. O filme de Langmuir com uma específica Um m poderia ser horizontalmente transferidos para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado. Além disso, foram avaliadas a adesão celular ligado e desprendimento da superfície preparada em resposta à temperatura. _content &quot;&gt; Aqui, nós descrevemos protocolos para a fabricação de uma película de Langmuir nanoestruturada composto de copolímeros em bloco anfifílicos termo-sensível sobre um substrato de vidro. O método pode fornecer uma técnica de fabricação eficaz para nanofilmes orgânicos em vários campos da ciência superfície e podem facilitar mais controlo eficaz da adesão celular e descolamento em espontânea a partir de uma superfície.

<table><tbody><tr><td>N-isopropilacrilamida</td><td>Kohjin</td><td></td><td>Sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Azobis(ácido 4-cianovalérico)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>Estireno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-trioxano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxano</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Sigma&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nakarai</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Japão Bioserum</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td> Banco <td>de Recursos de Pesquisa em Ciências da Saúde</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>Vidros de cobertura</td><td>Indústria de vidro de Matsunami</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Calhas</td> de Deposição Tosoh <td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium através</td></tr> Nikon <tr><td>ECLIPSE TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de thermoresponsive nanoestruturados surfaces para engenharia de tecidos

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Superfícies termorresponsivas poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) imobilizadas para controle da adesão e descolamento celular foram fabricadas pelo método de Langmuir-Schaefer. Copolímeros em bloco anfifílicos compostos de poliestireno e PIPAAm (St-IPAAms) foram sintetizados por polimerização radical reversível por transferência em cadeia de fragmentação por adição (RAFT). Uma solução de clorofórmio de moléculas de St-IPAAm foi gentilmente colocada em um aparelho de calha de Langmuir, e ambas as barreiras do aparelho foram movidas horizontalmente para comprimir o filme para regular sua densidade. Em seguida, o filme St-IPAAm Langmuir foi transferido horizontalmente para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado por um dispositivo fixado na superfície. As imagens de microscopia de força atômica revelaram claramente estruturas de ilhas marinhas em nanoescala na superfície. A força, a taxa e a qualidade da adesão e descolamento celular na superfície preparada foram moduladas por mudanças na temperatura na faixa de temperatura da solução crítica inferior das moléculas de PIPAAm. Além disso, uma estrutura celular bidimensional (folha celular) foi recuperada com sucesso nas superfícies otimizadas. Essas superfícies PIPAAm exclusivas podem ser úteis para controlar a força de adesão e descolamento celular.

Os copolímeros em bloco compostos por poliestireno e poli (-isopropylacrylamide N) (St-IPAAms) com pesos moleculares específicos foram sintetizados por polimerização de radicais TRAF. ECT foi preparado como um agente de transferência de cadeia como descrito no Moad et ai. 28. Duas moléculas de St-IPAAM de diferentes comprimentos de cadeia PIPAAm foram sintetizados, e os polímeros em bloco obtidos foram caracterizados por 1H ressonância magnética nu...

Superfícies de ilhas marinhas nanoescalonadas compostas de copolímeros em bloco termorresponsivos foram fabricadas pelo método de Langmuir-Schaefer para controlar a adesão e o desprendimento espontâneo de células. Tanto a preparação da superfície quanto a adesão e descolamento das células na superfície foram visualizadas.

Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

O objetivo geral deste método Langmuir-Schaefer com copolímeros em bloco é fabricar folhas celulares em diversas condições da superfície com resposta à temperatura, controlando a intensidade da adesão e fixação celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biomateriais, como materiais biocompatíveis, superfície para cultivo celular e biosseparação. A principal vantagem desta técnica é que a interação entre a superfície com resposta à temperatura e as células pode ser controlada, e as condições de modificação para recuperação da folha celular podem ser otimizadas.Embora este método possa fornecer informações sobre a interação entre célula e superfície, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como bioseparação e biofilmes. Para começar, dissolva estireno, ECT e ACVA em 40 mililitros de 1,4-Dioxano. Congele a solução em nitrogênio líquido sob vácuo por 15 a 20 minutos para remover as espécies reativas.Após descongelar gradualmente a solução em temperatura ambiente, repita este ciclo de congelamento, bombeamento, descongelamento e desgaseificação três vezes. Obtenha o agente macro-RAFT de poliestireno por polimerização a 70 graus Celsius durante

preparation-thermoresponsive-nanostructured-surfaces-for-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar.  Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Substratos de cultura de células funcionalizados com padrões em microescala de ligantes biológicos têm imensa utilidade no campo da engenharia de tecidos. Aqui, demonstramos a fabricação versátil e automatizada de substratos de cultura de tecidos com várias escovas de poli (etilenoglicol) micropadronizadas apresentando químicas ortogonais que permitem a imobilização espacialmente precisa e específica do local de ligantes biológicos.

Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Os protocolos são descritos para a fabricação de hidrogel degradáveis thermoresponsive baseado no hidrazona cross-linking de oligômeros polímeros na escala a granel, microescala e escala nanométrica, último para preparação do gel de nanopartículas e nanofibras.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

Um protocolo para produzir uma grande área de substrato nanopadronizado a partir de pequenos moldes nanopadronizados para estudo da modulação nanotopográfica do comportamento celular é apresentado.

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

O presente protocolo descreve ferramentas para o manuseio de microeletroletos intracorticais planar de silício durante os tratamentos para modificação superficial via deposição de gás e reações de soluções aquosas. A montagem dos componentes utilizados para manusear os dispositivos durante todo o procedimento é explicada detalhadamente.

Ferramentas para tratamento superficial de microeletroletos intracorticais planar de silício

Aprenda a fabricar superfícies nanoestruturadas termorresponsivas pelo método Langmuir-Schaefer para engenharia de tecidos. Este protocolo permite controlar a adesão e desprendimento celular por temperatura.

Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

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