Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste método Langmuir-Schaefer com copolímeros em bloco é fabricar folhas celulares em diversas condições da superfície com resposta à temperatura, controlando a intensidade da adesão e fixação celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biomateriais, como materiais biocompatíveis, superfície para cultivo celular e biosseparação. A principal vantagem desta técnica é que a interação entre a superfície com resposta à temperatura e as células pode ser controlada, e as condições de modificação para recuperação da folha celular podem ser otimizadas.

Embora este método possa fornecer informações sobre a interação entre célula e superfície, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como bioseparação e biofilmes. Para começar, dissolva estireno, ECT e ACVA em 40 mililitros de 1,4-Dioxano. Congele a solução em nitrogênio líquido sob vácuo por 15 a 20 minutos para remover as espécies reativas.

Após descongelar gradualmente a solução em temperatura ambiente, repita este ciclo de congelamento, bombeamento, descongelamento e desgaseificação três vezes. Obtenha o agente macro-RAFT de poliestireno por polimerização a 70 graus Celsius durante 15 horas em banho de óleo. Precipite o agente macro-RAFT de poliestireno com 800 mililitros de éter e seque a vácuo.

Em seguida, dissolva o monômero IPAAm, o agente macro-RAFT de poliestireno e o ACVA em quatro mililitros de 1,4-Dioxano. Remova o oxigênio da solução utilizando ciclos de desgaseificação por congelamento, bombeamento e descongelamento, como anteriormente. Realize uma polimerização a 70 graus Celsius por 15 horas em um banho de óleo após a desgaseificação.

Finalmente, obtenha a molécula de St-IPAAm sintetizada da mesma maneira que o agente macro-RAFT de poliestireno. Lave os substratos de vidro com excesso de acetona e etanol, e sonique por cinco minutos para remover contaminantes da superfície. Seque os substratos em estufa a 65 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, utilize plasma de oxigênio para ativar as superfícies dos substratos à temperatura ambiente. Mergulhe os substratos em tolueno contendo 1% de hexatrimetoxissilano durante a noite, à temperatura ambiente, para silanizar o substrato. Em seguida, lave os substratos silanizados em tolueno e mergulhe em acetona por 30 minutos para remover os agentes não reagidos.

Realize a anelação dos substratos por duas horas a 110 graus Celsius para imobilizar completamente a superfície. Por fim, corte os substratos silanizados com um cortador de vidro em dimensões de 25 milímetros por 24 milímetros para se ajustarem às placas de cultura celular. Coloque o instrumento de filme de Langmuir dentro de um gabinete para evitar o acúmulo de poeira.

Lave o recipiente de Langmuir e as barreiras com água destilada e etanol para remover os contaminantes. Seque o recipiente e as barreiras limpando com um pano sem fiapos. Em seguida, preencha o recipiente com aproximadamente 110 mililitros de água destilada e posicione as barreiras em ambos os lados do recipiente.

Em seguida, aqueça uma placa de platina de Wilhelmy para monitoramento da tensão superficial com um maçarico de gás até que a placa fique vermelha. Em seguida, lave a placa com água destilada para remover os contaminantes. Suspenda a placa de Wilhelmy em um fio preso ao instrumento de medição da pressão superficial.

Zere o instrumento de medição da pressão superficial de acordo com o protocolo do fabricante. Comprima a interface ar-água na cuba por meio das barreiras em ambos os lados da cuba até que a interface atinja aproximadamente 50 centímetros quadrados, sem gotas de polímero. Aspire quaisquer pequenas impurezas até que a pressão superficial seja quase zero milinewtons por metro.

Reposicione as barreiras em ambos os lados e adicione água destilada para compensar a diminuição de água destilada. Em seguida, dissolva cinco miligramas da molécula de St-IPAAm sintetizada em cinco mililitros de uma solução de desenvolvimento de clorofórmio. Depois, adicione cuidadosamente 27 microlitros de St-IPAAm dissolvido em clorofórmio na cuba, utilizando uma microseringa ou micropipeta.

Após aguardar cinco minutos para permitir a completa evaporação do clorofórmio, mova horizontalmente ambas as barreiras para comprimir a molécula de St-IPAAm na superfície. Mantenha a taxa de compressão das barreiras em 0,5 milímetros por segundo até que a área-alvo de 50 centímetros quadrados seja alcançada. Meça as isotermas de pressão superficial Pi-A com a placa de platina de Wilhelmy acoplada ao instrumento de medição de pressão superficial durante a compressão, de acordo com o protocolo do fabricante.

Após atingir o tamanho da área-alvo, mantenha a superfície por cinco minutos para permitir o relaxamento das moléculas de St-IPAAm. As moléculas não atingem o equilíbrio imediatamente após a compressão. Em seguida, transfira o filme de Langmuir para um substrato de vidro modificada hidrofobicamente utilizando um aparato de transferência por cinco minutos para absorver firmemente o filme.

Fixe o substrato de vidro hidrofóbico em paralelo no dispositivo. Conecte o dispositivo a uma plataforma de alinhamento e mova perpendicularmente. Levante o substrato horizontalmente com o aparelho de transferência e seque por um dia em um dessecador.

Para preparar suspensões celulares, cultive células endoteliais da artéria carótida bovina, ou BAECs, até 1/3 de confluência a 37 graus Celsius em 5%CO2 e 95%ar, sobre poliestireno para cultura celular com DMEM, contendo FBS e penicilina. Após atingir a confluência, trate as BAECs com três mililitros de tripsina 0,25% EDTA por três minutos a 37 graus Celsius em 5%CO2 e 95%ar. Inative a tripsina EDTA adicionando 10 mililitros de DMEM contendo 10%FBS.

E colete a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mililitros. Após centrifugar a 120 vezes g por cinco minutos, aspire o sobrenadante e resuspenda as células em 10 mililitros de DMEM. Semee as células recuperadas em superfícies de St-IPAAm numa concentração de 10.000 células por centímetro quadrado, contadas por meio de um hemocitômetro descartável.

Observe as células nas superfícies por meio de um microscópio equipado com incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO2 e 95% de ar. Em seguida, esterilize as superfícies de St-IPAAm com luz ultravioleta acoplada a uma bancada de fluxo laminar. Registre imagens em lapso de tempo de BAECs aderidas por aproximadamente 24,5 horas a 37 graus Celsius por meio de um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x.

Após a adesão das BAEC, registre a dessanexação das BAECs da superfície de St-IPAAm a 20 graus Celsius durante aproximadamente 3,5 horas. Após a otimização da adesão e dessanexação celulares na superfície com filme de Langmuir transferido, produza as folhas celulares primeiramente cultivando as BAECs como anteriormente. Semee um total de 100.000 células por centímetro quadrado em superfícies de St-IPAAm.

E incubar durante três dias a 37 graus Celsius em 5% de CO₂. As BAECs confluentes destacaram-se espontaneamente a 20 graus Celsius. A preparação de uma superfície transferida com filme de Langmuir responsivo à temperatura é mostrada aqui.

A solução de St-IPAAm em clorofórmio foi cuidadosamente depositada sobre uma interface ar-água. Duas barreiras foram utilizadas para comprimir as moléculas de St-IPAAm na interface até que uma área-alvo de 50 centímetros quadrados fosse alcançada. A pressão superficial foi medida durante a compressão para detectar eventuais defeitos no filme de Langmuir.

Após a compressão, um substrato de lamínula modificado hidrofobicamente foi colocado horizontalmente sobre a interface com uma plataforma de alinhamento. O substrato foi levantado horizontalmente e secado por um dia. Após esta etapa, as superfícies de St-IPAAm estavam prontas para uso em experimentos de cultura celular.

Resultados representativos de imagens topográficas de microscopia de força atômica de superfícies St-IPAAm são mostrados aqui. Nanoestruturas foram observadas em ambas as superfícies de St-IPAAm. O tamanho e a forma das nanoestruturas eram fortemente dependentes do AM e da composição de St-IPAAm.

Aqui, é apresentada uma imagem macroscópica de uma lâmina celular recuperada sobre uma superfície com filme de Langmuir transferido contendo St-IPAAm 480 e uma AM de 40 nanômetros quadrados por molécula. As células atingiram confluência após três dias de cultivo nas superfícies St-IPAAm 170 e St-IPAAm 480 a 37 graus Celsius. E a lâmina celular foi rapidamente recuperada após redução da temperatura de 37 para 20 graus Celsius.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar e projetar a composição molecular de polímeros, fabricar e transferir filmes de Langmuir, controlar a adesão e a dessensibilização celular e recuperar lâminas celulares. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de biomateriais e engenharia de tecidos explorarem as interações entre células e superfícies, bem como estratégias de cultivo celular para uso em medicina regenerativa. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia de transplante celular, pois ela possui potencial para fabricar lâminas celulares de diversos tipos celulares, obtidos de pacientes.